2024牛传染性胸膜肺炎诊断技术

GB/T18649—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

本文件代替GB/T18649—2014《牛传染性胸膜肺炎诊断技术》，与GB/T18649—2014相比，除结

构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：

a）更改了范围（见第1章，2014年版的第1章）；

b）将牛传染性胸膜肺炎的病原名称更改为“丝状支原体丝状亚种”（见第3章，2014年版的

第5章）；

c）增加了实验室生物安全措施（见第5章）；

d）删除了“流行病学”“临床症状”“病理变化”（见2014年版的第2章~第4章）；

e）增加了临床诊断（见第6章）；

f）增加了样品采集、保存与处理（见第7章）；

g）更改了病原分离鉴定，删除了其中病料采集和生化特性等内容（见第8章，2014年版的

第5章）；

h）增加了竞争ELISA实验（见第11章）；

i）更改了综合判定（见第12章，2014年版的第9章）；

j）删除了糖培养管、乙酸铅纸条、硝酸盐还原试验培养基和指示剂、靛基质试验培养基和指示

剂、甲基红（MR）试验培养基和指示剂、维培二氏（V⁃P）试验培养级、巴比妥缓冲液（VB）、

阿氏液的配制，以及补体结合百分率判定（见2014年版的附录B~附录I，附录N）；

k）更改了试剂配制，并将支原体培养基的制备移至其中（见附录B，2014年版的附录A）；

l）将6%绵羊红细胞的制备、溶血素效价测定、补体效价测定和抗原效价测定合并为“补体结合

试验试剂效价测定”（见附录D，2014年版的附录J~附录M）。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由中华人民共和国农业农村部提出。

本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。

本文件起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、深圳市绿诗源生物技术有限公司、中国农业

大学。

本文件主要起草人：辛九庆、李媛、王秀梅、徐青元、于海峰、许芳、吴文学。

本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：

——2002年首次发布为GB/T18649—2002，2014年第一次修订；

——本次为第二次修订。

Ⅰ

GB/T18649—2024

引言

牛传染性胸膜肺炎（ContagiousBovinePleuropneumonia，CBPP）是由丝状支原体丝状亚种（Myco⁃

plasmamycoidessubsp.Mycoides，Mmm）引起的一种牛属动物传染病，又称牛肺疫。以肺小叶间淋巴

管浆液⁃渗出性纤维素性炎和浆液纤维素性胸膜炎为特征。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为须报

告的动物传染病，我国农业农村部2022年最新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为一类

动物疫病。

我国于1960年成功研制出高效的弱毒疫苗，通过大范围、高密度疫苗接种并结合屠宰、检疫等各

种控制措施，1989年后再没有发现临床病例，最终消灭了本病。2011年我国获得WOAH颁发的

CBPP无疫认证证书，成为世界公认的CBPP无疫国家。

本文件中的病原分离、聚合酶链式反应（PCR）、补体结合试验（CFT）、竞争酶联免疫吸附试验

（ELISA）等实验室检测方法分别应用于附录A中给出的不同场景。

Ⅱ

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牛传染性胸膜肺炎诊断技术

1范围

本文件描述了CBPP的流行病学、临床症状、病理变化、样品采集、保存与处理，以及病原分离鉴

定、PCR检测、CFT检测、竞争ELISA试验等诊断方法。

本文件适用于CBPP的诊断、检疫、监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于

本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CBPP：牛传染性胸膜肺炎（ContagiousBovinePleuropneumonia）

