新疆盐碱地来源真菌S24次级代谢产物的分离鉴定

I摘要本课题以从新疆喀什地区盐碱地植物柽柳的根际土壤中分离得到的丝状真菌S24为研究对象，对其进行发酵提取、分离纯化、结构鉴定、活性评价以及培养方法的筛选，期待发现新的活性吡喃酮类化合物。对真菌S24进行大量发酵，通ODS柱层析、sephadexLH-20葡聚糖凝胶柱层析以及半制备高效液相等分离方法，从而得到单体化合物，并通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定，用Griess法体外评价化合物体外抗炎活性。最后选用6种不同的培养基分别培养15天和30天对真菌S24进行发酵，通过同一条件下HPLC分析，初步探索不同培养方法下S24吡喃酮类化合物的产量和数目。鉴定3个化合物的结构，分别为penipyrolA（M1）、penipyrolH(M2)、N-苯甲酸-L-苯丙氨酸-N-苯甲酰-L-苯丙氨酸酯（M3），其中M2为新的α-吡喃酮类化合物。化合物M1对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的NO具有良好的抑制作用，IC50为19.91μg/mL。采用含9%NaCl的1号培养基培养30天时，真菌S24次级代谢产物吡喃酮类化合物产量最大，种类最多。结论：本文分离鉴定2个吡喃酮类化合物（M1，M2）包括1个新化合物，1个N-苯甲酸-L-苯丙氨酸-N-苯甲酰-L-苯丙氨酸酯（M3），化合物M1可通过抑制NO炎症因子的释放而发挥抗炎活性。可选择9%NaCl的1号培养基培养30天富集活性化合物M1，获得更多吡喃酮类似物。关键词：真菌吡喃酮抗炎

AbstractThisprojecttakesthefilamentousfungusS24isolatedfromtherhizoarsoiloftamariskchinensis,asaline-alkaliplantinKashgarPrefecture,Xinjiang,astheresearchobject.Itconductsfermentationextraction,separationandpurification,structuralidentification,activityevaluation,andscreeningofculturemethods,withtheexpectationofdiscoveringnewactivepyronecompounds.Large-scalefermentationoffungusS24wascarriedout,andmonomercompoundswereobtainedthroughseparationmethodssuchasODScolumnchromatography,sephadexLH-20,andsemi-preparativehigh-performanceliquidchromatography.Structuralidentificationwasperformedby1H-NMRand13C-NMR,andanti-inflammatoryactivecompoundswerescreenedinvitrobytheGriessmethod.Finally,sixdifferentculturemediawereusedtofermentfungusS24for15daysand30days,respectively.Underthesameconditions,HPLCanalysiswasconductedtocomparetheyieldandvarietyofsecondarymetabolitesofS24underdifferentculturemethods.Thestructuresofthreecompoundswereidentified,namelypenipyrolA(M1),penipyrolH(M2),andN-benzoicacid-L-phenylalanine-N-benzoyl-L-phenylalanineester(M3),amongwhichM2wasanewα-pyranonecompound.CompoundM1hasagoodinhibitoryeffectonNOproducedbyLPS-inducedRAW264