药用环肽MCoTI-Ⅱ线性前体的异源表达与鉴定

目录TOC\o"1-3"\h\u4872摘要 前言1.1环肽MCoTI-II的结构特点近年来，结构高度受限的环肽作为稳定的分子支架，在多肽药物研发领域备受关注。植物大环肽（MCoTI-II）一类由34个氨基酸构成的，首尾两端相连的特殊环状多肽。MCoTI-II分子内存在六个半胱氨酸，其中CysⅠ-CysⅣ、CysⅡ-CysⅤ、CysⅢ-CysⅥ会形成三对二硫键，并且CysⅢ-CysⅥ所形成的二硫键会横穿另外两对二硫键，从而形成一个特殊的环状胱氨酸结（cycliccystineknot,CCK）。因其首尾相连环状骨架和环状胱氨酸结的存在，MCoTI-II相较于线性多肽和普通环肽，展现出更高的结构稳定性。研究显示，破坏MCoTI-II的环状骨架结构和二硫键均会不同程度的降低多肽的稳定性。此外，这种稳定的环状拓扑结构还赋予了MCoTI-II刚性骨架，可以增强其与靶标的结合亲和力和特异性。立体结构研究显示，MCoTI-II呈现β-折叠片层与反向平行环区结构，其疏水性氨基酸残基（如Val、Leu）在环区富集构成疏水核心，而亲水性残基（如Lys、Arg）分布在表面，参与靶标识别和膜穿透[1,2]。这种两亲性分布是MCoTI-II兼具酶抑制活性和细胞穿透能力的关键[1]。更为重要的是，以MCoTI-II的环状骨架结构为模板，将线性多肽的功能活性表位嫁接至其环状结构中，是增加线性多肽类药物稳定性和生物利用的重要手段。1.2环肽MCoTI-II的功能活性除具备稳定的分子结构外，MCoTI-II还表现出多种功能活性。MCoTI-II可与胰蛋白酶特异性结合，阻断其底物结合位点，进而表现出良好的胰蛋白酶抑制活性。已有研究报道，MCoTI-II的蛋白酶抑制活性在生物医学研究中已被用于开发酶活性调节剂或相关疾病治疗药物[4]。此外，研究表明，MCoTI-II及其衍生物还能通过调节细胞膜的通透性来干扰HIV病毒与宿主细胞膜结合，从而表现出抗HIV活性[5,6]。除了自身的功能活性外，MCoTI-II也常被用作药物支架，稳定线性多肽的功能活性[7]。此外，MCoTI-II还可以作为药物设计的框架，利用分子嫁接技术，将其他生物活性肽序列（如抗炎或抗菌肽）嫁接到MCoTI-II的环状骨架上，可开发新型多功能药物[3]。1.3环肽MCoTI-II应用的研究现状目前已有多位研究者对MCoTI-II进行了研究和报道。D’Souza及其研究团队[8]成功地将COG肽与超稳定的环肽支架MCoTI-II进行化学缀合，从而构建出一种新型的嫁接环肽MCOG。实验数据表明，MCOG对癌细胞具有显著的细胞毒性，并且在人血清中表现出极高的稳定性，这一研究结果进一步验证了环肽MCoTI-II在开发用于癌症治疗的肽药物领域的巨大应用潜力。Gray等[9]研究了南瓜Momordicacochinchinensis胰蛋白酶抑制剂家族（通过全化学合成产生）的环状微蛋白，发现MCoTI-II是一种高亲和力和高选择性的蛋白酶抑制剂，可有效地抑制了由膜蛋白酶（matriptase）介导的前肝细胞生长因子（HGF）的蛋白水解激活，还选择性抑制表达matriptase蛋白酶的前列腺癌细胞的侵袭。1.4环肽MCoTI-II的来源由于天然提取的MCoTI-II产量极其有限，其提取过程既复杂又成本高昂，难以满足大规模研究和应用的需求。然而，通过固相合成和重组表达技术，可以实现其规模化生产，而化学修饰与合成生物学技术则赋予其更高的靶向性和稳定性。通过化学合成或生物工程技术制备线性前体，不仅显著提高了产量，还降低了生产成本，为后续研究提供了充足的物质基础。目前，有文献报道可通过化学合成技术直接合成MCoTI-II或其衍生物，使用苯硫酚钠作为硫醇保护剂，并通过固相合成法构建MCoTI-II的线性前体，随后通过氧化环化反应形成二硫键。固相多肽合成法（SPPS）是制备复杂环肽的常用技术，可用于设计类似MCoTI-II结构的门控修饰毒素（GMTs）或提升其稳定性，例如通过分子接枝策略将其他序列整合到MCoTI-II主链中[10]。此外，还可以基于MCoTI-II的保守结构域设计新型类似物。例如，利用结构生物学数据指导多核苷酸设计，生成杂交多核苷酸片段以编码功能优化的MCoTI-II变体[11]，从而为开发新的药物和治疗手段提供可能。1.5本课题的研究意义及内容1.5.1研究意义目前，MCoTI-II主要依赖于天然提取和化学合成。植物中的MCoTI-II含量甚微，且分离纯化过程繁琐。化学固相合成已被用于MCoTI-II的体外合成，但存在价格昂贵和环境污染等问题，因此，探索绿色且高效的MCoTI-II合成方法仍为研究领域所亟需。采用微生物体外生产线性多肽已被广泛报道，然而，由于MCoTI-II本身的环状结构及其对宿主细胞的潜在毒副作用，有关MCoTI-II的体外重组表达研究鲜有报道。因此，旨在通过大肠杆菌体外重组表达MCoTI-II的线性前体，为其合成提供前提基础。