环境微生物实训教学课件171

实训一光学显微镜的使用和微生物形态观察

一、目的要求1．学习普通光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。2．学习并掌握油镜的原理和使用方法。3．掌握微生物临时装片制作技术。二、器材1.菌种：啤酒酵母。2.溶液或试剂：香柏油、二甲苯3.仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种环等三、实验操作步骤（一）显微镜操作1、光学显微镜的结构结构：机械系统光学系统：反光镜：向内移，光线减弱，向外移，光线加强

虹彩光圈：向左关闭，向右开启，并增强光线。聚光器：向上光线增强，向下减弱2、显微镜的使用方法用光学显微镜观察微生物形态时，一般遵循先低倍镜观察，后高倍镜观察，再油镜观察。1）低倍镜操作方法斜面注视，将载物台上升至距接物镜0.5cm处-->左眼注视，用粗调焦螺旋缓慢下降载物台（或上升接物镜）-->直至出现物象为止再用微调焦螺旋调至清晰2）高倍镜操作方法将低倍镜观察到的目标移动至视野中央-->将低倍镜镜头转换成高倍镜镜头-->用微调焦螺旋调至清晰。注意：高倍镜观察时，光线需增强。3）油镜的操作方法将高倍镜观察到的目标移动至视野中央将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴石蜡油将油镜镜头移动至视野中央，让油镜镜头浸入石蜡油（至油晕不再扩大为止）用微调焦螺旋调节至清晰注意：油镜的操作需要较强的光线，故需将光线调至最强。油镜用后处理：第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的镜油第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去头上残留的油迹第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

1.制作酵母菌临时装片2.低倍镜观察3.油镜观察（二）制作临时装片观察酵母菌四、实验报告绘制酵母菌图五、思考题1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？2、油镜用后如何处理？实训二培养基的配置及玻璃器皿的包扎一、目的

1、掌握培养基的制备方法。

2、掌握高压蒸气灭菌技术。

3、熟悉玻璃器皿的包扎方法。

4、掌握干热灭菌法灭菌技术。二、仪器和材料1、溶液或试剂

10%HCl、10%NaOH、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。2、仪器或其他用具

pH试纸、培养基分装器、高压蒸气灭菌锅、玻璃棒、天平、牛角匙、记号笔。试管、移液管、锥形瓶、烧杯、量简纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）、电烤箱。三、方法与步骤（一）培养基的配置1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制其配方法如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂

15~20g，水1000mL，pH7.4~7.6。（1）称量和溶解按培养基配方逐一称取牛肉膏、蛋白胨等营养成分依次加入烧杯中，再加定量无菌水，用玻棒搅匀，加热溶解，沸腾情况下保持25-30民，待全部溶解后，加水补足因加热蒸发的水量。注意：在加热融化时要不断搅拌，避免琼脂糊底烧焦。（2）调节pH

用精密pH试纸测培养基的pH，按pH的要求用质量浓度100g/LNaOH或体积百分数10%HCl调整至所需pH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测试其pH值。（3）补水至刻度（4）过滤趁热用纱布过滤即可。如果培养基杂质很少或实验要求不高，可不过滤。（5）分装、包扎玻棒引流于锥形瓶内，塞上棉塞，用报纸包扎。注意：在玻棒引流时，避免瓶口沾上培养基而引起杂菌感染2、伊红美蓝培养基配制方法同于牛肉膏蛋白胨培养基。3、高压蒸气灭菌的操作过程（1）加水立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下1/3处。有加水口者由加水口加入至止水线处。（2）装锅把需灭菌的器物放入锅内（请注意：器物不要装得太满，否则灭菌不彻底），加盖时将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。关严锅盖（对角式均匀拧紧螺旋）。（3）加热用电源或煤气加热，同时打开排气阀，使水沸腾以排出锅内的冷空气。待冷空气完全排出后关上排气阀。让锅内温度随蒸汽压力增加而逐渐上升，当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。（4）中断热源