.7macrophages,withanIC50of19.91µg/mL.Whenculturedinthe1stculturemediumcontaining9%NaClfor30days,thepyranonecompoundsproducedbythesecondarymetabolismoffungusS24reachedthehighestyieldandthemosttypes..Inthispaper,oneN-benzoyl-L-phenylalanine-N-benzoyl-L-phenylala-nineester(M3)andtwopyranonecompounds(M1,M2)wereisolatedandidentified,includingonenewcompound.CompoundM1canexertanti-inflammatoryactivitybyinhibitingthereleaseoftheNOinflammatoryfactor.TheactivecompoundM1canbeenrichedbyculturingfor30daysinthe1stculturemediumwith9%NaCl,therebyobtainingmorepyranoneanalogues.KeyWords:Fungus;Pyranone;Anti-inflammatory前言天然产物作为药物发现的重要源泉，始终推动着人类健康与科技进步。REF_Ref6961\r\h[1-3]目前有近60%的临床药物直接或间接来源于天然产物，而微生物在天然产物获取上占据着不可替代的地位，目前已知的具有生物活性的微生物次级代谢产物中，近一半是由丝状真菌所产生的。REF_Ref7545\r\h[4,5]早在二十世纪，英国细菌学家亚历山大·弗莱明在被青霉菌污染的金黄色葡萄球菌培养基中发现了一种能够抑制细菌生长的物质，并将其命名为青霉素，随后从青霉菌中提取并纯化了这种物质，从而为后来的抗生素发展奠定了基础。环孢素A（CyclosporineA，CsA）是一种强效的免疫抑制剂，广泛用于器官移植和某些自身免疫性疾病，而它最先也是从两种不完全真菌—光泽柱孢菌（Cylindrocarponlucidum）和雪白白僵菌（Beauveriabassiana）中分离得到的。REF_Ref7963\r\h[6,7]从红曲霉菌中提取的洛伐他汀通过抑制肝脏中的HMG-CoA还原酶，阻断胆固醇的生物合成路径，从而减少肝脏胆固醇的合成，导致血液中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平降低。REF_Ref8169\r\h[8-11]这些来源于真菌代谢产物的药物在当前的临床实践中依然保持着极高的应用价值，说明真菌的代谢产物具有广阔的研究前景。而盐碱地作为全世界的广泛分布的极端环境，其高盐、干旱、碱化等环境因素导致产生其独特的微生物资源。QiaoWang等发现在盐碱胁迫响应中，玫瑰花瓣中有1363个基因的表达和196种代谢物的丰度发生了显著变化。这些差异表达基因（DEGs）和差异积累代谢物（DAMs）主要与黄酮类和萜类代谢以及细胞壁重构有关。REF_Ref8267\r\h[12]而新疆是中国盐碱地所在的重要地区，因盐分积累、水分蒸发及地质运动的长期影响，形成了较为复杂的生态环境。REF_Ref8388\r\h[13]在这种极端环境中生存下来的真菌，为了适应恶劣环境，一般会进化出期独特的代谢方式，产生结构新颖且活性多样的次级代谢产物，而这些代谢产物可能就是生存在盐碱地的微生物应对环境胁迫的重要策略之一。近年来，随着全世界范围内对于天然产物资源需求的增长、科技手段的发展及极端环境微生物研究的深入，盐碱地真菌的次级代谢产物渐渐成为了研究热点。此前有研究表明，这种真菌可产生包括生物碱、萜类、多肽类等在内的多种活性成分，展现出抗菌、抗肿瘤、抗氧化及酶抑制等生物活性。REF_Ref8394\r\h[14]例如，潘效红课题组从盐碱地得到的一株真菌雷斯青霉菌（Penicilliumraistrickii）中分离得到了一种新的螺环缩酮类化合物PeniciketalA。PeniciketalA具有明显的抗肿瘤活性,尤其是对人急性髓系白血病细胞具有非常明显的抑制作用,而且对正常细胞没有毒性。