研究结果可以弥补现有MCoTI-II合成技术的不足，减少对天然环肽资源和化学合成技术的依赖，并为开发高效的环肽合成提供了技术参考和理论依据，促进环肽及其衍生物在食品、生物医药等领域的应用。1.5.2主要研究内容本文首先设计并合成了MCoTI-II相关表达基因，构建了分别带有MBP、SUMO融合标签的表达载体，实现了其在大肠杆菌工程菌株的异源重组表达；进一步优化包括温度、IPTG浓度、OD600在内的诱导表达条件，然后超声波破碎菌体细胞，通过Ni-NTA分离纯化获取融合蛋白MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II；随后分别采用TEV和SUMO蛋白酶切割MBP和SUMO标签，联合应用亲和色谱和RP-HPLC分离纯化得到MCoTI-II线性前体，并应用MALDI-TOF-MS对获得的线性前体进行表征。2实验仪器和材料2.1菌株与质粒本实验所用菌株为E.coliDH5α和E.coliShuffleT7，均为本实验室保存。所用质粒如表2-1所示，pMAL-c6t、pET-28a-SUMO。表2-1本实验所用质粒名称描述生产厂家pMAL-c6t携带MBP标签基因本实验室保存pET-28a-SUMO携带SUMO标签基因本实验室保存2.2实验试剂本实验所用试剂如表2-2所示。表2-2实验试剂名称生产厂家DNAmarker南京诺唯赞生物科技股份有限公司高纯度低电渗琼脂糖擎科生物三羟甲基氨基甲烷（Tris）上海麦克林生化科技有限公司乙酸（冰醋酸）国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠,十二水合物上海麦克林生化科技股份有限公司二水合磷酸二氢钠上海麦克林生化科技股份有限公司蛋白胨OXOID酵母粉OXOID氯化钠国药集团化学试剂有限公司异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）Biosharp蛋白质marker南京诺唯赞生物科技股份有限公司考马斯亮蓝R250上海麦克林生化科技股份有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司浓HCl国药集团化学试剂有限公司氨苄青霉素赛国生物科技有限公司卡那霉素赛国生物科技有限公司甲醇国药集团化学试剂有限公司2.3实验仪器与设备本实验所用仪器与设备如表2-3所示。表2-3实验仪器与设备名称生产厂家PCR扩增仪BIO-RADJY300C型核酸电泳仪北京君意东方有限公司DYY-6C型蛋白电泳仪北京六一生物科技有限公司洁净工作台S-CJ-2FD苏净安泰空气技术有限公司通风橱广州赛福斯实验设备磁力搅拌水浴锅 常州恩培仪器制造有限公司高速冷冻离心机SigmaZentrifugen超声波细胞粉碎机宁波新芝生物科技股份有限公司THZ-98C恒温振荡器上海一恒科学仪器有限公司DRP-9162型电热恒温培养箱上海森信实验仪器有限公司高压蒸汽灭菌锅上海博迅医疗生物仪器股份有限公司紫外可见分光光度计BeckmanCoulterMicrofuge系列台式微量离心机BeckmanCoulter手动移液枪上海艾本德生物技术国际贸易有限公司JY043S-3C凝胶成像系统君意电泳海尔冰箱上海净信实业发展有限公司EasynLC1200高效液相色谱仪日本岛津仪器有限公司MALDI-TOF-MS日本岛津仪器有限公司2.4常用溶液和试剂的配制2.4.1蛋白胶染色液和脱色液的配制（1）染色液：提前配制好50%的甲醇（将100%的甲醇与超纯水以1:1（v/v）的比例混合），随后称取1g考马斯亮蓝R250，先溶于36mL冰醋酸中，搅拌至溶解，再加入364mL预配的50%甲醇溶液，持续搅拌至形成均一深蓝色溶液，保存备用。（2）脱色液：分别量取50mL无水乙醇、75mL冰醋酸和875mL超纯水，混合均匀后保存备用。2.4.25×SDS蛋白上样缓冲液的配制称取2g十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1g溴酚蓝（BPB），置于50mL的离心管内，依次向离心管中加入6mL浓度为1mol/L的Tris-HCl缓冲液以及10mL甘油，轻微振荡使其初步溶解。接着，向其中加入超纯水至溶液总体积约为35mL，再将离心管置于超声仪中进行超声处理，使SDS和溴酚蓝完全溶解。最后，继续加入超纯水将溶液定容至40mL，并充分混匀，保存备用。使用前取1mL加入50μL巯基乙醇混合均匀。2.4.3培养基的配制LB液体培养基：使用天平称取5g酵母粉、10g蛋白胨和10g氯化钠，将这些成分充分溶解于1L超纯水中，灭菌后保存备用。2.4.4抗生素及诱导剂IPTG的配制（1）氨苄青霉素（Amp）：称取0.5g氨苄青霉素粉末，置于15mL离心管中。随后，向该离心管内缓慢加入10mL超纯水，使其溶解完全，再使用0.22μm孔径的微孔滤膜进行无菌过滤，将过滤后的溶液按每管1mL的体积分装至无菌的1.5mLEP管中，置于-20℃低温冰箱中冻存。（2）卡那霉素（Kan）：称取0.5g卡那霉素，置于15mL离心管中。