达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到0时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，内外压力不平衡而翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又玷污了棉塞）。（5）揭开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。灭菌需待培养基冷却后置于37oC恒温箱内培养24小时，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。（二）玻璃器皿的包扎1.洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放入烘箱中烘干、备用。2.包装（1）移液管包装

将干燥的移液管的吸端用细铁丝塞入少许棉花构成1～1.5cm长的棉塞，以防细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉塞要塞得松紧适宜，吸时既能通气，又不致使棉花滑入管内。将塞好棉花的移液管的尖端，放在4～5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端（实验图2-1），用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。包好的多个移液管可再用一张大的报纸包好。（2）棉塞的制作（2）试管和三角瓶等的包装

用棉塞或泡沫塑料塞将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住然后在棉塞与管口和瓶口的外面用两层报纸与细线（或用铝箔）包扎好，放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。（3）培养皿的包装

培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸或报纸将每套培养皿（皿底朝里，皿盖朝外，）包好。如果将培养皿放金属筒内进行干热灭菌，则不必用纸包。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎，外面最好加一层牛皮纸或铝箔。3、灭菌——干热灭菌法

培养皿、移液管、试管及其他玻璃器皿可用干热灭菌。先将已包装好的上述物品放入恒温箱中，将温度调至160oC后维持2小时，把恒温箱的调节旋扭调回零处，待温度降到50oC左右，才可将物品取出。请注意：灭菌时温度不得超过170oC，以免包装纸烧焦。灭菌好的器皿应保存好，切勿弄破包装纸，否则会染菌。思考题1.培养基根据什么原理配制成？肉膏蛋白胨琼脂培养基中不同成分各起什么作用？2.在制备培养基的过程中应注意些什么问题？3.在使用高压蒸汽灭菌锅时，怎样杜绝一切不安全的因素？4.干热电烤箱灭菌法灭菌过程中要注意什么？

实训二微生物染色技术

一、目的要求1．掌握微生物涂片技术。2．掌握革兰氏染色法。二、器材1.菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌约24h营养琼脂斜面培养物。2.溶液或试剂：革兰氏染色液、香柏油、二甲苯3.仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种环等1、涂片取两块载玻片，各滴加一小滴无菌的生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接种环以无菌操作从大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。同样方法从蜡样芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的斜面上挑取少许菌苔涂片于另一块载玻片上。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚；切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。三、革兰氏染色2.干燥室温自然干燥。3.固定涂面朝上，在火焰上过2～3次。目的：是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。4.初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1~2分钟，水洗。5.媒染用革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。6.脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色，立即水洗。7.复染用番红染液复染约2分钟，水洗。8.镜检先低倍镜观察，后高倍镜观察，再油镜观察。2.媒染—碘化钾溶液浸湿1-2m3.脱色—95%乙醇溶液进行颜色洗脱4.复染—红色的藩红染液第二次染色

呈现第二次染色的效果红色；称革兰氏阴性菌（红阴G-）细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G+）；四、思考题1、你认为哪些因素会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2、涂片后为什么要进行固定？固定时应注意什么？平板划线分离示意图集连续划线分离示意图分区划线分离示意图实训四微生物的纯种分离

一、目的要求

学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物菌种的方法。综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术二、基本原理

自然界中各种微生物混杂生活在一起，即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。微生物的分离、纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明以来以有100多年的历史，该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工、农、医、环境、动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献。平板稀释涂布、平板稀释混合、平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法。分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物，为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分（形态观察主要包括群体形态（菌落形态）和个体形态观察两个方面。

三、实验材料1、各组所需物品：无菌培养皿：两包，12套无菌三角玻扒：1支无菌吸管：3支接种器具：酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，圆珠笔，一次性口罩，纸巾。制平板的培养基：肉汤琼脂培养基（1瓶）,麦芽汁琼脂培养基（1

瓶）(于杀菌锅里保温)