CFT：补体结合试验（ComplementFixationTest）

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）

Mmm：丝状支原体丝状亚种（Mycoplasmamycoidessubsp.Mycoides）

OD值：光密度值（OpticalDensity）

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

5实验室生物安全措施

在对病牛做出疑似CBPP感染判断后，将有关病料送农业行政主管部门批准的实验室做进一步的

病原分离及鉴定。进行CBPP实验室诊断时，按照GB19489的规定进行，同时依照《动物病原微生物

实验活动生物安全要求细则》的相关要求，病原分离与鉴定需要在生物安全三级实验室内开展。样品

采集、保存、运输执行NY/T541的要求。本文件中各类试剂配制用水应符合GB/T6682的要求。没

有取得农业行政主管部门批准的实验室不应从事本病原分离培养工作。

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6临床诊断

6.1流行特点

6.1.1感染牛是CBPP的主要传染源。健康牛与感染牛直接接触后吸入感染牛的“飞沫”是本病的主

要传染途径，其中感染牛的“飞沫”是传播媒介。本病也可通过感染牛的精液和胚胎造成垂直传播。

6.1.2在自然条件下，黄牛、奶牛、牦牛和犏牛对本病最易感，水牛对本病易感性较差。鹿和羚羊也较

易感，山羊和绵羊也可感染。

6.2临床症状

6.2.1本病潜伏期平均7d~28d，短则7d，长者可达数月。

6.2.2按发病的经过分为急性型、亚急性型和慢性型。

a）急性型：症状明显，典型而有特征性。病牛体温升高为40℃~42℃，呈稽留热，呼吸困难且表

浅，呈腹式呼吸。咳嗽渐频繁，胸部疼痛而不愿行动或卧下，呼气长吸气短，伸颈气喘，常有呻

吟声。有浆液性或脓性鼻汗流出，反刍和泌乳停止，食欲废绝。可视黏膜发绀，被毛粗乱。胸

部叩诊时患侧可有浊音或实音区。听诊患部有湿性啰音，肺泡音减弱乃至消失，代之以支气

管呼吸音，有时有摩擦音。发病后期，心脏衰弱，脉搏细弱加快，可达80次/min~120次/min。

一般8d~10d死亡，整个病程约15d~30d。

b）亚急性型：症状与急性型相似，但稍有缓和，病程稍长。当体温升高至40℃时，呼吸困难明

显，病牛伸颈低头而立，行动困难。拒食，精神衰弱，此种病型的牛预后不良。

c）慢性型：多数是由急性型或亚急性型转变而来。体温不规则，有发热呈一过性，常与牛结核相

似。体况消瘦，消化功能紊乱，食欲反复无常。此种病牛如在良好护理和妥善治疗下，可以逐

渐恢复，成为带菌者；若病变部位广泛，病牛则日益衰弱，预后不良。

6.3病理变化

6.3.1本病特征性病理变化主要在肺和胸腔内。典型病理变化是肺脏切面呈现大理石样和浆液性纤

维素性胸膜肺炎。

6.3.2病程初期以小叶性支气管肺炎为特征，中期呈典型的浆液性纤维素胸膜肺炎，多发生在右侧，有

时两侧。

6.3.3病变多发生在肺的隔叶，也可发生在心叶或后叶。胸膜常见有出血、肥厚并与肺病变部粘连。

肺膜和心包膜表面有纤维素性附着物。

6.4结果判定

当病牛出现上述部分或全部临床症状和病理变化，可初步判为CBPP疑似。确诊应进一步采样进

行实验室诊断。

7样品采集、保存与处理

7.1试剂材料

7.1.1医用防护服。

7.1.2灭菌剪刀、镊子。

7.1.3无菌棉拭子。

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7.1.4各种规格一次性注射器、无菌采集袋、采集管。

7.1.5PBS溶液（pH7.4），按照附录B中B.1配制。

7.1.6含青霉素、链霉素的PBS溶液，按照B.2配制。

7.2样品采集

7.2.1血液样品

用注射器无菌采集血液10mL，凝固后分离血清，或采集抗凝血，经离心分离血浆。抗凝血或血浆

可用于Mmm的分离和PCR检测。血清可用于Mmm抗体检测。

7.2.2组织样品

无菌采集病死或剖杀动物的肺脏（从病变组织和正常组织分界面采集）约2cm见方的小块以及部

分或全部肺门淋巴结置于无菌采集袋或其他灭菌容器中，密闭保存，用于Mmm的分离和PCR检测。

无菌采集动物胸腔积液、支气管灌洗液、心包液、有关节炎症状的关节液3mL~5mL，置于无菌采

集管中，用于Mmm的分离和PCR检测。

7.2.3鼻拭子样品

将灭菌的棉拭子插入动物鼻腔，旋转棉拭子擦拭3次~5次，待棉拭子沾有黏液后，将其放入装有

2mL含青霉素、链霉素PBS溶液（pH7.4）的采样管中，加盖密封保存，用于Mmm的分离和PCR

