DB5306T 78-2022 半夏组培快繁技术规程

ICS65.020CCSB05DB5306昭通市市场监督管理局发布DB5306/T78-2022I本文件按照GB/T1.1－2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由昭通市农业科学院提出。本文件由昭通市农业农村局归口。本文件起草单位：昭通市农业科学院。本文件主要起草人：权申春、马永鹏、龙云星、高朝文、王茜、刘元剑、岳凯、宋贤武、李周、岳万勇、李啟菊。DB5306/T78-20221半夏组培快繁技术规程本文件规定了半夏（Pinelliaternata(Thunb.)Breit.）组培快繁技术的术语和定义、生产及技术流程、炼苗移栽、采收储藏操作规范。本文件适用于半夏组培苗生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T317白砂糖GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB5749生活饮用水卫生标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T22278良好实验室规范原则3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1半夏一步成苗技术将半夏（Pinelliaternata(Thunb.)Breit.）外植体接种于同一种培养基中，让外植体在其上脱分化、再分化、长叶、生根，最终形成完整的植株。3.2超级原种用半夏组培苗驯化繁殖产生的第一代繁殖材料（块茎、成熟珠芽、多块茎共生体）。4半夏组培快繁的生产及技术流程4.1组织培养生产设施设备实验室应符合GB19489和GB/T22278要求。常用的实验设备有：超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，电子天平等。4.2培养基的配制方法DB5306/T78-202224.2.1培养基配方半夏组培快繁技术中所用培养基为MS+6-BA+NAA+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH5.8。培养基配方详细情况见附录A。4.2.2培养基配制程序4.2.2.1母液的配制和保存试剂配制严格按照GB/T603规定方法配制，所用水执行GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法标准。通常将常用试剂配制成比培养基所需浓度高10倍～100倍的母液，具体配制倍数见附录A。母液置于2℃~4℃的冰箱中贮存。4.2.2.2植物生长调节剂的配制植物生长调节剂用量极微量，各种植物生长调节剂单独配制。4.2.2.2.1NAA的配制精密称取NAA试剂，先用少量95%乙醇或无水乙醇完全溶解，最后加水定容。常用母液浓度为0.1mg/ml～1.0mg/ml。4.2.2.2.26-BA的配制精密称取6-BA试剂，先用少量1mol/L的HCl完全溶解，最后加水定容。常用母液浓度为0.1mg/ml~4.2.2.3培养基制备半夏培养基由试剂、蔗糖、琼脂、水组成，蔗糖和水应分别符合GB317和GB5749规定。培养基的制备：称取所需量的琼脂、蔗糖，根据不同浓缩倍数量取对应的母液；首先在水浴锅中加入琼脂，搅拌让其慢慢熔化；再依次把量取好的母液及生长调剂加入已融化的琼脂中；最后加入蔗糖，继续加温，不断搅拌，直至琼脂和蔗糖完全溶解；最终定容到所需体积。4.2.2.4pH值调整半夏培养基最佳pH值为5.8，采用酸度计或精密pH试纸测定调整，通常用1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl来调节。4.2.2.5培养基分装配制好的培养基需趁热分装，分装量以培养容器体积的1/4～1/3为宜，分装后应立即密封。4.2.2.6培养基灭菌培养基分装后应在24h内完成灭菌工作。在压力为1.1kg/cm2，温度121℃的条件下，灭菌25min~30min。4.2.2.7培养基保存灭菌后的培养基应保存于洁净、干燥的培养基储存室中，2℃~4℃条件下7d内使用。DB5306/T78-202234.3外植体的制备及接种4.3.1外植体的选择无病虫害、健壮的半夏植株的叶片、珠芽、块茎均可作为外植体，以块茎为外植体更易于取样和操作。