第章紫外-可见分光光度法优

第16章紫外-可见分光光度法4.提高测量灵敏度与准确度的方法

分光光度法的误差

提高测量灵敏度与准确度的方法3.紫外-可见分光光度法

分光光度计

定量分析方法

5.紫外分光光度法应用简介

752型分光光度计

紫外分光光度法的应用

重点：难点：1.朗伯-比尔定律2.物质的吸收光谱物质的吸收光谱第一节物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收

M(基态)+h

M*(激发态)

物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。白红橙黄绿蓝绿蓝绿蓝紫二、物质的吸收光谱吸光度A(absorbance):溶液对一定波长光的吸收程度。吸收曲线或吸收光谱:以吸光度A对波长

作图所得曲线。

max

:吸收光谱中，吸光度最大处的波长。

max是定性鉴别物质的基础，不同浓度的溶液，

max不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。图16-1三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图

max=508nm图16-2不同物质(A,B,C)和不同浓度(1,2,3,4)的同一物质(B)的吸收光谱(浓度:1>2>3>4)注意：1.同物质的溶液，不仅其光吸收曲线形状有差别，最大吸收波长也不同。2.最大吸收波长与物质的浓度无关，是定性分析的依据。三.电子跃迁类型价电子：σ电子→饱和的σ键

π电子不饱和的π键

n电子

对于有机物来说，能吸收光子产生电子跃迁的电子有σ电子、π电子（即价电子）和n电子（即非键电子）等三种。当有机化合物吸收紫外或可见光时，这些电子将跃迁到较高的能级状态。故能发生的跃迁有σ

σ*、n

σ*、n

π*和π

π*等四种类型。图16-3表示了这四种电子跃迁和相应的跃迁能级。

电子跃迁类型：1.σ→σ*跃迁：饱和烃（甲烷，乙烷）

E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁：含杂原子饱和基团（-OH，-NH2）

E较大，λ150~250nm（真空紫外区）3.π→π*跃迁：不饱和基团（-C＝C-，-C＝O）

E较小，λ~200nm

体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（-C≡N，C＝O）

E最小，λ200~400nm（近紫外区）按能量大小：σ→σ*>

n→σ*>

π→π*>

n→π*图16-3分子中电子能级和跃迁注：紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）第二节分光光度法基本原理一、透光率(transmittance)和吸光度

I0

=Ia+It+IrI0-入射光强度It-透过光强度Ia-吸收光强度Ir-反射损失Ir吸收池材料和厚度相同，被测溶液和参比溶液的Ir影响相互抵消：

一般Ir很小：

I0

=Ia+It

吸收光谱中，用I表示透过光强度透光率T：

It

T=——I0二、Lambert-Beer定律

Lambert-Beer定律：

A=kbc

K--吸光系数

b--吸光液层的厚度(光程)，cmc--吸光物质的浓度，g

L-1,mol

L-1吸光系数(K)入射光波长物质的性质温度与浓度无关，只是符号、取值与浓度的单位相关c：mol·L-1K

摩尔吸光系数，L·mol–1·cm-1c：g·L-1K

a质量吸光系数，L·g–1·cm-1吸光系数

=aMB吸光系数可用比吸光系数E1cm1%表示比吸光系数:一定波长时，溶液的浓度为1%(g/ml)，厚度为1cm吸光度，E1cm1%与

和a的关系分别为：例

溶液中铁(Ⅱ)浓度为5.0×10-4g·L-1的，与1,10-邻二氮杂菲反应，生成橙红色络合物，该络合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.190。计算1,10-邻二氮杂菲亚铁的a及ε。(已知铁的相对原子质量为55.85)解：根据比耳定律：A=abc

光源单色器检测器吸收池指示器吸收光谱中，用I表示透过光强度测量误差和透光率的关系石英棱镜用于185～4000nm波长，紫外-可见分光光度计比较吸光度(或吸光系数的比值)玻璃棱镜用于350～3200nm波长，可见分光光度计取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。例如，乙醇和环己烷中若含少量杂质苯，苯在256nm处有吸收峰，而乙醇和环己烷在此波长处无吸收，乙醇中含苯量低达0.0×10-4g·L-1的，与1,10-邻二氮杂菲反应，生成橙红色络合物，该络合物在波长508nm，比色皿厚度为2cm时，测得A=0.4、分光光度法仅适用于微量组分的测定。吸收光谱中，用I表示透过光强度例题11-2某试液显色后用2.0cm吸收池测定时T＝50.0%，若用1.0cm或5.0cm吸收池测定，T及A各为多少？应用Lambert-Beer定律时，需注意以下几点：

1、Lambert-Beer定律仅适用于单一波长的单色光。入射光的波长范围越宽，则测定结果越容易偏离Lambert-Beer定律。

2、吸收过程中各物质间无相互作用，但各物质的吸光度具有加和性。即

A=Aa+Ab

+Ac

+

3、入射光波长不同时，

也不同。越大，溶液对入射光的吸收越强，测定的灵敏度越高。

4、分光光度法仅适用于微量组分的测定。例13-2：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下：A(280nm)=0.46，

A(260nm)=0.58，试计算每一组分的浓度。已知：酶的

(280nm)

=

2.96

104L

mol-1

cm-1

(260nm)

