DB5306T 98-2023 苹果矮化自根砧脱毒组培技术规程

ICS65.020CCSB05DB5306昭通市市场监督管理局发布DB5306/T98-2023I本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件由昭通市苹果产业发展中心提出。本文件由昭通市农业农村局归口。本文件起草单位：昭通市苹果产业发展中心、中国农业科学院果树研究所。本文件主要起草人：马勉娣、鲁兴凯、张丹、张秀英、胡志芳、董雅凤、胡国君、唐昕、龚占斌、杜楠、马静、李超、姚梅、唐玉凤、孔皎。DB5306/T98-20231苹果矮化自根砧脱毒组培技术规程本文件规定了苹果矮化自根砧脱毒组培繁育过程中的术语和定义、脱毒方法、培养基制备、组织培养过程、炼苗移栽、组培苗质量要求、包装、标签和运输等方面的操作规程。本文件适用于昭通苹果矮化自根砧的脱毒组培繁育。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1085苹果苗木繁育技术规程NY/T2281苹果病毒检测技术规范NY/T2719苹果苗木脱毒技术规范3术语与定义下列术语与定义适用于本文件。3.1植物组织培养在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，在人工培养基和人工控制的环境中，使其再生新植株的过程和技术。3.2热处理将盆栽苗或试管苗置于光照培养箱或人工气候室内，在较高恒温或变温条件下生长，以抑制病毒在植株体内增殖和扩散，从而获得无病毒新梢或茎尖组织的过程。3.3培养基根据植物营养原理和植物组织培养的要求，人工培植的营养物质。3.4培养基母液按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液。3.5外植体从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。3.6初代培养采集外植体并对其进行消毒接种，将其置于适宜的培养条件下，启动生长、获得最初的无菌培养材DB5306/T98-20232料的过程。3.7继代过程外植体经过初代培养后，再次以及以后各次接种于新培养基继续培养的过程。3.8试管苗通过组织培养方法获得的组培瓶中的培养材料，包括外植体初代培养、继代培养、生根培养各个阶段的组培材料。3.9茎尖培养以植物茎尖为外植体，通过组织培养的方式获得完整植株的一种生物技术。一般用来继续脱毒种苗的生产，已获得不含检疫及影响植物正常生长的病毒的植株。3.10组培苗利用植物组织、器官或者细胞等作为起始材料，通过植物组织培养方式生产获得的植株。4苹果盆栽苗热处理脱毒4.1脱除病毒种类包括苹果茎沟病毒(Applestemgroovingvirus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Applestempittingvirus,ASPV)、苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)、苹果花叶病毒(Applemosaicvirus,ApMV)和苹果锈果类病毒(Applescarskinviroid,ASSVd)。4.2脱毒方法脱毒方法按NY/T2719的规定执行。5培养基制备5.1基本培养基采用MS培养基，具体成分见表A.1。5.2培养基母液配制5.2.1MS培养基母液根据附录A中表A.1的基本培养基配方成分分组和浓度扩大倍数，分别配制大量元素（20倍）母液、钙元素（20倍）母液、微量元素（200倍)母液、铁元素（100倍）母液和有机物（100倍）母液。5.2.2生长调节剂配制成单一成分母液，浓度以方便使用为原则，一般为0.1mg/mL～0.5mg/mL。5.2.31.0mol/L盐酸溶液或1.0mol/L氢氧化钠溶液（调pH用）DB5306/T98-202331.0mol/L盐酸溶液：量取8.4mL盐酸，定容至100mL。1.0mol/L氢氧化钠溶液·称取1.0g氢氧化钠，溶解后定容至100mL。5.3分化增殖培养基MS+6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L～1.5mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.2mg/L～0.4mg/L+萘乙酸(NAA)0mg/L～0.1mg/L+蔗糖40g/L+琼脂粉6g/L，pH5.8。5.4生根培养基1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.1mg/L～0.5mg/L+吲哚乙酸(IAA)1.0mg/L～2.0mg/L+蔗糖15g/L+琼脂粉6g/L，pH5.8。5.5不同苹果砧木组织培养时，培养基中生长调节物质的浓度可根据以上配方给出的浓度范围适当调整。