4.3.2外植体的消毒用块茎作为外植体时应先剥去表皮，外植体材料应先用自来水冲洗30min。将洗净后的外植体材料转至超净工作台上，用75%乙醇浸泡10s～20s，用无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞消毒8min～12min（块茎、珠芽消毒12min；叶柄10min，叶片8min），最后用无菌水冲洗5次～7次后备用。4.3.3接种在超净工作台上，将消毒好的半夏块茎切成约大小0.5cm×0.5cm，接种到培养基上，带茎尖的块茎茎尖朝上摆放，切口接触培养基固定；叶柄切成1cm左右大小段扦插到培养基上；叶片切成大小0.5cm×0.5cm、叶面朝上平铺于培养基上，接种后做好标记。半夏组培技术流程图见附录B。4.4初代培养4.4.1温度与光照半夏最适宜的培养温度25℃±2℃,光照强度为1500Lx～2000Lx，光照时间为12h/d。4.4.2培养过程接种好的培养瓶放置在条件适宜的培养架上，培养30d～50d左右，形成愈伤组织和丛生芽。丛生芽和愈伤组织继续培养或者分割转接到新的培养基上，培养30d左右，形成完整组培苗。4.5增殖培养4.5.1叶片培养将无菌组培苗浓绿厚大的叶片切成大小约0.5cm×0.5cm，叶面朝上平铺于培养基上，培养周期30d~50d，形成愈伤组织和丛生芽。4.5.2叶柄培养将无菌组培苗生长健壮的叶柄切成约1cm大小段，扦插于培养基上，培养周期30d～50d，形成愈伤组织和丛生芽。4.5.3愈伤组织培养将剪掉叶片和叶柄的愈伤组织分割成约大小0.5cm×0.5cm，转接到新的培养基上，培养周期30d左右，形成完整的组培苗。4.5.4从生芽和愈伤组织培养将丛生芽和愈伤组织继续培养或转接至新的培养基上，培养周期30d左右，形成完整组培苗。DB5306/T78-202245设施驯化移栽操作规范5.1光照培养炼苗在室温、自然光下，选择株高3cm～5cm的半夏组培苗，先拧松瓶盖2d～3d，再半揭瓶盖2d～3d，最后完全揭开瓶盖，炼苗3d～5d后即可进行移栽。5.2移栽驯化5.2.1基质配制在能调节光照、温度、湿度等因素的设施大棚内，将椰糠、蛭石、生物有机肥按体积7:2.5:0.5配制成移栽驯化基质。5.2.2移栽从瓶中取出经过光培炼苗的半夏组织苗，用自来水洗去附着的培养基，按株行距5cm×10cm移栽到基质上，然后用薄膜覆盖保水保湿，在温度25℃左右，相对湿度85%条件下生长5d～7d揭摸。5.3苗期管理5.3.1肥水管理由于组培苗比较脆弱，应根据天气情况及时做好管理，保持基质内含水量50％～60%。整个生长期间保持温度25℃左右，遮阳率75%左右。待所有组培苗成活并长出新叶后，全面喷施第1次2000倍水溶复合肥（氮磷钾比列为12:8:30待多数叶片形成珠芽芽点时，全面喷施第2次1000倍水溶复合肥；珠芽成熟过程中进行第三次800倍～1000倍水溶复合肥喷施。5.3.2病虫草害管理病虫草害以预防为主，整个生育期及时除草，除小除早，严防草荒。主要病害有立枯病，主要虫害有蚜虫和蓟马。半夏组培苗主要病虫害种类及防治方法见附录C。5.4采收与贮藏5.4.1采收5.4.1.1时间驯化繁殖90d～120d左右，倒苗即可正常收获。5.4.1.2方法收获前7d停止浇水。收获时先捡拾散落的珠芽，再按行开挖采收，最后用细筛将基质筛1遍，筛捡漏收的。5.4.2储藏将超级原种凉干水分后在4℃以下低温冷库中贮存；也可薄摊在通风阴凉的室内，适当加少量基质，以保持水分，防止腐烂。DB5306/T78-20225（规范性）半夏组培快繁技术MS培养基配方半夏组培快繁技术MS培养基配方见表A.1。表A.1半夏组培快繁MS培养基配方表素NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO4FeSO4·7H2O素MnSO4·H2OZnSO4·7H2OCoCl3·6H20NaMoO4·2H2OH3BO3DB5306/T78-20226（规范性）半夏组培技术流程图半夏组培技术流程图见图B.1。图B.1半夏组培技术流程图DB5306/T78-20227（规范性）半夏组培快繁技术主要病虫害种类及防治方法半夏组培快繁技术主要病虫害种类及防治方法见表C.1。表C.1半夏组培快繁技术主要