2、平板的制备：

将融化的琼脂培养基,冷却至50℃左右(以手背能忍受的温度为准)温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于45℃时，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在酒精灯火焰旁进行，右手掌心握住三角瓶的底部，左手打开三角瓶棉塞，以右手的无名指和末指夹持瓶塞，灼烧瓶口。左手拿培养皿，用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15mL,厚度约0.5mL左右），迅速盖好皿盖。左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。四、实验内容1.平板混合分离法：大肠杆菌，枯草杆菌，单球菌（3皿）

将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50℃左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15ml，摇匀，凝固，制成平板。图3-1混合倒平板操作法示意图2.平板划线分离法：（3皿）

将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙（约30℃）伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40℃，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。

图3-2平板划线分离操作法示意图图3-3平板划线菌落分离效果图3.平板涂布分离法(3皿)：面包酵母菌，古巴酵母菌，假丝酵母菌将菌液分离样品摇匀，将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置。右手拿无菌三角玻扒在平板培养基表面上,将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直来回推动,平板内边缘处可改变方向用三角玻扒再涂布几次。图3-4涂布平板操作法示意图4.平板点殖：黑曲霉，黄曲霉，根霉（3皿）

一般用于观察霉菌的菌落。在无菌操作下，用接种针从斜面或孢子悬液中取少许孢子，轻轻点种于平板上。5.生物的培养技术：培养箱恒温培养法

细菌于37℃恒温培养箱培养1-2d，平板倒置培养。霉菌和酵母菌于32℃恒温培养箱培养2-3d，平板倒置培养。五、实验报告1、观察记录实验结果：微生物的菌落特征

注:菌落特征描写方法参考如下：大小：大，中,小,针尖状形态：圆形，不规则等干湿情况：干燥，湿润，粘稠高度：扁平，隆起，凹下透明度：透明度，半透明，不透明颜色：黄色，金黄色，灰色，乳白色，红色，粉红色，黑色等边缘：整齐，不整齐2、思考题:如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤.你所做的涂布平板法和划线法是否较好地得到了单菌落?如果不是,请分析其原因。在恒温培养箱中培养微生物时为何培养皿需倒置?实训五环境中主要微生物菌落及菌体形态的识别一、目的原理环境中存在着大量的微生物，菌落、形态各异，通过观察细菌、放线菌、霉菌的形态和菌落，掌握它们的特征，并能够识别它们。

二、材料和器皿 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、擦镜纸、生理盐水。 吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、乳酸石炭酸棉蓝染色液三、操作步骤（一）菌落观察1.细菌菌落多为光滑型、湿润、质地软、表面结构及边缘结构特征很多，呈各种颜色，易从培养基上挑取2.酵母菌菌落呈圆形，较细菌菌落大而且厚，表面光滑、质地软、颜色多为白色和红色。3.放线菌菌落菌落较小，干燥、质密、坚实，不易挑取，且与基质结合紧密、不易被针挑取，菌落表面呈粉状或皱折呈裂状，呈各种颜色，且正面和背面颜色不同。4.霉菌菌落菌落较大、疏松，常呈绒毛状或絮状，能蔓延生长，用接种环易挑取孢子和气生菌丝，菌落呈各种颜色，正面和背面的颜色也不相同。（二）形态观察1．细菌形态观察 以无菌操作挑取少许菌落制成简单染色片或革兰氏染色片，在油镜下观察细菌形态。必要时可进行芽孢染色、荚膜染色或鞭毛染色后观察。2．放线菌的观察（1）压菌法用接种铲或小刀横向切取小片菌落，可连同少许培养基，置载玻片中央。用另一载玻片将菌块压碎，弃去培养基，制成涂片。经风干加热固定后用石炭酸复红染色液染色1min，水洗，干燥后在油镜下仔细观察菌丝及孢子丝的着生、分枝、排列、卷曲等形态。（2）印片法在载玻片上加一滴美蓝染色液。取清洁盖玻片一块，在菌落上面轻轻按一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴美蓝染色液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中，制成印片，用油镜观察。3．霉菌的观察在干净的载玻片上，滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝于染液中，再仔细将菌丝挑开，然后盖上盖玻片，显微镜下观察菌丝的形态。4．酵母菌的观察在载玻片中央滴加一滴美蓝染色液，按无菌操作法从培养基上挑取少量酵母菌，放在美蓝染色液中，使菌体与染色液充分混匀，加上盖玻片。显微镜下观察酵母菌的形态和出芽情况。三、实验结果和报告绘图说明你观察到的细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的形态并描述所观察的细菌、放线菌和霉菌、酵母菌菌落的主要特征。实训六蓝细菌及藻类的形态观察一、目的1、学习水浸片的制作方法2、识别水体中几种常见的蓝细菌的形态。3、学习生物图的绘制方法二、基本原理三、仪器和材料1.材料：采集自然界各种水域样品2.仪器及其他用具：显微镜、载玻片四、操作步骤1.制片2.镜检五、思考题1.绘制你所看到的蓝细菌和藻类细胞的形态图。2.蓝细菌有叶绿体和真正的细胞核吗？它们多呈什么颜色？微囊藻一、常见的蓝细菌