随后，向该离心管内缓慢加入10mL超纯水，使其溶解完全，再使用0.22μm孔径的微孔滤膜进行无菌过滤，将过滤后的溶液按每管1mL的体积分装至无菌的1.5mLEP管中，置于-20℃低温冰箱中冻存。（3）异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）：称取2.38gIPTG，置于15mL离心管中。随后，向该离心管内缓慢加入10mL超纯水，使其溶解完全，再使用0.22μm孔径的微孔滤膜进行无菌过滤，将过滤后的溶液按每管1mL的体积分装至无菌的1.5mLEP管中，置于-20℃低温冰箱中冻存。2.4.5蛋白质纯化缓冲溶液及透析液的配制（1）镍离子螯合亲和层析平衡缓冲液（50mmol/LTris-HCl，pH8.0）：使用分析天平称取6.057gTris，加入800mL超纯水搅拌溶解后，用浓HCl调节pH至8.0，用水定容至1L，-4℃冰箱中保存备用。（2）镍离子螯合亲和层析洗脱缓冲液（50mmol/LTris-HCl，500mmol/L咪唑，pH8.0）：在平衡缓冲液的基础上加入34.04g咪唑，其余方法一致。（3）透析液：磷酸缓冲液，使用分析天平分别称取10.7207g二水合磷酸二氢钠和10.7442g磷酸氢二钠·十二水合物溶于2L蒸馏水中，pH为6.5。3实验方法3.1MCoTI-II相关重组表达载体的设计由34个氨基酸组成的环肽MCoTI-II含有一个天冬氨酸残基Asp，因此，以该残基为连接位点进行开环设计MCoTI-II线性前体。具体思路为：以Asp残基为C末端氨基酸，在其羧基端添加HVHis6基序，得到由42个氨基酸组成的C末端为（D）HVHis6的MCoTI-II线性前体。3.2目的多肽基因片段的合成及重组表达载体的构建本实验所用到的引物如表3-1所示。表3-1本实验所用引物序列引物名称引物序列（5'-3'）Oligo1GGCGGTGTATGCCCGAAAATCCTGAAGAAATGCCGTCGCGATTCTGATTGTCCAGGTGCAOligo2TTGCACCAGCGATGGTCTCGGTGTCATTGGCAATGGTGCCGTCTATGTACGTGGACCTGMBP-MCoTI-II-FP1agaacctgtacttccaggggGGCGGTGTATGCCCGAAAMBP-MCoTI-II-RP1tcggatccgtcgacgatatcTCAAACGTGGTCGCTACCAGASUMO-MCoTI-II-FP2acagagaacagattggtggaGGCGGTGTATGCCCGAAASUMO-MCoTI-II-RP2cgacggagctcgaattcggaTCAAACGTGGTCGCTACCAGA线性化pMAL-c6t-FP3GATATCGTCGACGGATCCGA线性化pMAL-c6t-RP3CCCCTGGAAGTACAGGTTCTCC线性化pET-28a-SUMO-FP4TCCGAATTCGAGCTCCGTC线性化pET-28a-SUMO-RP4TCCACCAATCTGTTCTCTGTGAGC3.2.1MCoTI-II基因片段的合成将该线性前体的氨基酸序列输入DNAWorks工作网站（/dnaworks/），根据MCoTI-II的一级序列设计相关引物，得到基于大肠杆菌表达系统密码子优化的MCoTI-II线性前体全长基因的Oligo1-2片段，并委托有康生物科技有限公司合成。将引物干粉先离心（2600g、1min）再加入适量蒸馏水溶解至10µmol/L的初始浓度备用。利用重叠延伸PCR反应合成目的基因，反应体系和反应程序分别见表3-2和表3-3。表3-2PCR扩增程序组分添加量寡核苷酸引物2.0μL（4×0.5μL）2×PfuPCRMix10.0μL灭菌超纯水8.0μL总计20μL表3-3重叠延伸PCR合成基因片段反应体系程序温度时间循环数预变性94℃5min1变性94℃30s退火55℃30s28延伸72℃30s（1kbp）彻底延伸72℃5min1冷却4℃10min1将Oligo1-4片段合成后的目的基因作为模板，分别以表2-3中的MBP-MCoTI-II-FP1、MBP-MCoTI-II-RP1为上、下游引物，SUMO-MCoTI-II-FP2、SUMO-MCoTI-II-RP2为上、下游引物，在高保真PfuDNA聚合酶的作用下，利用重叠延伸PCR技术扩增合成携带同源臂的MCoTI-II线性前体目的基因片段，反应体系见表3-4，延伸时间为1min。表3-4第二轮PCR反应体系组分添加量FP1.0μLRP1.0μL第一轮重叠延伸PCR产物0.5μL2×PfuPCRMix25.0μL灭菌超纯水22.5.0μL总计50μL3.2.2目的多肽重组表达载体的构建分别以表3-3中的FP3、RP3为上、下游引物，FP4、RP4为上、下游引物，按照表3-5配制PCR反应体系，线性化扩增pMAL-c6t质粒和pET-28a-SUMO质粒。