检测。

7.3样品保存

样品采集后，尽快置于保温箱中，加入干冰或预冷的冰袋，密封，保持全程冷链，24h内送实验室检

测。待检样品尽快处理，在4℃存放不超过24h，在-20℃冷冻保存不应超过6个月。若需长期保存，

应放置于-70℃条件。尽量避免反复冻融。

7.4样品处理

7.4.1血清样品处理

血清样品以2000r/min离心5min，取上清液待检。

7.4.2组织样品的处理

取待检肺脏或淋巴结组织样品约2g，用组织研磨仪低温破碎后，加入10mL含青霉素、链霉素的

PBS溶液制成组织悬液，充分振荡混匀后，4℃以6000r/min离心5min，取上清液待检。

7.4.3鼻拭子样品处理

拭子样品于漩涡振荡器上振荡混匀，于4℃以6000r/min离心15min，取上清液待检。

7.4.4体液样品的处理

胸腔积液、支气管灌洗液、心包液、关节液等于4℃以6000r/min离心5min，取上清液待检。

8病原分离鉴定

8.1仪器设备

CO

8.1.12培养箱。

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8.1.2组织匀浆设备。

8.1.3低温台式高速离心机。

8.1.4Ⅱ级生物安全柜。

8.1.5光学显微镜。

8.1.6高压灭菌器。

8.2试剂材料

8.2.1马丁肉汤，按照B.3方法配制。

8.2.2马丁肉汤琼脂，按照B.4方法配制。

8.2.3灭菌剪刀、棉拭子、注射器。

8.2.4微量可调移液器及配套吸头。

8.3样品稀释

无菌条件下吸取7.5中液体处理的样品0.5mL，接种于4.5mL马丁肉汤培养基中，标记为10-1

管。连续做10倍系列稀释至10-3管。

8.4样品接种

从上述3个梯度稀释样品中各取0.5mL分别接种至4.5mL马丁肉汤培养基中，取0.2mL分别

37℃±0.5℃5%CO

接种马丁肉汤琼脂培养皿；置于含（体积分数）2培养箱中培养，每天观察菌落生长

情况。

8.5克隆纯化

8.5.1接种物连续观察7d，每日检查支原体生长情况。

8.5.2若马丁肉汤琼脂培养皿上出现煎蛋样菌落，疑似支原体生长时，则切取单个菌落（含琼脂块），倒

置在一个新的培养皿的琼脂表面，轻轻移动琼脂块进行克隆纯化；连续2次克隆纯化后，对单个菌落

培养物按照第9章进行鉴定。

8.5.3若马丁肉汤液体培养基颜色变黄，轻微浑浊，应取0.2mL接种至培养皿继续培养，待出现煎蛋

样菌落时，按照8.5.2进行克隆纯化。

8.5.4若7d后液体培养基和固体培养皿均未见疑似Mmm生长，则进行以下处理：

a）马丁肉汤琼脂培养皿继续培养至21d，若仍无疑似Mmm生长，则抛弃；

b）从液体培养物中取0.5mL接种至新的4.5mL液体培养基进行至多两次盲传；按照8.5.2进

行观察处理；如仍未生长，则抛弃。

8.5.5培养过程中，如果培养液出现细菌污染，则取培养液用孔径0.45μm微孔滤膜过滤后，取滤过液

0.5mL，按照8.4接种观察。

8.6结果判定

克隆纯化的培养物需进一步通过PCR方法进行检测，结果判定见9.4.2。

9PCR检测

9.1仪器设备

9.1.1PCR仪。

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9.1.2高速台式冷冻离心机。

9.1.3瞬时离心机。

9.1.4涡旋混匀器。

9.2试剂材料

9.2.1商品化基因组DNA提取试剂盒（商品化试剂）。

9.2.2引物：见附录C中C.1。

9.2.3薄壁PCR管或八连管。

9.2.42×PCR反应预混合液（含Taq酶和染料）。

9.2.5阳性对照：pUC⁃TM质粒，制备过程见C.2。

9.2.6阴性对照：无核酸酶水。

9.2.7DNA分子质量标准。

9.2.81%琼脂糖凝胶，按照B.5的方法配制。

9.3试验程序

9.3.1基因组DNA的提取

使用商品化的基因组DNA提取试剂盒提取7.5中鼻拭子、血液、组织和体液样品的基因组DNA，

操作步骤参照试剂盒说明书。

9.3.2PCR反应

标记各反应管、阴性对照和阳性对照管，按表1反应体系依次加入各试剂。取样品DNA模板2µL

于已配制好的反应体系内，充分混匀后，进行PCR扩增。

表1PCR反应体系

组分体积/µL

2×PCR反应预混合液12.5

10µmol/mL引物11.0

10µmol/mL引物21.0

模板DNA2.0

无核酸酶水9.5

总体积25.0

扩增程序为95℃预变性3min；94℃45s，57℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。以