REF_Ref8897\r\h[15]而刘德胜等从来源于盐碱地的真菌棘孢曲霉Aspergillusaculeatus得到其活性次级代谢产物,并首次报道secalonicacidF对A549肿瘤细胞增殖抑制活性。REF_Ref8900\r\h[16]而吡喃酮类化合物作为真菌次级代谢产物中的特殊成分，近些年来在生物活性研究与临床应用价值上均展现出广阔的发展前景。因吡喃酮类化合物具有结构多样的特点，使其在抗菌、抗肿瘤及抗氧化等方面均有一定的作用，但其在对抗耐药菌与复杂疾病方面的应用中最为重要。REF_Ref9217\r\h[17-23]但因极端环境中样本采集困难、代谢产物分离技术的复杂性以及人工发酵培养产率较低等问题，目前对于盐碱地真菌次级代谢产物的研究仍相对匮乏，特别是针对从盐碱地真菌中提取出吡喃酮类化合物的研究尚未充分展开。实验室前期从新疆喀什地区盐碱地植物柽柳的根际土壤中分离得到多株丝状真菌，在筛选过程中，发现真菌S24代谢产物具有特殊的紫外吸收特征峰（258，359nm），本课题拟在上述基础上通过真菌二号培养基对S24菌株进行发酵培养，以HPLC-PDA的紫外吸收特征为指导，采用中压制备色谱、凝胶SephadexLH-20柱层析、半制备高效液相色谱仪等分离纯化方法和NMR、MS等现代波谱学技术进行结构鉴定，Griess法体外筛选抗炎活性化合物等，对S24菌株的次级代谢产物展开进一步研究。并欲通过HPLC检测数据对发酵方法进行对比，筛选出更好的培养条件，为后续真菌S24的研究提供一定的指导意义。

3结果3.1真菌S24次级代谢产物的结构鉴定分离富集纯化得到化合物M1、M2，M3、M4，鉴定出M1、M2、M3的化学结构，其中M1、M2为吡喃酮类化合物，在258，359nm左右有紫外特征吸收，而化合物M4为黄色油状物；UV（MeOH）：260，359nm与M1、M2相似，因提取含量有限，未解析出其具体结构，但通过其紫外吸收特征推测其应为吡喃酮类化合物。图3.1单体化合物结构总图化合物M1为黄色油状物；分子量为262；分子式为C15H18O4，表明该化合物有7个不饱和度；UV（MeOH）：258，356nm；1H-NMR、13C-NMR谱数据（见下表3.1）显示该化合物含有4个不饱和双键，其中包括五个烯烃次甲基，δC140.11，138.13，δH7.13（d,J=15.6,2H），δC135.78，δH5.77(d,J=9.8,1H)，δC118.23，δH6.00(d,J=7.0,1H），δC104.95，δH6.03(d,J=16.0,1H），还含有2个连在不饱和碳上的甲基δC16.94，δH2.09(s,3H)，δC12.74，δH1.85(s,3H)。13C-NMR数据δC178.27，163.43表明有2个羰基碳的存在，根据不饱和度可以得出该化合物含有一个环结构。以上数据与文献中波谱学数据对照基本一致，故鉴定化合物M1为penipyrolsA。REF_Ref16875\r\h[39]表3.1化合物M1、M2的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据（CDCl3）PositionM1M2δCδH(J,Hz)δCδH(J,Hz)1163.43s—162.53s—2123.85s—125.58s—3140.11d7.13(d,J=15.6)139.84d7.32(d,J=6.9)4104.95d6.03(d,J=16.0)104.85d6.10(d,J=6.8）5157.71s—158.96s—表3.1化合物M1、M2的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据（CDCl3）（续）PositionM1M2δCδH(J,Hz)δCδH(J,Hz)6118.23d6.00(d,J=7.0)117.96d6.06(d,J=15.7)7138.13d7.10(d,J=16.0)139.39d7.15(d,J=15.7）8134.54s—135.48s—9135.78d5.77(d,J=9.8)135.69d5.81(d,J=9.8)1046.64d3.34(q,J=7.6)46.76d3.43-3.24(m)11178.27s—178.45s—1226.08t1.63(dt,J=14.1,7.3)26.07t1.94-1.86(m)1.68-1.56(m)1311.67q0.93(t,J=7.4)11.64