将3.2.1中所获得带有同源臂的多肽基因片段通过同源重组技术连接至线性化载体中，构建pMAL-c6t-MCoTI-II、pET-28a-SUMO-MCoTI-II重组表达载体。按照表3-6配制目的片段和线性化载体同源重组反应体系。表3-5载体线性化扩增反应体系组分添加量FP0.5μLRP0.5μLpMAL-c6t或pET-28a-SUMO0.5μL2×PfuPCRMix10μL灭菌超纯水8.5μL总计20μL表3-6同源重组反应体系组分添加量目的基因片段6.0μL载体模板片段2.0μL5×Mix连接酶2.0μL总计10μL3.2.3连接产物的转化（1）将储存于-80℃超低温冰箱中的E.coliDH5α感受态细胞取出，置于冰上进行解冻。（2）解冻完成后，用移液枪吸取适量的连接产物加入感受态细胞中，温和地混匀后，继续在冰上孵育30分钟。（3）将混合体系置于42℃恒温水浴中进行90秒的热激处理。（4）热激处理完毕后，迅速将混合体系转移回冰上，静置5分钟。（5）向体系中加入700μL不含抗生素的LB液体培养基，充分吹打以混匀，然后将其置于37℃摇床中，以220rpm的转速培养1小时。（7）使用离心机在6000rpm条件下离心2分钟，弃去上清液，用剩余液体重新悬浮菌体。采用平板涂布专用玻璃珠对菌液进行稀释涂布，并将平板置于37℃条件下倒置培养过夜。3.2.4阳性菌的鉴定挑取单克隆菌落于10μL水中重悬，取5μL菌悬液置于一个新的管中，加入通用引物与扩增酶，分别配制反应体系并设置程序，进行菌落PCR反应。使用核酸凝胶电泳检测是否得到目的条带，如有则为阳性克隆。为了进一步验证，将对应条带的另外5μL菌液接种于含对应抗生素的LB培养基中，放37℃摇床中培养过夜，取适量送公司测序。3.3MCoTI-II重组蛋白的表达与鉴定3.3.1表达载体的转化将构建成功的重组质粒按照3.2.3中的方法转化至工程菌E.coliShuffleT7（工程菌E.coliShuffleT7按照3.2.3中方法制备）中，热激复苏后过夜培养即可得到目的菌株。3.3.2重组多肽的诱导表达种子液制备：将含有MBP标签和SUMO标签的重组质粒转化后获得的单菌落分别接种于添加了氨苄青霉素或卡那霉素的5mLLB液体培养基中，置于37℃恒温摇床（200r/min）振荡培养12小时，获得种子液。扩大培养：按1:100比例将种子液转接至扩大培养基，相同条件下培养至OD600达到最适值。诱导表达：加入最适终浓度的IPTG诱导剂，在优化后的最适表达温度和200r/min转速下持续诱导18小时，最终通过SDS电泳分析目标蛋白的表达水平。3.3.3MCoTI-II重组蛋白表达条件的优化（1）表达温度利用紫外分光光度计测定菌液在波长为600nm处的吸光度，当吸光度达到0.6-0.8时，向菌液中添加IPTG诱导剂，使其最终浓度达到0.2mmol/L。随后在16℃、20℃、25℃、37℃的温度条件下，以200r/min的速度继续培养18小时。参照3.2.4中的方法对菌体进行破碎，再参考3.2.5的方法对不同表达温度下重组蛋白的表达情况进行。（2）诱导剂浓度使用紫外分光光度计对菌液OD600进行测量，当吸光值达到0.6-0.8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度分别为0mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L，选择3.2.3中最佳的表达温度、200r/min的恒温摇床中培养18h后，参照3.2.4中的方法对菌体进行破碎，再参考3.2.5的方法对不同浓度诱导剂下重组蛋白表达情况进行分析。（3）OD600值使用紫外分光光度计对菌液OD600进行测量，分别控制菌液OD600为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2，选择3.3.3（1）中最佳表达温度以及3.3.3（2）中最佳表达诱导剂浓度，200r/min的恒温摇床中培养18h后，参照3.3.4中的方法对菌体进行破碎，再参考3.3.5的方法对不同浓度诱导剂下重组蛋白表达情况进行分析。3.3.4菌体破碎（1）离心处理：将收集的菌液置于离心机中，在4℃温度条件下，以8000rpm的转速离心10分钟，倒去上清液。（2）菌体重悬与超声波破碎：向离心所得的菌体沉淀中以1:10（w/v）的比例加入平衡缓冲液，使菌体重新悬浮形成均匀的菌悬液，并将其放置于碎冰中进行冰浴，以维持低温环境。随后，利用超声细胞破碎仪对菌悬液进行破碎处理。具体参数设置为：总破碎时长为10分钟，超声波作用3秒后暂停3秒，如此循环；振幅设定为3，工程级别设为1，功率设置为30%。（3）样品处理及SDS分析：取50µL经过超声破碎处理的样品，作为诱导表达后的总蛋白用于后续分析。接着，对剩余的菌液进行二次高速离心，离心条件为4℃、8000rpm、15分钟。离心结束后，分离出上清液以备后续纯化。分别取50µL上述超声破碎后的样品和上清液用于进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）分析。