1%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。

9.4结果判定

9.4.1试验成立条件

阴性对照不能扩增出任何条带，且阳性对照扩增出300bp左右片段，则PCR结果判定为有效。

如阳性对照不能扩增出目的大小片段，或阴性对照扩增出目的片段，则PCR反应无效。

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9.4.2阳性

待检样品扩增出大小为300bp左右的一条特异性扩增条带，且与阳性对照条带分子质量大小相

符，则待检样品判定为Mmm核酸阳性。

9.4.3阴性

待检样品无特异性扩增条带，则判定为Mmm核酸阴性。

10CFT检测

10.1仪器设备

10.1.1电子天平。

10.1.2水浴锅。

10.1.3涡旋振荡器。

10.1.4台式离心机。

10.1.5恒温培养箱。

10.2试剂材料

10.2.1PBS溶液（pH7.4），配制方法按照B.1。

10.2.2阳性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）。

10.2.3阴性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）。

10.2.4CBPP补体结合试验抗原（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）效价测定方法见附录D

中D.1。

10.2.5溶血素（商品化试剂），溶血素效价测定见D.2。

10.2.6致敏绵羊红细胞：配制方法见D.3。

10.2.7补体（商品化试剂）置于-20℃冰箱中保存备用。保存期一般不超过30d。效价测定方法

见D.4。

10.3操作方法

10.3.1将待检血清、阳性对照血清、阴性对照血清均用PBS溶液（pH7.4）作1∶10稀释，于56℃水浴

中灭活30min后备用。

10.3.2按照表2的程序进行操作。试验同时设抗补体对照、阳性血清对照、阴性血清对照、溶血素对

照和红细胞对照。

表2CBPP补体结合试验操作程序（微量法）

各项对照

成分抗补体阳性血清阴性血清溶血素绵羊红细胞待检血清

对照对照对照对照对照

抗原/μL252525//25

血清/μL/2525//25

补体/μL25252525/25

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表2CBPP补体结合试验操作程序（微量法）（续）

各项对照

成分抗补体阳性血清阴性血清溶血素绵羊红细胞待检血清

对照对照对照对照对照

振荡混匀，37℃作用30min

致敏绵羊红细

252525252525

胞/μL

振荡混匀，37℃作用30min，倾斜静止10min观察结果

结果判定-++++--++++

注：“/”表示未添加该试剂；“++++”表示红细胞全部沉淀；“+++”表示红细胞75%沉淀；“++”表示红细胞

50%沉淀；“+”表示红细胞25%沉淀；“-”表示红细胞全部溶血。

10.4结果判定

10.4.1试验成立条件

各组对照为如下结果时试验成立，否则应重复试验：

a）抗补体对照组：红细胞全部溶血（-）；

b）阳性血清对照：红细胞全部沉淀（++++）；

c）阴性血清对照：红细胞全部溶血（-）；

d）溶血素对照：红细胞全部溶血（-）；

e）绵羊红细胞对照：红细胞全部沉淀（++++）。

10.4.2判定

10.4.2.1阳性：待检血清样品的红细胞全部沉淀判定为阳性，红细胞25%~75%沉淀判定为疑似；对

于疑似样品需重新采集血清进行复检，如果仍为疑似，则应做病理学和病原学检查。

10.4.2.2阴性：待检血清样品的红细胞全部溶血判定为阴性。

11竞争ELISA试验

11.1仪器设备

11.1.1酶标仪。

11.1.2恒温培养箱。

11.1.3振荡器。

11.1.4洗板机。

11.2试剂材料

11.2.1PBS溶液（pH7.4）。

11.2.2洗涤缓冲液PBST，按照B.6配制。

11.2.3血清稀释液及酶标抗体稀释液（简称稀释液），按照B.7配制。

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11.2.4阳性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）。