具缘微囊藻

不定微囊藻

水花微囊藻平列藻

中华平裂藻微小平裂藻

大平裂藻为首螺旋藻

大螺旋藻

极大螺旋藻

小颤藻巨颤藻卵形隐藻长形蓝隐藻二、常见的藻类1.隐藻门长刺鱼鳞藻2.金藻门阿氏黄群藻分歧锥囊藻密集锥囊藻裸甲藻光薄甲藻3.甲藻门角甲藻二角多甲藻-正面观多甲藻近缘黄丝藻绿黄丝藻4.黄藻门尖尾裸藻间断裸藻5.裸藻门沟状扁裸藻棘刺囊裸藻梨形扁裸藻扭曲扁裸藻囊裸藻长尾扁裸藻6.硅藻门桥湾藻衣藻小球衣藻莱哈衣藻7.绿藻门二形栅藻斜生栅藻四尾栅藻四足十字藻截断十字藻针形纤维藻三角四角藻狭形纤维藻四角盘星藻盘星藻月牙藻盘藻桑葚藻鼓藻三叶鼓藻反曲新月藻角星鼓藻实训七微型动物的形态观察一、目的二、基本原理三、仪器和材料1.微型动物样品2.仪器及其他用具四、操作步骤1.制片2.镜检五、思考题1.如何区分轮虫、枝角类与桡足类以及水蚯蚓与线虫。僧帽斜管虫

毛板壳虫

有肋楯纤虫

大变形虫

放射太阳虫球形砂壳虫

一、常见的原生动物草履虫喇叭虫棘尾虫属游仆虫属篮口虫属（Nassula）小胸虫属（Microthorax）球吸管虫属壳吸管虫属足吸管虫属锤吸管虫属旋口虫属草履虫钟虫属独缩虫属聚缩虫属累枝虫属二、常见的轮虫主要形态结构头冠咀嚼囊排泄系统：一对原肾管

红眼旋轮虫梳状疣毛轮虫

不同形态的长三肢轮虫

花箧臂尾轮虫镰形臂尾轮虫裂足臂尾轮虫

龟甲轮虫属（Keratella）晶囊轮虫属（Asplanchna）狭甲轮虫猪吻轮虫属（Dicranophorus）异尾轮虫属（Trichocerca）平甲轮虫属（Platyas）水轮虫属（Epiphanes）腔轮虫属（Lecane）单趾轮虫属（Monostyla）鞍甲轮虫属（Lepadella）巨头轮虫属（Cephalodella）三、枝角类、桡足类笔纹溞属大尾溞属尖额溞属象鼻溞属溞属盘肠溞属桡足类桡足类三个目的特征目哲水蚤剑水蚤猛水蚤体形前体部远宽于后体部前体部远宽于后体部前体部略宽于后体部第一触角长达身体的末端，23-25节适中，6-17节短，5-9节卵囊1个，在身体中间2个，在身体两侧1个，在身体中间生活方式浮游生活浮游生活底栖生活汤匙华哲水蚤

