CN113795594B 核酸扩增和识别方法 （莱克斯奥根有限公司）

2021.06.11PCT/EP2019/08509520WO2020/120747EN2020.06.18US2018163201A1,2018.06.14本发明提供了一种生成核酸模板的标记的板特异性方式延伸至少一种寡核苷酸引物从而5’端或达到与延伸产物下游的模板核酸退火的2使至少两种寡核苷酸引物与所述模板核酸退火，其中止子，且所述至少两种寡核苷酸引物能在其3’端引发延伸反应并包含不与模板退火的部物到达(a)模板核酸的5’末端或到达(b)与延伸产物下游的模板核酸退火的作为核酸延伸述识别序列不与作为延伸终止子的寡核苷酸引物杂交且不3.权利要求2的方法，其中非模板化的核苷酸通过聚合酶的末端转移酶活性来添加，和/或在至少70%的延伸产物中添加了1~14.权利要求1或2的方法，其中在连接步骤中提供并使用具有不5.权利要求4的方法，其中在连接步骤中提供并使用具有不同识别序列的至少50种衔7.权利要求1或2的方法，使用至少9种具有不同的与模板退火的退火序列的作为延伸8.权利要求7的方法，使用至少49种具有不同的与模板退火的退火序列的作为延伸终10.权利要求1或2的方法，其中衔接子核酸上识别序列之外的部分与作为延伸终止子11.权利要求10的方法，其中当衔接子核酸与作为延伸终止子的寡核苷酸引物结合或酸引物与模板退火的退火序列。序列包含与模板中的oligo(A)序列退火的oligo(16.权利要求15的方法，其中所述oligo(T)序列包含一个或多个与oligo(A)序列不同3酸引物包含一种或多种提高与模板退火的退火序列的解链温度的修饰21.权利要求1或2的方法，其中至少2种包含不4[0003]US2010/0273219A1描述了用于条形码识别(barcoding)靶核酸的多引物扩增方[0005]WO2013/038010A2描述了一种使用寡核苷酸引物和终止子生成模板核酸的扩增核酸部分的方法，以防止链置换和被用于生成测序用核酸部分的聚合酶通读(read_[0006]WO2014/071361A1描述了一种使用条形码化衔接子核酸制备双条形码核酸的方[0007]US2014/0274729A1描述了一种使用具有链置换活性的DNA聚合酶产生cDNA文库[0010]WO2016/138500A1描述了一种对测序用核酸进行条形码识别的方法。随机的独特分子标识符附加至RNA分子，为每个输入分子建立一个特有的身份。这使得消除后续自相同输入分子的相同拷贝(Senaetal.,ScientificRepor列片段分配和组装成与模板核酸序列相对应的一条合并序列(joinedsequence)变得容5与结合至模板上的寡核苷酸(本文中也称延伸终止子6部分可用于与其他寡核苷酸退火和/或当扩增片段被进一步扩增以产生其拷贝时用于上述产生延伸产物(互补序列)。此类反应是本领域标准的并且通常使用聚合酶。如果模板是延伸反应到达与延伸产物下游的模板核酸退火的核酸延伸终止子时或当延伸产物到达模板核酸退火的核酸延伸终止子时，延伸反应也停止。这种停止的反应详见WO2013/7链置换活性)的优选方法和措施都是使用包含一个或多个修饰核苷酸的延伸终止子，这些核苷酸升高退火序列的解链温度以与模板(与模板退火[0026]优选地，在延伸反应之后，未与模板结合的引物和终止子在纯化步骤中被去(内参RNA变体)序列(参见例如ERCC，BMCGenomics20056：150；Jiang等人，Genome优选整个衔接子核酸)与模板退火的最简单且最优选的方法是简单地在延伸反应后提供衔8[0028]防止识别序列与终止子退火的最优选选择是终止子的部分和衔接子的部分携带自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)RNA连接酶、耐热App一连接酶双链连接酶。也可以将用于不同反应的连接酶组合在一个反应体积中以便进行平行反应，DNA连接酶和RNA连接酶或单链连接酶和双链连接酶。连接酶反应通常涉及一个磷酸残基，扩增，产生所得标记扩增片段的拷贝。这样的进一步扩增通常涉及使用与标记的扩增片段列依赖性扩增偏差的影响。在优选的实施方案中，识别序列是在进一步扩增之前与延伸产分布并且它们的数量远大于完全相同(identical)延伸产物的数量，那么相同(same)的识增后特有(distinct)识别序列的数量与进一步扩增前的数量相同。本发明的识别序列也可以如Sena等人针对UMI所描述的那样(ScientificReports(2018)8:13121)使用。在下一代测序方法和进一步的序列分析中，标记片段的整个序列或整个序列的一些部分可被视为数据分析也可能变成对模板分子和片段的定量分析，这在特定模板拷贝被过多代表或代表9本发明进一步包括组装独特扩增片段的序列的步骤，其中的标记用于鉴别独特扩增片段。装或任何其他数据分析步骤中进行重复(duplicate)和复制子识别(replicate这种活性在逆转录酶中最为突出，例如M_MLV(鼠白血病病毒)逆转录酶或AMV(苜蓿花叶病的添加可用于识别模板序列5’端在模板化重复序列和非模板化随机添加之间的过渡处的列相对于衔接子序列的恒定部分的位置毫不含糊地鉴别出识别序列。衔接子可具有不同的识别序列。这允许对衔接子和它们所连接的生成片段进行独特识别。部分的随机合成而具有高度不一致的不同序列的混合物。随机序列可能覆盖所述序列的4(其中每个可能的序列都被代表)由46＝4096个不同序列组成。识别序列应该不与模板结种对特定区域的靶向优选在转录物(RNA)或基因(gDNA)作为模板时使用。