3.3.5SDS电泳分析（1）凝胶配制（参照表2-7的配方）：先配制12%分离胶，再用乙醇液封压平分离胶。待分离胶和乙醇之间形成一条较明显的分界线时，此时表明分离胶已凝固，吸干分离胶上的水，再注入5%浓缩胶，立刻插入上样梳。（2）样品处理：向50µL待测样品中加入10µL的5×蛋白上样缓冲液，用移液枪吹打数次使二者充分混合均匀。再把混合好的样品溶液放入金属浴中，温度设置为98℃，加热时间为10分钟，使蛋白在高温下充分变性，为后续实验做准备。（3）电泳：取5µL变性后的蛋白样品缓慢加到凝胶孔中，先用低电压80V电泳20min，待样品呈现平齐直线时，将电压切换为150V。（4）染色：从凝胶板上剥离下凝胶，将其转移至玻璃器皿中，加入适量染色液至没过凝胶，加热1分钟后震荡染色30分钟。（5）脱色：缓慢倾倒出玻璃皿中的染色液，再用纯水充分冲洗凝胶，确保无染色液残留，此过程中应当小心避免凝胶被带出或破损。再向玻璃皿中加入配制好的脱色液，使凝胶完全浸没，加热1分钟左右。加热完成后，迅速转移至摇床上进行震荡脱色。每隔5-10分钟更换一次脱色液，重复此脱色操作多次，待凝胶呈无色透明状即可。（6）观察：将脱色到呈无色透明状的凝胶置于照灯下观察条带情况。表2-7SDS凝胶配方组分5%（v/v）浓缩胶12%（v/v）分离胶超纯水0.68mL1.6mL30%Acrylamide0.17mL2.0mL1.0MTris-HCl（pH6.8）0.13mL-1.0MTris-HCl（pH8.8）-1.3mL10%SDS0.01mL0.05mL10%过硫酸铵0.01mL0.05mLTEMED0.001mL0.002mL总计1mL5mL3.4MCoTI-II重组蛋白的分离纯化MCoTI-II重组蛋白的C端携带His-tag标签，该标签能与二价金属离子（例如Ni2+或Zn2+）形成螯合物。利用镍离子金属螯合亲和层析柱，可以有效地分离和纯化带有组氨酸标签的蛋白。在蛋白纯化过程中，咪唑会与重组蛋白争夺镍离子。通过逐步增加咪唑浓度，重组蛋白能够从层析柱中被逐级洗脱，从而实现蛋白的分级洗脱和纯化。具体操作步骤为：用超纯水清洗纯化系统和层析柱，再用平衡缓冲液冲洗以平衡层析柱，待离子强度与紫外强度稳定，然后用样品泵将上清液上样，上样完毕后以梯度洗脱的方式洗脱目的蛋白，收集各溶液组分，按照3.3.5中的方法进行SDS分析蛋白纯化结果。3.5线性多肽的制备3.5.1MCoTI-II重组蛋白的酶切获得的重组蛋白装入500Da的透析袋中，4℃下在Tris-HCl缓冲液（1M，pH8.0）中透析4-5h去除咪唑后，随后将TEV蛋白酶与重组蛋白MBP-MCoTI-II以1:100(w/w)的比例加入TEV蛋白酶，将SUMO蛋白酶与重组蛋白SUMO-MCoTI-II重组蛋白以1:100(w/w)的比例加入SUMO蛋白酶，分别置于30℃的条件下进行酶切2h，取酶切前与酶切后的组分，利用SDS凝胶电泳分析酶切效果。3.5.2酶切产物的分离纯化分别取充分酶切后的溶液，使用镍离子螯合亲和层析分离目的蛋白与标签蛋白，操作步骤为：依次使用蒸馏水与平衡缓冲液清洗纯化系统，待离子强度与紫外强度稳定后注入样品，上样完毕后先用低浓度咪唑（20mM，pH8.0）洗杂，再用高浓度咪唑（500mM，pH8.0）洗脱层析柱，收集各溶液组分，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化情况，后根据最终洗脱液的浓度和体积，按照2.4.7（3）中的方法配制一定量体积的磷酸缓冲液作为透析液进行透析，尽可能降低咪唑浓度，透析完毕后于-80℃冷冻保存，以备后续实验的进行。3.5.3酶切后分离纯化产物的鉴定分别取MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II重组蛋白酶切后的分离纯化产物，使用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行产物分析。色谱条件：流动相A是含0.1%三氟乙酸（TFA）的超纯水，流动相B为含0.1%TFA的乙腈；洗脱梯度为20%至43%的线性递增，流速设为0.8mL/min，进样量20μL，检测波长214nm，柱温25℃。收集RP-HPLC洗脱过程中出现的各个峰的溶液，用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）鉴定。质谱检测步骤：用移液枪吸取2μL液相洗脱峰溶液点到MALDI靶板上，再吸取1μL羟基肉桂酸基质溶液滴加在样品表面，待其风干后，将靶板放入质谱仪进行测定，以明确目标肽段的分子量等质谱信息。4实验结果与分析4.1目的多肽基因片段的合成及重组表达载体的构建4.1.1MCoTI-II线性前体的设计以Asp残基为连接位点进行开环设计MCoTI-II线性前体。以Asp残基为C末端氨基酸，在其羧基端添加HVHis6基序，得到由42个氨基酸组成的C末端为（D）HVHis6的MCoTI-II线性前体，如图4-1所示。