q0.93(t,J=7.4)1412.74q1.85(s)12.70q1.85(s)1516.94q2.09(s)61.21t4.49(s)化合物M2为黄色油状物；分子量为278；分子式为C15H18O5，表明含有7个不饱和度；UV（MeOH）：258，359nm；1H-NMR、13C-NMR谱数据（见上表3.1）显示该化合物有1个烯烃甲基单峰δC12.70，δH1.85(s,3H)和8个sp²杂化碳原子，包括5个烯烃次甲基，δC139.84，δH7.32(d,J=6.9,1H)；δC139.39，δH7.15(d,J=15.7,1H）；δC104.85，δH6.10(d,J=6.8,1H)；δC117.96，δH6.06(d,J=15.7,1H)；δC135.69，δH5.81(d,J=9.8,1H)，2个羰基碳δC178.45，162.53。与化合物M1的1D核磁数据对比发现，M2多了1个连氧亚甲基δC61.21，δH4.49(s,2H)，少了化合物M1的δC16.94，δH2.10(s,3H)，考虑是M1的甲基的氢原子被羟基取代，相邻基团电负性明显增加，产生诱导效应所致。图3.2化合物M2的二维核磁共振相关性分析通过HMQC对碳氢数据进行归属，通过2DNMR对化合物结构进一步鉴定。HMBC显示H-3与C-1/C-5具有远程相关和H-4与C-2/C-5具有远程相关，以及H-3和H-4之间的COSY相关性，加上C-1的化学位移（δC162.53）表明存在α-吡喃酮基团，这与先前报道的penipyrolA的核磁共振数据相似。此外，COSY相关性（H-6/H-7，H-9/H-10/H2-12/H3-13）加上从H-6到C-5，从H-7到C-5/C-14，从H-9到C-7，从H-10到C-9/C-11和从H2-12到C-9/C-11的HMBC相关性表明存在六烯酸链。C-5和C-6之间的连接由H-6到C-5和从H-7到C-5的HMBC相关性证实。最后，根据从H3-14到C-7/C-8/C-9和从H2-15到C-1/C-2/C-3的HMBC相关性，确定了化合物M2的骨架结构。双键（C-6/C-7）的顺式结构由偶合常数（15.7Hz）证实，C-8/C-9的几何构型被暂定为顺式，这由H-9（δH5.81）和H3-14（δH1.85）的化学位移所支持（对于顺式结构，响应质子在5.76和1.82ppm，而反式结构在5.49和2.05ppm）。通过以上数据确定了其平面结构，将其命名为penipyrolH，但仍需高分辨质谱进一步确认。REF_Ref17101\r\h[40,41]化合物M3为褐色固体；分子量为506；分子式为C32H30N2O4，表明有19个不饱和度；UV（MeOH）：240nm；1H-NMR谱数据（见下表3.2）显示该化合物有大量苯环氢的存在，δH7.75(d,J=7.7,2H)，7.71(d,J=7.6,2H)，7.39(q,J=8.2,4H)，7.24-7.17(m,6H)，7.18(t,J=8.9,2H)，7.13(q,J=6.4,2H)，结合不饱和度为19，说明结构中含有多个苯环，且均为单取代。13C-NMR谱中δC138.87，138.38，135.01，134.20，132.04，131.69，129.60，129.53，128.81，128.79，128.73，127.92，127.73，126.99，126.72均为苯环上的碳原子信号。1H-NMR谱出现2个N-H宽峰δH8.84(d,J=7.7,1H)，8.30(d,J=7.7,1H)，13C-NMR谱中有羰基碳信号δC167.22，166.75，则可判断出含有2个酰胺结构。1H-NMR谱出现亚甲基氢δH4.15(qd,J=10.9,5.9,2H)，13C-NMR谱中有羰基碳信号δC172.08和羰基邻近碳信号δC54.98，判断其含有酯基结构。化合物M3以上的数据和文献中的数据基本一致，故鉴定其为N-苯甲酸-L-苯丙氨酸-N-苯甲酰-L-苯丙氨酸酯。