5.6培养基配制程序5.6.1根据培养基配方与培养基配制数量，计算各种母液的用量及配方中其它成分的用量。5.6.2按照计算结果称量固化剂与蔗糖（或白砂糖），加入蒸馏水中，蒸馏水的量以培养基配制体积的1/2～2/3为宜，不断搅拌。5.6.3加入相应母液，加蒸馏水定容，充分搅拌均匀。5.6.4用1.0mol/L盐酸或1.0mol/L氢氧化钠调节pH值至5.8～6.0。5.6.5将培养基分装到培养瓶中，培养基的厚度为1.5cm～2.0cm，用封口膜、封口盖或棉塞加牛皮纸封口。5.6.6将培养基放入高压蒸汽灭菌器内灭菌。灭菌温度121℃,灭菌时间15min～20min。5.6.7灭菌后的培养基在干净、阴凉的室内常温平放保存，保存时间不宜超过2周。6苹果砧木组织培养6.1外植体初代培养6.1.1外植体消毒从热处理后的盆栽苗上剪取1cm～2cm顶梢，去掉叶片，在超净工作台上进行消毒处理，在无菌瓶中使用75%酒精消毒，时间30s，无菌水清洗3遍；后使用0.1%氯化汞溶液，消毒时间5min～7min，无菌水清洗4遍～6遍。消毒时间可根据材料的幼嫩程度、洁净程度适当调整。消毒期间多次摇动消毒瓶，以保证外植体与消毒剂充分接触。6.1.2外植体的切块及接种将长度1cm以下的幼嫩新梢去掉外围叶片，取出置于无菌培养皿上，在解剖镜下剥取小于0.3cm的茎尖，接入分化增殖培养基上，每瓶接1个～4个外植体，接种分布均匀，深浅适中。封好瓶口并标注。6.2增殖培养DB5306/T98-20234将接种的培养瓶置于25℃~28℃、光照强度1000lx～2000lx、10h～12h光照、10h～12h黑暗的组培室中培养。据生长状况，每1个～2个月转接一次。转接时去除基部愈伤组织、老化组织、褐化组织，切分成0.5cm～1.5cm大小的丛梢或茎段，每个茎段带1个～2个腋芽，接入继代培养基，由同一个茎尖增殖得到的组培苗为一个芽系，统一编号。继代培养5次～6次，同一芽系的试管苗数量达到5瓶以上时，进行病毒检测。6.3病毒检测茎尖培养获得的所有试管苗均需进行病毒检测，检测方法按NY/T2281的规定执行。未检测到本标准规定的脱除病毒种类，且未表现任何病毒病症状，生长和结果性状符合该品种特征的作为脱毒原种材料保存。6.4生根培养将脱毒成功的组培苗增殖培养5代～10代左右（根据不同砧木品种来决定），即可切取高度大于2cm的粗壮嫩梢，转入生根培养基，每瓶接种4苗～5苗，进行生根培养。培养条件为，温度（24±光照强度1500lx～2000lx，10h～12h光照，10h～12h黑暗。7试管苗移栽7.1移栽适宜条件在温室（或大棚）进行炼苗，温室（或大棚）温度25℃左右，最低温度>10℃,最高温度<35℃,光照强度18000lx～30000lx，光线过强时可遮阴。一般选择春夏季移栽成活率较高。7.2移栽容器及基质移栽容器可选用塑料或无纺布营养钵。基质可用椰糠土：草炭土：珍珠岩=1:2:1混合或草炭土∶蛭石=1:1混合，装入移栽容器的2/3处，浇透水，并喷洒0.1%多菌灵。7.3强光照锻炼生根培养3周～5周后，不定根长至1.0cm左右时，将组培苗由培养室移至温室或大棚，闭瓶炼苗10d左右，增强组培苗适应性及抗逆性，温室或大棚光照过强时可遮荫。闭瓶锻炼后除去封口材料，开瓶锻炼5d～7d，期间保持水分，注意遮阴。炼好的组培苗，洗去根部培养基，即可移栽。7.4移栽用0.1%多菌灵药液拌湿基质，将清洗干净的组培苗，直立置于盛有1/3基质的容器中，根系尽量舒展，再覆盖基质并紧实到容器口4/5处。栽后放置于温室或大棚中，喷洒0.1%多菌灵液防病，扣小拱棚保持水分，注意前期遮阴。7.5栽后管理移栽7d～10d，缓苗期过后应逐渐揭膜通风，降低湿度，直至完全除去薄膜。视小苗发病状况，每1周～2周喷1次0.1%多菌灵。后期，根据小苗生长状况，补充营养液。7.6大田移栽DB5306/T98-202357.6.1苗圃地选择按照NY/T1085的规定执行。7.6.2移栽50d～80d后，成活苗地上部高度大于10cm，可带基质移栽至大田苗圃地中。7.6.3移栽前加强通风炼苗，控制浇水。高温季节应适当遮阴。8组培苗质量要求适宜移栽的组培苗应无细菌、真菌污染，苗高3cm以上，生3条以上不定根，根长1.0cm左右，有侧根生长，幼茎粗壮，茎基部没有或有少量愈伤组织，长有3片～4片以上叶片，叶片发育良好，无黄叶，无枯尖。9包装、标签和运输组培苗如需长途运输，可洗去培养基，放置于塑料苗袋中，5苗一袋，加入少许水，封口后放于泡沫箱中，用填充物固定好，高温季节加冰袋，苗木泡沫箱用胶带密封，标签标明品种、瓶苗数量、包装时间等，禁止上下倒置，运输过程中防止重压、暴晒、风干、雨淋、冻害、剧烈颠簸等。DB5306/T98-20236（资料性）MS培养基配方A.1MS培养基配方MS培养基配方见表A.l。表A.1MS培养基成分及母液配制表母液及倍数试剂配方规定量mg/L配置lL母液需求量g大量元素20xNH4NO3l65033KNO3l90038MgSO4·7H2Ol707.4KH2PO43703.4钙元素20xCaCL2·6H2