图4-1MCoTI-II开环设计策略图4.1.2MCoTI-II线性前体的重组表达载体的设计为了提高重组蛋白的可溶性，并便于表达后促溶标签的切除，选用MBP和SUMO融合至MCoTI-II的N端，按照如图4-2所示的设计思路构建了2种重组蛋白MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II。所有重组蛋白的C末端均以DHVHHHHHH结尾，目的蛋白C末端携带组氨酸标签，可用于金属螯合层析分离纯化。图4-2MCoTI-II重组表达策略示意图4.1.3MCoTI-II线性前体重组表达载体的构建经过第一轮重叠延伸PCR扩增反应可合成目的基因，将合成的目的片段作为模板，在高保真PfuDNA聚合酶的作用下，经第二轮PCR反应得到带有同源臂的目的片段，通过琼脂糖凝胶电泳分析。如图4-3所示，在电泳图谱中出现单一的条带，参照Marker，可看出条带位置大小与目的基因片段大小相符，表明目的基因片段扩增成功，后续将利用此片段进行载体构建。图4-3MCoTI-I片段PCR扩增结果（M：Marker；1：MCoTI-II片段；2：SUMO-MCoTI-II片段；3：MBP-MCoTI-II片段）图4-4的琼脂糖凝胶电泳分析显示，图谱中呈现亮度高的扩增条带，在6000-7000bp的位置出现一条明亮条带，该分子量与理论预期的线性化载体吻合，说明已成功扩增出质粒线性化目标产物。图4-4载体线性化PCR扩增结果4.1.4阳性菌的鉴定与基因测序鉴定同源重组通过分子级的“剪切-粘贴”机制，其基本原理是利用质粒载体线性化片段与目标基因片段之间15-20个碱基对（bp）的同源序列进行识别和配对，从而实现载体线性化片段和目的基因片段的精确连接。当完成同源重组反应，成功将目的基因片段与载体片段连接后，接下来需要筛选出克隆成功的菌株。这一步骤借助菌落PCR反应来完成。不同的质粒具有不同的抗性基因，可作为筛选的“标签”。pMAL-c6t质粒含有氨苄青霉素抗性基因，因此使用含氨苄青霉素的LB固体培养基筛选pMAL-c6t-MCoTI-II重组菌株；pET-28a质粒携带卡那霉素抗性基因，对应筛选时需添加卡那霉素至固体培养基中。将重组菌株接种至含相应抗生素的平板上，待培养至菌落生长至适宜密度、丰度理想时，从平板上挑选生长状态良好、形态典型的单菌落，运用菌落PCR技术进行快速鉴定：以载体特异性测序引物对目标片段进行扩增并通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物大小，依据电泳条带所呈现的扩增产物大小，初步判定载体是否构建成功。为了确保基因序列的准确性，后续仍需开展测序验证工作，以最终确认基因序列的准确性。将菌落PCR筛选出的菌落过夜培养，提取质粒后 送至公司进行基因测序，随后使用DNAMAN软件将测序序列与理论序列进行比对，MBP-MCoTI-II比对结果如图4-5所示，SUMO-MCoTI-II比对结果如图4-6所示，经过分析结果显示其与理论序列基本一致，表明重组表达载体成功构建。图4-5MBP-MCoTI-II基因测序比对结果图4-6SUMO-MCoTI-II基因测序比对结果4.2MCoTI-II重组蛋白的表达与鉴定为了提高目的蛋白的诱导表达量，对诱导表达条件进行了优化，优化条件分别为温度、诱导剂浓度和OD600，确定最佳的诱导表达温度、诱导剂浓度和OD600，优化过程采取少量表达，观察各条件下目的蛋白条带的变化趋势，可选出最佳诱导表达条件。采用ProtParam在线软件分析，重组蛋白MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II的理论分子量分别为44.86kDa、23.36kDa。（1）诱导表达温度温度对宿主细胞生长和蛋白质表达的影响是分子生物学和生物技术领域广泛研究的主题。有研究表明，重组大肠杆菌BL21(DE3)分别在37℃和30℃条件下的生长及表达特性表现出明显的差异。在30℃培养环境下，重组大肠杆菌BL21（DE3）的增殖速率呈现相对迟缓的特征，但质粒稳定性和目标产物产率较高。这可能归因于较低的温度减缓了细胞的新陈代谢，从而减少了错误折叠蛋白的累积[12]。该研究结果提示，为提升MCoTI-II线性前体的溶解度、生物活性及长期稳定性，采用低温诱导表达策略可能更具优势。高温可能通过激活应激响应降低重组表达效率，这为优化重组蛋白生产条件提供了理论依据，即通过调控温度平衡细胞生长和蛋白折叠质量，是实现高活性可溶性蛋白高效表达的关键。为了确定MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II这两种重组蛋白的最佳表达温度，设置了四个温度诱导梯度，分别为：16℃、25℃、30℃、37℃。