当用在基因检测他变化的模板序列。覆盖整个模板的片段。此外，这也意味着使用与模板分子的不同部分结合的终止子/引物时得到保证，即任何衔接子都可以与任何终止子结合oligo(A)序列退火的oligo(dT)序列。优选所述oligo(dT)序列包含一个或多个不同于识别序列不与延伸终止子杂交，优选其中衔接子核酸与延伸终止子结合、杂交或不结合，发明的实验室可获得的。重要的部分是衔接子/终止子的设计，特别是衔接子上的识别序[0043]上述所有优选实施方案可以组合。这样的一种方法使用随机引物(带有接头序板杂交)的纯化以去除未结合的引物和终止子。然后带有接头和识别序列的衔接子与延伸映射到参考序列中相同位置的属于微小测序误差的测序读取值是来自不同模板分子或来[0044]识别序列(如UMI)也可以将个体之间的真实SNP(单核苷酸多态性)与逆转录期间或早期PCR循环中引入(随后被放大)的误差(突在RT期间引入修饰的碱基、导致错误掺入并因此引入误差的RNA编辑事件可以更可靠地被增的标记片段中的不同标记可用于识别独特更上游(5’)位置杂交。当逆转录酶延伸Pn到达引物Pn+1时，聚合酶反应将被WO2013/[0053]图2a)显示了由SDS+连接方法生成的文库。含UMI的部分互补L2衔接子(参考图1)Bioanalyzer(AgilentTechnologies,Inc.)上运行的HSDNAAssay的凝胶照片。b)使用的衔接子寡核苷酸(SEQIDNo.10)生成的复制子文库的凝胶照片和电泳图。照片来自在Bioanalyzer(AgilentTechnologies,Inc.)上运行的HSDNA非模板化的核苷酸(nt)可以作为含有L1的引物Pn+1的杂交位点。与部分杂交的L2一起，添加的碱基和错配碱基的情况下分析读取值。以灰色标记的核苷酸对应于ERCC_0130标注UltraTMIIdirectionalRNALibrary目录号E7760S)或SDS/连接方法制备文库，在IlluminaNextSeq500上测序(双端读取，文库制备方法时无法解析。使用图3a_c)所示SDS+连接方案生成的文库在IlluminaNextSeq500上测序(成对末端，150bp)。常规文库是用TruSeqStrandedTotalRNALibraryPrepHuman/Mouse/Rat，Illumina目录号20020596或20020597按说明书来制备(＝常规1)或用NEBNext@UltraTMIIdirectionalRNALibraryPrepKitfor值被映射到已知序列的ERCC内参RNA。所有测出的ERCC的累积映射读取值的归一化覆盖率被绘制为相对于转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TES)的核苷酸绝对位置，由虚线标上所述的SDS+连接方案或常规文库制备产生。b)映射到gapdh的读取值在不修剪添加的碱注和手动确定的TSS用箭头指示在以黑粗体显示的标注共有序列处。[0060]从含有SIRVSet3内参对照混合物(Lexogen，目录号#051.0N)的通用人类参考RNA(AgilentTechnologies,目录号#740000)按说[0071]逆转录(RT)后，样品用固相可逆固定(SPRI)和磁性纯化珠(AMPureBeads；Triton_x100、50μg/mlBSA和20单位的连接酶(单链特异性连接酶和/或双链特异性连接的互补序列。[0074]从含有SIRVSet3内参对照混合物(Lexogen，目录号#051.0N)的通用人类参考件进行，但提供的衔接子寡核苷酸不包含与用于引发逆转录反应的延伸起始子互补的序在清理后被扩增。图2c)显示了用非杂交延伸起始子和衔接子寡核苷酸产生的两个复制子[0076]实施例3：因末端转移酶活性和UMI_接头与第一链cDNA片段的ss连接而改进的5’[0077]从含有SIRVSet3内参对照混合物(Lexogen，目录号#051.0N)的通用人类参考库制备与本发明的覆盖范围的比较见图3e。覆物已根据随机核苷酸的常规分布而包含了一部分富含T的引发序列和只含T的引发序列(例[0082]文库通过SDS+连接制备，仅使用随机引发置换终止引物、或使用其与各种量的两种常规文库制备方法使用同样的核糖耗尽的通用人类参考RNA：TruSeqStrandedTotalRNALibraryPrepHuman/Mouse/Rat，Illumina目录号2002051)或UltraTMIIdirectionalRNALibraryPrepKitforIllumina@,NewEngland已知转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TES)而言的绝对核苷酸位置上的累积的映射的[0140]nnnnnnnnnnnnag[0253]cctttggggaattcga[0262]caaaacgggaattcga[0271]agtggtgggaattcgagctcgcattttgaa[0280]caaaatgggaattcga[0289]tcggacgggaattcga[0298]ggggacgggaattcga[0307]cccgaggggaattcga[0316]aatacagggaattcgagctcgcattttgaa[0325]caaaatgggaattcga[0370]gggaattcgagctcgc[0379]aagatctcgcattttg[0477]gctcgcattttgaaaa