REF_Ref17231\r\h[42,43]表3.2化合物M3的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据（DMSO-d6）PositionδCδH(J,Hz)PositionδCδH(J,Hz)166.03t4.15(qd,J=10.9,5.9)12,16127.73d7.71(d,J=7.6)250.40d4.40(tt,J=10.6,4.7)13,1513′,15′128.81d7.39(q,J=8.2)336.79t2.85(dd)14132.04d7.47(dt,J=14.2,7.4)4138.87s—14′131.69d5,9129.60d7.24-7.17(m)1′172.08s—5′,9′129.53d2′54.98d4.63(ddd,J=10.3,7.7)6′,8′128.79d3′36.48t3.14(dd,J=13.9,4.6)3.03(dd,J=13.9,10.5)6,8128.73t7.18(t,J=8.9)4′138.38s—7126.72d7.13(q,J=6.4)10′167.22s—7′126.99d11′134.20s—表3.2化合物M3的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据（DMSO-d6）（续）PositionδCδH(J,Hz)PositionδCδH(J,Hz)10166.75s—12′,16′127.92d7.75(d,J=7.7)11135.01s—N-H8.84(d,J=7.7)8.30(d,J=7.7)3.2Griess法体外筛选抗炎活性化合物化合物M1对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的NO具有良好的抑制作用，IC50为19.91μg/mL。3.3真菌S24发酵培养基的筛选表3.312种培养方法中得到主产物的产量和比例（254nm）培养方法产量（mg）M1相对峰面积（%）M2相对峰面积（%）1-3%-15464.211.580.601-9%-15418.710.66-3-3%-15188.377.146.633-9%-15196.644.961.684-3%-15187.656.7610.844-9%-15100.767.473.981-3%-30468.539.774.491-9%-30423.652.193.503-3%-30167.767.2515.433-9%-30198.674.557.494-3%-30123.963.6113.704-9%-30156.842.013.66图3.3所有培养基粗提物的HPLC色谱分析（254nm）结合不同培养方法的乙酸乙酯粗提物的产量（见上表3.3）和HPLC色谱分析出的各组分的相对峰面积发现：对于本课题已分离得到的化合物M1（21min左右出峰）在1号培养基培养30天后，不论含盐量多少，产量均明显高于其余培养基，且发现随着培养时间延长，1号培养基中化合物M1的产量大幅增加。所以认为对于1号培养基而言，含盐量大小对于组分的产量影响不大，培养时间长短对化合物M1的产量影响显著，故若要富集化合物M1，优先选择1号培养基（含盐量9%）培养30天。图3.41号培养基（含盐量9%）培养30天乙酸乙酯粗提物HPLC检测图（254nm）筛选吡喃酮类化合物种类最多的培养基时发现，1号培养基（含盐量9%）培养30天时，在主产物M1前后均出现多种在250，350nm左右均出现特征吸收的化合物（见上图3.4），为12种培养方法中所含吡喃酮类化合物种类最多的培养方法。并且发现与1号培养基（含盐量9%）培养15天相比，吡喃酮类化合物的种类有所增加，与1号培养基（含盐量3%）相比，含盐量9%时无论培养时间长短，都比含盐量3%时出现的吡喃酮类化合物更多。所以认为对于1号培养基而言，含盐量与培养时间均会影响吡喃酮类化合物的种类多少，时间越长，含盐量越高，吡喃酮类化合物种类越多。故欲研究更多种类的吡喃酮类化合物，优先选择1号培养基（含盐量9%）培养30天。

4讨论吡喃酮类化合物广泛分布于微生物代谢产物中，且表现出一定抗菌、抗氧化及神经保护活性，揭示其作为天然药物资源的开发潜力。并且含α-吡喃酮结构的化合物还展现出显著抗肿瘤活性，对癌细胞增殖抑制率达90%以上，为抗癌药物研发提供了新方向。[17,18]本课题通过对发酵液萃取的乙酸乙酯相进行分离富集纯化得到了化合物M1为α-吡喃酮类化合物penipyrolA，并通过Griess法证明吡喃酮类化合物M1还具有体外抗炎活性。化合物M2为新的α-吡喃酮结构类似物。而对水相粗提物用高效液相色谱HPLC-PDA进行全产物分析，发现水相中仍有大量M1残留，故对水相也进行分离纯化，从而富集更多的M1去进行生物活性研