=1.52

104L

mol-1

cm-1AMP的

(280nm)

=

2.4

103L

mol-1

cm-1

(260nm)

=

1.5

104L

mol-1

cm-1

吸收池厚度为1.00cm。

解：设酶和AMP的浓度分别为y和z：

为260nm时：

0.58=1.52

104

1.00y+1.5

104

1.00z

为280nm时：

0.46=2.96

104

1.00y+2.4

103

1.00z

解方程得：y=1.4

10-5（mol

L–1）

z=2.5

10-5（mol

L-1）即：酶的浓度为1.4

10-5mol

L–1，

AMP的浓度为2.5

10-5mol

L-1

。

第三节可见分光光度法

一、分光光度计(spectrophotomete)主要部件：光源

单色器

检测器

吸收池指示器光源：钨灯，发出320~3200nm的连续光谱。单色器：以棱镜或光栅分光，提供单色光。吸收池：分光光度计中用来盛放溶液的容器。检测器：将通过吸收池的光转换为光电流，再经放大输入指示器，然后显示。指示器：显示A或T

。1、光源要求：波长范围宽，连续光谱，强度足够，稳定可见光谱：

钨灯(6～12V)320～2500nm

碘钨灯(6～12V)发光强度高寿命长紫外光谱：

氢灯180～375nm

氘灯发光强度使用寿命比氢灯增加2～3倍

——都需要电压稳定的电源供电。2、单色器棱镜单色器：单色光纯度由棱镜的色散率和出射狭缝宽度决定玻璃棱镜用于350～3200nm波长，可见分光光度计石英棱镜用于185～4000nm波长，紫外-可见分光光度计光栅单色器：利用光的衍射和干射作用制成的元件优点：适用波长范围宽，色散均匀，分率高缺点：有重叠和相互干扰3、吸收池——比色皿玻璃比色皿用于可见光石英比色皿用于λ＜400nm的紫外光比色皿的质量要求：无色、透明、耐腐蚀、同一厚度的透光率误差<5%。1cm2cm3cm0.5cm＋－金属膜铁片硒片4、检测器光电管光电倍增管受强光照射或长时间连续照射会出现“疲劳现象”，应置于暗处恢复。如：硒光电池：e-72型分光光度计结构图G稳压电源钨灯比色室反射镜棱镜硒光电池检流计狭缝狭缝透镜波长读数盘反射镜透镜二、定量分析方法1、标准曲线法取系列浓度标准溶液，测定吸光度A，作吸光度A对溶液浓度c的图，得过坐标原点的直线。在相同条件下，测量被测溶液的吸光度，在标准曲线上查得溶液度。维生素B12的标准曲线

2、标准对照法预先配制一个与待测液浓度相接近的标准溶液(其浓度用cs表示)，测得其吸光度为As，再测定待测液的吸光度Ax，则待测液浓度cs可从下式求得46，A(260nm)=0.最大吸收波长与物质的浓度无关，是定性分析的依据。比较吸光度(或吸光系数的比值)以Cs作参比，调A=0.I0(已知铁的相对原子质量为55.吸收光谱中，用I表示透过光强度4、分光光度法仅适用于微量组分的测定。AMP的浓度为2.T=——测量误差和透光率的关系吸光系数可用比吸光系数E1cm1%表示根据朗伯-比耳定律，若l和吸光系数ε或已知，即可根据测得的A求出被测物的浓度。反应生成的有色化合物组成恒定。根据朗伯-比耳定律，两边微分得:比较max、(max)或a(max)以浓度为Cs的标准溶液为参比3.比吸光系数法

根据朗伯-比耳定律，若l和吸光系数ε或已知，即可根据测得的A求出被测物的浓度。通常ε和可以从手册或文献中查到，这种方法也称绝对法。例如维生素B12的水溶液在361nm处的值为207，于1cm吸收池中测得溶液的吸光度为0.414，则溶液浓度为：c=0.414/(207×1)=0.00200(g/100ml)以浓度为Cs的标准溶液为参比（Cx>Cs）适宜高浓度的测定ΔA△C△CxΔAx差示工作曲线方法：标准溶液Cs

、

C1、C2、C3……。以Cs作参比，调A=0.测C1、C2、C3……的△A。4.示差法

作△A~△C差示工作曲线.同条件下测△Ax.从中查出△Cx.

第四节提高测量灵敏度和准确度的方法一、分光光度法的误差1、仪器测定误差光电管灵敏性差、光源不稳定及读数不准。透光率误差

T引起浓度误差

c：透光率20%~65%，A为0.2~0.7时，浓度相对误差较小。测量误差和透光率的关系2、溶液偏离Beer定律偏离Beer定律，A-c曲线弯曲。主要原因：化学因素吸光物质发生解离、缔合、溶剂化等现象；光学因素复色光引起对Beer定律的偏离。主观误差两种不同吸光系数的混合光对Beer定律的偏离1、选择适当的显色剂灵敏度高选择性好显色剂在测定波长处无明显吸收反应生成的有色化合物组成恒定。二、提高测量灵敏度和准确度的方法2.选择合适的测定条件(1)入射光波长的选择一般选择λmax作为入射光的波长，但有干扰存在时，应兼顾灵敏度和选择性来选择入射光的波长。根据朗伯-比耳定律