11.2.5阴性对照血清（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）。

11.2.6羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）（商品化试剂）。

11.2.7TMB（3'，3'，5'，5'⁃四甲基联苯胺）底物溶液（商品化试剂）。

11.2.8终止液，按照B.8配制。

11.2.9ELISA抗原包被板（可由牛传染性胸膜肺炎专业实验室提供）：包被有Mmm膜蛋白并经过封

闭处理的96孔ELISA板。

11.2.10ELISA加样槽。

11.3操作步骤

11.3.1实验准备

使用前所有试剂需恢复至18℃~26℃。试剂需轻摇或涡旋混匀，每个样品使用单独吸头，对照可

加在微量反应板的任何位置。

11.3.2单抗检测液的配制

稀释液将单抗进行500倍稀释（如：一块板需要12mL，将24μL单抗加入11.976mL的稀释液）。

11.3.3预反应体系混合

取一块未使用的96孔酶标板，按表3所示加入所需体积的稀释液、对照、血清样品和单抗检测

溶液。

表3竞争ELISA样品预稀释程序

成分阳性血清阴性血清单抗对照空白对照待检血清

稀释液/μL56566012056

血清/μL44——4

单抗检测液/μL606060—60

总体积/μL120120120120120

11.3.4加样及孵育

从预反应板的每孔吸取100µL转移至ELISA抗原包被板上相应的孔中，盖上封口膜，置于37℃

孵育1h。

11.3.5洗涤

弃去孔内液体，每孔加入洗涤缓冲液PBST250µL，孵育3min，弃去PBST，重复洗涤4次，最后

一次在吸水纸上拍干。

11.3.6加酶标二抗

每孔加入100µL的酶标二抗，置于37℃孵育45min。

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11.3.7再次洗涤

同11.3.5。

11.3.8加底物溶液

每孔加入100µLTMB底物溶液，置于37℃避光孵育10min。

11.3.9终止反应

100µL450nmODOD

每孔加入终止液，轻微振荡混匀后，置酶标仪中在波长下读取值（450），应

在加入终止液后5min内完成读数。

11.4结果判定

11.4.1样品抑制率

样品抑制率（InhibitionPercentage）按照公式（1）计算：

OD-OD

IP=450⁃Mab450⁃S×100%…………（1）

SOD-OD

450⁃Mab450⁃CC

式中：

IP

S——待检血清样品抑制率；

OD——450nmOD

450⁃Mab单抗对照在波长处的值；

OD——450nmOD

450⁃CC二抗对照在波长处的值；

OD——450nmOD

450⁃S待检血清样品在波长处的值。

11.4.2试验成立条件

各组对照为如下结果时试验成立，否则应重复试验：

aMabOD0.2~2.0

）对照平均450应在之间；

b）阳性对照样品抑制率应在55%~110%之间；

c）阴性对照样品抑制率应<40%。

11.4.3判定

IP≥50%Mmm

11.4.3.1阳性：S判为抗体阳性。

IP<50%Mmm

11.4.3.2阴性：S判为抗体阴性。

12综合判定

12.1依据临床症状和病理变化可做出初步诊断，符合6.2、6.3中的部分或全部时，可判定为疑似

CBPP。

12.2无临床症状者经第9章、第10章、第11章任何一章所列方法检测为阳性，判定为疑似CBPP。

12.3无临床症状者经第8章检测为阳性，可判定为CBPP。

12.4临床诊断判为疑似者且经第9章、第10章、第11章任何一章所列方法检测为阳性，可判定为

CBPP。

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附录A

（资料性）

CBPP实验室检测方法的应用场景

本文件中各实验室检测方法的适用性见表A.1。

表A.1CBPP实验室检测方法的应用场景

应用场景

方法

检疫临床病例确诊流行病学监测消灭

病原检测和鉴别

病原分离鉴定-+++--

PCR-++--

血清学检测

CFT++++++++++

c⁃ELISA++++++++++

注：“+++”表示推荐该方法；“++”表示适用于非常有限情况的方法；“+”表示推荐但有局限性的方法；

“-”表示不适合此目的。

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附录B

（规范性）

试剂的配制

B.1PBS溶液（0.01mol/L，pH7.4）

8gNaCl3.6gNaHPO12HO0.27gKHPO0.2gKCl900mL

称取、242、24和，溶于双蒸水中，搅拌至

完全溶解后，用1mol/L的HCl调节pH至7.4，用双蒸水定容至1L，经0.22μm滤器过滤除菌或

121kPa高压灭菌30min，置于室温（20℃±5℃）保存。

B.2含青霉素、链霉素的PBS溶液

取青霉素1000000U、链霉素1000000µg，用灭菌去离子水配成10mL的上述两种抗生素的贮

存液（浓度分别为：青霉素100000IU/mL、链霉素100000µg/mL）。分装小瓶，于-20℃保存。

将青霉素、链霉素贮存溶液加入PBS溶液（pH7.4）中，使青霉素、链霉素含量分别为2000U/mL、

2mg/mL。

B.3马丁肉汤（pH7.8~8.0）

将商品化的马丁肉汤培养基分装于灭菌试管内，每管4.5mL，添加无菌马血清0.5mL。

B.4马丁肉汤琼脂

商品化的马丁肉汤培养基中加入1.3%~1.5%琼脂粉，121kPa高压灭菌30min即成马丁琼脂，