温度对MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II两种重组蛋白表达量影响的SDS分析结果如图4-7所示，由图可知，在16℃、25℃、30℃、37℃下，MBP-MCoTI-II融合蛋白均有表达，但可看出16℃下蛋白的表达量明显低于其他温度，而25℃、30℃、37℃下重组蛋白的表达量基本无明显趋势，故重组蛋白MBP-MCoTI-II的最适诱导表达温度为25℃；对于SUMO-MCoTI-II重组蛋白而言，其在16℃、25℃、30℃、37℃下也均有表达，并且随着温度的升高重组蛋白的表达总量逐渐减少，故重组蛋白SUMO-MCoTI-II的最适诱导表达温度为16℃。图4-7温度对MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II重组蛋白表达量的影响（2）诱导剂浓度外源基因的表达除了受诱导温度的影响外，还与诱导剂浓度相关。研究表明，在重组木聚糖酶的表达中，诱导剂浓度过高（如1.0mmol/LIPTG）会导致菌体提前进入衰亡期，降低酶产量[13]。高浓度诱导剂可能引发宿主细胞的代谢负担或毒性效应。例如，在豹蛙酶（Onconase）的重组表达中，IPTG浓度超过0.5mmol/L会导致菌体裂解，产物稳定性下降[14]。这表明，MCoTI-II线性前体的重组表达需通过实验确定最佳IPTG浓度，以平衡细胞生长与蛋白表达需求。为了确定MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II这两种重组蛋白的最佳表达诱导剂浓度，设置了六个IPTG诱导剂终浓度梯度，分别为：0mmol/L、0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L。不同诱导剂浓度对MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II两种重组蛋白表达量影响的SDS分析结果如图4-8所示。由图可知，在未加诱导剂的情况下，两种重组蛋白均不表达。自添加诱导剂起，MBP-MCoTI-II重组蛋白的产量随着IPTG浓度的提升而增加。当IPTG的最终浓度达到0.2mmol/L时，重组蛋白产量达到峰值，进一步提高IPTG浓度，重组蛋白的产量不再有显著提升。对于SUMO-MCoTI-II重组蛋白来说，加诱导剂后重组蛋白均有表达。从图中可以清晰看出，IPTG浓度为0.2mmol/L时，SUMO-MCoTI-II重组蛋白的产量最高。因此，在诱导剂IPTG终浓度为0.2mmol/L时，MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II这两种重组蛋白表达量最多。图4-8诱导剂浓度对MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II重组蛋白表达量的影响（3）OD600值在重组蛋白表达系统中，OD600通常用于确定诱导剂（如IPTG）添加的最佳时机，以平衡细胞生长与外源蛋白表达效率。当OD600值过高（如＞1.0）时，宿主细胞（如大肠杆菌）可能因营养耗尽或代谢废物积累进入稳定期或衰亡期，导致重组蛋白表达效率下降。若OD600值过低（如＜0.4），宿主细胞的生物量不足可能限制目标蛋白的总产量，同时启动子泄漏（基础表达）可能导致质粒不稳定或细胞毒性。为了确定MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II这两种重组蛋白的最佳OD600，设置了六个菌液OD600值梯度，分别为：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2。OD600值对MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II两种重组蛋白表达量影响的SDS分析结果如图4-9所示。由图可知，随着OD600逐渐增加，MBP-MCoTI-II的表达量也逐渐增加，当OD600达到0.8时，重组蛋白的表达量最多，即使OD600继续增加，重组蛋白的表达量反而减少；对于SUMO-MCoTI-II而言，其表达量也随着OD600的增加而逐渐增加，但当OD600达到1.0、1.2时，杂蛋白也较多，因此，该重组蛋白后续的表达将在OD600达到0.8左右时开始加诱导剂。图4-9OD600值对MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II重组蛋白表达量的影响综合诱导表达条件优化的结果，MBP-MCoTI-II重组蛋白的最适诱导表达条件为：诱导温度25℃、诱导剂IPTG终浓度0.2mmol/L、OD600为0.8；SUMO-MCoTI-II重组蛋白的最适诱导表达条件为：诱导温度16℃、诱导剂IPTG终浓度0.2mmol/L、OD600为0.8。MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II这两种重组蛋白在此条件下进行表达，表达后的重组菌株按照3.2.4中的方法对菌体进行破碎，收集破碎后的上清作为总蛋白，再按照3.3中的方法进行镍离子螯合亲和层析分离.4.3MCoTI-II重组蛋白的酶切与酶切产物的分离纯化重组蛋白MBP-MCoTI-II采用TEV酶切除MBP标签蛋白，SUMO-MCoTI-II则采用SUMO蛋白酶切除SUMO标签蛋白。在酶切处理后的混合体系中，存在标签蛋白和目标多肽。MBP-MCoTI-II与SUMO-MCoTI-II重组蛋白的C末端都附着有His标签，因此，利用镍离子螯合亲和层析柱来实现它们的分离。目标蛋白能够与镍离子亲和层析柱结合，并最终在洗脱液中被收集。与此同时，标签蛋白无法与镍离子螯合亲和层析柱结合，因此它们会被收集在穿透液中。使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对重组蛋白酶切前、酶切后总组分、穿透液、洗脱液进行分析，结果如图4-10所示。由图可知，重组蛋白MBP-MCoTI-II酶切后的体系中有标签蛋白MBP、少部分未酶切完全的重组蛋白MBP-MCoTI-II，以及在14.4kDa以下位置出现新的小分子蛋白条带，即为目的蛋白MCoTI-II，表明酶切效果良好。纯化穿透液中出现标签蛋白且条带单一，而洗脱液中则出现目的蛋白、少量标签蛋白和部分未酶切完全的重组蛋白，目的蛋白的条带较粗，其余产物条带相对目的蛋白都较浅，表明酶切产物的分离效果良好。而在重组蛋白SUMO-MCoTI-II酶切后的体系中，原重组蛋白条带消失，只出现标签蛋白SUMO和目的蛋白MCoTI-II，说明酶切效果较好。纯化穿透液中只出现标签蛋白条带且条带单一，而洗脱液中只出现目的蛋白，说明酶切产物的分离效果较好。图4-10MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II重组蛋白酶切前后对比及酶切产物的分离纯化4.4MCoTI-II重组蛋白酶切后分离纯化产物的鉴定使用RP-HPLC分析MBP-MCoTI-II酶切后分离纯化的洗脱液。RP-HPLC图谱如图4-11所示，由图可知，在洗脱液的分析图谱中，仅当保留时间为11.60min时出现单一高峰，说明MCoTI-II在于洗脱液中，而在保留时间为21.9min时出现的的低峰，可能为未酶切完全的重组蛋白。图4-11MBP-MCoTI-II酶切后纯化洗脱液的RP-HPLC图谱SUMO-MCoTI-II酶切后分离纯化洗脱液的RP-HPLC分析图谱如图4-12所示，由图可知，在洗脱液的分析图谱中，仅当保留时间为12min时出现单一峰，说明MCoTI-II存在于洗脱液中。图4-12SUMO-MCoTI-II酶切后纯化洗脱液的RP-HPLC图谱收集两个高峰分离产物，进行MALDI-TOF/MS鉴定，结果如图4-13所示，显示出单一分子量4522.35Da，与MCoTI-II-HVHis6线性前体的理论分子量4536.12Da接近，收集该组分冷冻干燥保存。图4-13酶切产物的MALDI-TOF/MS鉴定图谱5结论与展望5.1结论本论文成功实现了药用环肽MCoTI-II线性前体在大肠杆菌中的异源表达与纯化，并对其进行了鉴定。（1）通过以Asp残基为连接位点设计MCoTI-II线性前体，并在其羧基端添加HVHis6基序，利用重叠延伸PCR技术合成了MCoTI-II线性前体的基因片段。通过同源重组技术，成功构建了带有MBP和SUMO融合标签的重组表达载体，并转化至E.coliShuffleT7中进行诱导表达。（2）经过对诱导表达条件的优化，确定了MBP-MCoTI-II和SUMO-MCoTI-II重组蛋白的最佳表达条件，分别为25℃、IPTG终浓度0.2mmol/L、OD600为0.8和16℃、IPTG终浓度0.2mmol/L、OD600为0.8。利用镍离子螯合亲和层析技术成功纯化了重组蛋白，并通过TEV和SUMO蛋白酶分别切除MBP和SUMO标签，获得了MCoTI-II线性前体。（3）通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS）对获得的MCoTI-II线性前体进行了鉴定，结果显示其分子量为4522.35Da，与理论分子量一致，且纯度达到90%以上。本研究不仅为MCoTI-II环肽的高效合成提供了前提基础，也为其他环肽类药物的表达与纯化提供了技术参考，具有重要的学术价值和应用前景。5.2展望尽管本项研究在MCoTI-II线性前体的异源表达和纯化方面取得了一定进展，但依旧面临一些问题和挑战，需要进一步解决。未来的研究可以从以下几个方面进行深入探索：增加表达量：即便某些诱导表达条件已经得到优化，MCoTI-II线性前体的表达量仍有提升的空间。通过进一步优化表达系统、挑选更高效的菌株或探索其他表达策略，可以增加表达水平。同时，也可在此基础上对其他诱导表达条件进行优化，例如对诱导表达时间进行优化。简化纯化流程：目前的纯化流程较为繁琐，涉及众多步骤和多种纯化技术。未来的研究应致力于探索更简便、高效的纯化途径，旨在降低