毛饰拟剑水蚤

单节水生猛水蚤

哲水蚤剑水蚤猛水蚤实训八微生物显微镜直接计数法一、目的要求

学会用血球计数器测定酵母菌细胞数学习和掌握用测微尺测量微生物细胞大小的方法二、基本原理

微生物个体生长的时间较短，很快进入分裂繁殖阶段，个体生长难以测定。它们的生长一般以繁殖即群体生长作为微生物生长的指标。群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。测定数目的方法有显微镜直接计数法、平板计数法、光电比浊法等。显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具即测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。三、实验材料酵母菌液显微镜、血球计数器、目镜测微尺、镜台测微尺3.载玻片、盖玻片、接种环、胶头吸管等

图5-1Thoma血球计数板

A.正面图B.纵切面图

1.血球计数板2.盖玻片3.计数室16小格×25大格计数室

25小格×16大格计数室图5-2计数室的两种刻度形式四、实验内容（一）酵母菌数量的检测1.显微镜直接计数法（每人1片）注意事项:

取样时先要摇匀菌液;加样时计数室不可有气泡产生。B.调节显微镜光线的强弱适当。2.平板菌落计数法

(实验八)（二）酵母菌大小的检测注意事项：观察时光线不宜过强,否则难以找到镜台测微尺的刻度;换高倍镜和油镜校正时,务必十分小心,防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头。1.测微尺的校正（标定）：两重合线间镜台测微尺格数Ⅹ10目镜测微尺每格长度(μm)=

两重合线间目镜测微尺格数2．酵母菌大小的测定：利用制好的血球器浸片，用高倍镜测出宽和长各占目镜测微尺的格数，再将测到的格数乘以目镜测微尺（用高倍镜时标定的）每格所代表的长度，即为酵母菌的实际大小。（三）准备下次实验的培养基和玻璃器皿淀粉平板培养：6瓶，100ml/瓶（肉汤培养基+可溶性淀粉）明胶液化培养基：30支，5ml/支（肉汤培养基+明胶12%-18%）糖类发酵培养基(加杜氏小管)：30支，5ml/支蛋白胨水：30支，5ml/支培养皿：36皿，包成6包，6皿/包五、实验报告1、结果记录(1)将计数结果记录下表。A表示五个中方格中的总菌数。B稀释倍数为102。注:1mL菌液总数=A/5×25×104×B=5×107×A（2）将目镜测微尺校正结果填入下表:

接目镜放大倍数：-10×-(3)将酵母菌大小测定结果填入下表：2.思考题根据你的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？某单位要求知道一种干酵母粉的活菌存活率，请设计1-2种可行的检测方法。比较平板菌落计算法和显微镜下直接计算法的优缺点几应用。在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？为什么？为什么更换不同放大倍率目镜和物镜时，必须用镜台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？实训九空气中微生物的检测一、目的1.学习并掌握空气中微生物的检测方法。2.了解空气中微生物的种类和数量3.掌握不同的微生物类群的菌落特征。二、基本原理主要利用空气沉降的原理三、仪器和材料1.无菌培养基：牛肉膏蛋白胨营养琼脂培养基（检测细菌）；查氏培养基（检测霉菌）；高氏1号培养基（检测放线菌）2.无菌平板、酒精灯等。四、操作方法沉降法。五、操作步骤1.倒平板2.放置待测地点3.倒置培养4.观察结果5.计算1m3空气中微生物数量X=N×100×100/平皿底面积X——每1m3空气中的细菌个数N——平板暴露5min，经37℃培养24h后所生长的菌落数。六、结果与计算1.记录空气中微生物的种类和数量2.描述细菌、霉菌和放线菌的菌落特征。3.计算1m3环境空气中所含的细菌数。实训十细菌总数的测定一、目的1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。2.掌握无菌操作技术。二、材料和器皿1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。3.无菌水。4.培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取10-15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。三、实验操作步骤2、倒平板熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行，整个稀释过程如图。样品的处理和稀释

操作要求：“无菌操作”贯彻始终。充分振摇或研磨25g或25ml检样225mL稀释液含有玻璃珠的灭菌玻璃瓶或乳钵1：10稀释液。1ml1ml1ml9ml稀释液1：1009ml稀释液1：10009ml稀释液1：10000减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