冷却至55℃~60℃时，取10mL加入无菌马血清1mL轻轻摇动混合均匀，静置凝固后，即成马丁琼脂

培养基。

.51

B%琼脂糖凝胶

将琼脂糖1g放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃左右时加入适宜的核

酸染料，均匀铺板，厚度为3mm~5mm。

B.6洗涤缓冲液PBST

在1L的PBS中加入1mL吐温-20，充分混匀，现用现配（配好后使用不超过7d），置于室温

（20℃±5℃）保存。

B.7血清稀释液和酶标抗体稀释液

在99.5mLPBS中加入健康马血清0.5mL混匀，用于血清和酶标抗体的稀释。

B.8终止液（2mol/L，硫酸）

将109mL硫酸（18.4mol/L）缓慢滴入800mL双蒸水中，待冷却后加双蒸水定容至1L，置室温

（20℃±5℃）保存。

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GB/T18649—2024

附录C

（资料性）

PCR引物序列和阳性对照质粒的构建

C.1PCR引物序列

SC1：ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG；

SC2：CTGATTATGATGACAGTGGTCA。

C.2阳性对照质粒构建及鉴定

按照C.1所列的引物，对MmmBen⁃1株的基因组DNA进行PCR扩增，用商品化胶回收试剂盒

回收获得的扩增产物将其与pUC⁃57载体进行连接，再转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，得到重

组菌。利用质粒提取试剂盒提取质粒进行PCR检测和测序分析，鉴定为重组阳性质粒（pUC⁃TM）。

质粒和含有重组子的阳性菌分别保存于-20℃和-80℃。

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GB/T18649—2024

附录D

（资料性）

补体结合试验试剂效价测定

D.1CBPP补体结合试验抗原效价测定

D.1.1用PBS溶液（pH7.4）将抗原从1∶10以2倍比连续稀释至1∶640。

D.1.2用PBS溶液（pH7.4）将阳性血清从1∶10以2倍比连续稀释至1∶1280。

D.1.3使用96孔微量反应板对抗原进行方阵滴定，具体操作见表D.1。每孔分别加入25µL对应稀

释度的抗原、25µL对应稀释度的阳性血清，25µL2.5U补体，振荡混匀，37℃水浴30min。每孔加入

致敏后的绵羊红细胞25µL，振荡混匀，37℃水浴30min。1000r/min离心2min，判定结果。同时设

置各抗原稀释度的阴性血清对照、致敏红细胞对照和抗补体对照。

表D.1CBPP补体结合试验抗原效价滴定结果（举例）

血清稀释倍数

致敏抗原

抗原稀

阴性血红细抗补

释倍数1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶1280

清对照胞对体对

照照

1∶10++++++++++++++++++++-----

1∶20+++++++++++++++++++++++----

1∶40++++++++++++++++++++++++----

1∶80++++++++++++++++++++++++----

1∶160+++++++++++-----

1∶320-----------

1∶640-----------

D.1.4当对照全部成立情况下，能100%结合补体（++++）的阳性对照血清的最高稀释度所对应抗

原的最高稀释度即是抗原效价。如上表所示，若1∶160倍稀释的阳性对照血清和1∶80倍稀释的抗原

形成的抗原抗体复合物，能够100%结合补体，那么该抗原效价为1∶80。检测时使用2个单位，将抗

原作80÷2=40倍稀释。

D.2溶血素效价测定

D.2.1溶血素稀释：取0.1mL溶血素作10倍比系列稀释至1∶1000作为基础液，其稀释方法见

表D.2。再按照D.3操作。

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GB/T18649—2024

表D.2溶血素稀释方法

试管号12345678

稀释度1∶20001∶30001∶40001∶50001∶60001∶80001∶100001∶15000

溶血素基础液/

1.01.01.01.01.01.01.01.0

mL

PBS/mL1.02.03.04.05.07.09.014.0

总量2.03.04.05.06.08.010.015.0

表D.3溶血素效价测定

试管号123456789对照

红细

1∶100

溶血素/mL100100020003000400050006000800010000补体胞对

溶血素

照

溶血素

0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2/

用量/mL

1：20补体/

0.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1//

mL

6%绵羊红

0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2

细胞/mL

PBS/mL0.500.500.500.500.500.500.500.500.500.500.60.8

振荡后37℃水浴30min

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