稀释样品的取样和倾注平皿

每个稀释度做两个平皿将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。取样倾注平皿1：10稀释液225mL无菌水1mL1mL9mL稀释液1：1009mL稀释液1：10001mL1mL1mL1mL1mL1mL1mL1ml无菌水25g或25ml检样6、培养及计数培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数。规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。

当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

计数原则：选平均菌落数在30~300之间者进行计算2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。报告原则

例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落数(个/mL)报告方式(个/mL)10-110-210-31136516420—1640016000或1.6×10422760295461.63775038000或3.8×10432890271602.22710027000或2.7×1044无法计数4650513—513000510000或5.1×105527115—270270或2.7×1026无法计数30512—3050031000或3.1×1047无法计数10-3无法计数7、菌落总数报告方式

菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。

固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。8.计数

选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数。同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数每克干土含菌数=1－土壤含水量％四、思考题用一根无菌移液管接种几个浓度的水样时应从哪个浓度开始？为什么？2.琼脂平板接种后，为什么要倒置培养？实训十一微生物对有机物降解及转化能力的定性分析

一、目的要求

了解不同细菌对含氮及含碳化合物的分解和利用情况进一步掌握微生物的接种方法二、基本原理

微生物代谢与其他生物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。微生物代谢重要特征之一，就是代谢类型的多样性，因此使得微生物在自然界的物质循环中起着重要的作用，同时也为人类开发利用微生物资源提供更多的机会与途径。人们在微生物的分类鉴定工作中，常利用其生理生化反应作用作为重要依据。本实验分别安排微生物对生物大分子的分解利用（淀粉水解实验水解试验、明胶液化试验），对含碳化合物的分解利用（糖发酵试验）以及对含氮化化合物的分解利用（吲哚试验），让同学们对微生物的代谢类型多样性有一个初步和感性的了解，同时学习利用微生物形态、结构以及生化反应的特征对某些细菌进行初步的分类。本实验进一步学习平板接种法、穿刺接种法、液体接种法。三、实验材料

1．培养基：淀粉水解培养基：2皿明胶液化培养基：2支糖类发酵培养基：4支蛋白胨水培养基：2支2.接种用具：接种环（针、钩），酒精灯，镊子，消毒棉球，打火机，标签贴纸，废物杯，一次性口罩，纸巾，油性笔。3.实验菌种：枯草杆菌、大肠杆菌、单球菌4.配置培养基的工具：1套四、实验内容图6-1糖类发酵试验

四、实验内容1.淀粉水解试验：（2皿）（1）翻转平板使底皿背面向上，用油性笔在其背面玻璃上画上三个圆圈。（2）用接种环在圆圈中间以点植的方式接上菌种。一皿接枯草杆菌，另一皿接大肠杆菌。（3）将接完种的平板倒置于37℃恒温培养箱，培养24h。（4）观察结果时，可打开皿盖，滴加少量的碘液于平板上，轻轻旋转，是碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，则说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外酶活力的高低。（以“+”、“—”表示有无透明圈）（1）以穿刺接种法分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于明胶培养基中。（2）接种后置于20℃恒温培养箱，培养2-5d。（3）观察结果时，注意培养基有无液化现象。（以“+”、“—”表示有无液化现象）

注意：如果细菌在20℃时不能生长，则必须培养在所需的最适温度下，观察结果时需将试管从恒温箱里取出，置于冰浴中，才能观察液化程度。2.明胶液化试验：（2支）（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于同种糖类培养基中，以作比较。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养24h。（3）观察结果时，看各管颜色变化及杜氏小管有无气泡。产酸产气用“⊕”表示；只产酸不产气用“+”表示；不产酸也不产气用“—”表示。3.糖类发酵试验：（4支）（1）以液体接种的方式分别接种枯草杆菌和大肠杆菌于蛋白胨水培养基中。（2）接种后置于37℃恒温培养箱，培养24h。（3）观察结果时，在培养液中加入乙醚约1毫升（使呈明显的乙醚层）。充分振荡，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，待乙醚浮于培养液上面时，沿管壁慢慢加入吲哚试剂10滴。如吲哚存在，则乙醚层呈玫瑰红色（注意：加入吲哚试剂后，不可再摇动，否则红色不明显）。以“+”、“—”表示有无红色的玫瑰吲哚。4.吲哚试验：（2支）五、实验报告1.细菌对各种生理生化试验反应的原理：2．细菌对各种生理生化试验反应的结果：（1）淀粉、明胶等生物大分子物质能否不经分解而直接被细菌吸收？为什么？（2）接种后的明胶试管可以置于37℃恒温培养箱箱中培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？（3）假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？（4）解释在细菌培养中吲哚试验的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？

3.思考题实训十二活性污泥和生物膜

生物相的观察一、实验目的本实验目的是学习观察活性污泥中的絮绒体及生物相，初步分析生物处理池内运转是否正常。二、材料器皿1.活性污泥：取自污水处理厂曝气池。2.量筒、载玻片、盖玻片、玻璃小吸管、橡皮吸头、镊子。3.显微镜、目镜测微尺。三、方法和步骤1.肉眼观察取曝气池的混合液置于量筒内，观察活性污泥在量筒中呈现的絮绒体外观及沉降性能（30分钟沉降后的污泥体积）。2.制片镜检取混合液1～2滴于载玻片上，加盖玻片制成水浸标本片，在显微镜下观察生物相。（1）污泥菌胶团絮绒体形状、大小、稠密度、折光性、游离细菌多少等。（2）丝状微生物伸出絮绒体外的多少，观察哪一类占优势。（3）微型动物识别其中原生动物、后生动物的种类。四、思考题1、将镜检和计数结果填入下表：絮体形态圆形、不规则形絮体结构开放；封闭絮体紧密度紧密；疏松丝状菌数量0；±；+；++；+++游离细菌几乎不见；少；多优势种动物名称及状态描述其它动物种名称每滴稀释液中的动物数每毫升混合液中的动物数2．绘制所观察原生动物和微型后生动物的形态图。3．根据实验观察情况，试对污水厂活性污泥质量及运行情况作初步评价。实训十三活性污泥脱氢酶

活性的测定一、目的和原理二、材料与器皿（一）721型分光光度计、恒温器、离心机（4000转/分）、离心管、移液管、试管（二）试剂：Tris-HCl缓冲液、氯化三苯基四氮唑（TTC）、亚硫酸钠、丙酮（或正丁醇及甲醇）、连二亚硫酸钠、浓硫酸、生理盐水。三、方法与步骤（一）标准曲线的制备1.配制1mg/LTTC溶液：称取50.0mgTTC，溶于50mL蒸馏水中。2.配制不同浓度TTC液：从1mg/LTTC液中分别取1、2、3、4、5、6、7mL放入每个容量为50mL的一组容量瓶中，用蒸馏水定容至50mL，各瓶中TTC浓度分别为20、40、60、80、100、120、140mg/l。3.取8支试管分别加入2mLTris-HCl缓冲液、2mL蒸馏水、2mLTTC液（从低到高浓度一次加入）；对照管不加TTC溶液，所得每只试管内TTC浓度分别为20、40、60、80、100、120、140mg/L。4.每管各加入连二亚硫酸钠10g混匀，使TTC全部还原，生成红色的TF。5.在各管加入5mL丙酮（或正丁醇及甲醇），抽提TF。6.在721型分光光度计上，于485nm波长下测光密度（OD值）。7.以OD值为纵坐标，TTC浓度为横坐标绘出标准曲线。（二）活性污泥中脱氢酶活性的测定1.活性污泥悬浮液的制备取活性污泥混合液50mL，打碎、离心后弃去上清液，再用生理盐水补足，充分搅拌洗涤后，再次离心弃去上清液；如此反复洗涤三次后再以生理盐水稀释至原来体积备用。2.在三组（每组三支）带有塞的离心管内分别加入以下材料与试