CN113881702B 表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途 （弗·哈夫曼-拉罗切有限公司）

201280062793.92012.12.19动子(含有内含子A)的使用提供增强的生产力(在LC-HC-SM组织中)，与使用SV40polyA信号序列相比，牛生长激素polyA信号序列的使用提供载体组织LC(3`-5/)-HC-SM产生改善的表达。对含hEF1α启动子的载体产生的克隆显示减少的据报道，选择标记放置在下游的载体组织(含bGHpolyA信号序列和hGT的载体产生的克隆2其中所述表达盒双向组织，且其中所述第一表达盒和所述第二表达盒按相反方向排其中所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGH其中所述第一和第二启动子是hEF1α启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGH2.权利要求1的用途，其特征在于所述编码抗3.权利要求1的用途，其特征在于所述编码或313.权利要求11的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含臼突变的抗体14.权利要求12的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含臼突变的抗体15.权利要求11的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体16.权利要求12的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含杵突变的抗体17.权利要求12的用途，其特征在于所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变18.权利要求12的用途，其特征在于所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的其中所述表达盒双向组织，且其中所述第一表达盒和所述第二表达盒按相反方向排4其中所述第一和第二启动子是hCMV启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGH其中所述第一和第二启动子是hEF1α启动子，所述第一和第二polyA信号序列是bGH20.权利要求19的表达载体，其特征在于所21.权利要求19的表达载体，其特征在于所一和第二polyA信号序列是bGHpolyA信号序列，所述转录终止子序列存在且是hGT终止子5细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途”的中国专利申请201280062793.9的分案申些表达载体和生产细胞系在重组产生目的多[0003]基因的转录水平可以对其表达水平具有强烈影响，并因此决定了细胞的生产[0004]编码抗体重链的核酸通常包含在蛋白质成熟时去除的前导序列(信号序列)(约和恒定区CK或CL(约321bp/107aa)[0005]在真核细胞中重组产生抗体涉及产生表达系统(见McCafferty,J.等,(编辑),AntibodyEngineering,A系统，产生包含轻链编码核酸的表达盒，该轻链编码核酸侧翼是启动子和多腺苷酸化polyA区。可以在包含重链和轻链表达盒二者的单个载体中将重链表达盒组合入轻链表达片段、其碱基序列及含有高度适用于具有高表达能力的广范围宿主细胞的DNA片段的表达动子区的DNA片段的表达质粒。US5,122,458中报道了重组DNA化合物和诸如tPA的多肽的[0007]SannaPietro,P.报道了抗体Fab片段和全免疫球蛋白在哺乳动物细胞中的表达D.报道了通过操作转录终止区改进的哺乳动物表达系统(Biotechnol.Progress19(2003)6动物细胞中的抗体表达(在Therapeuticmonoclonalantibodies–Frombenchto强高单克隆抗体表达CHO细胞系的产生的IRES介导的三顺反子载体(J.Biotechnol.157EBxe细胞中的重组蛋白质产生。[0010]虽然hEF1α启动子在稳定库中明显优于hCMV启动子，但发现了对单克隆水平的明[0011]此外，hCMV启动子性能可以进一步通过将它与bGHpolyA信号和人胃泌素基因启动子是人延伸因子1α启动子(hEF1α)，polyA信号序列是牛生长激素polyA信号序列(bGH止子序列的抗体重链表达盒和抗体轻链表达盒的表达载体的使用导致转染后更高数目的7[0020]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0022]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细[0023]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细[0031]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0040]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0042]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细8[0043]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细(hEF1α)与bGHpolyA信号序列组合使用时，hGT终止子序列的存在降低了可获得的表达产[0052]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0054]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细[0055]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细[0065]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至9[0067]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细[0068]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细[0076]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0078]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒单向排列用于选择稳定转染的细[0079]在一个实施方案中，第一表达盒和第二表达盒双向排列用于选择瞬时转染的细[0099]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0109]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0113]本文报道的一个方面是包含以下的表达载体在在哺乳动物细胞中瞬时重组产生[0118]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0128]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至不是不含内含子A的短的人CMV启动子的表达载体增强瞬时基因[0136]其中该表达盒中的一个或两个还在该polyA信号序列后面包含人胃泌素终止子序[0137]在一个实施方案中，该第一和第二polyA信号序列相互独立地选自SV40polyA信[0139]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至盒和该选择标记双向排列。[0143]本文报道的一个方面是本文报道的表达质粒在瞬时表达抗体或稳定表达抗体中[0153]在一个实施方案中，该表达盒中的一个或两个在该polyA信号序列后面不包含人[0156]在一个实施方案中，该第一和第二polyA信号序列相互独立地选自SV40polyA信[0158]在一个实施方案中，该编码抗体轻链的核酸和/或该编码抗体重链的核酸包含至[0163]本文报道的一个方面是本文报道的表达质粒在瞬时表达抗体或稳定表达抗体中PEST序列和新霉素的多肽的核酸在选择抗体[0184]-培养包含i)此方面中报道的表达质粒和ii)编码不由此方面中报道的表达质粒[0187]在一个实施方案中，该启动子序列选自含有或不含内含子A的人CMV启动子序列、[0188]在一个实施方案中，该polyA信号序列选自牛生长激素polyA信号序列和SV40[0190]本文报道的一个方面是按5’至3’方向包含启动子序列、编码抗体轻链的核酸、[0191]在一个实施方案中，该启动子序列选自含有或不含内含子A的人CMV启动子序列、[0192]在一个实施方案中，该polyA信号序列选自牛生长激素polyA信号序列和SV40轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结构域的抗体这类修饰(见例如Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,Cold术人员能够用一种或多种异源核酸转化多种宿主细胞。虽然不同细胞的转录和翻译(即表例如借助位点定向诱变来进行。本领域技术人员可以容易地进行这类修饰(见例如Sambrook,J.等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,USA(1999)；Hames,B.D.和Higgins,S.J.,Nhybridization–apracticalapproach,IRLPress,Oxf[0250]“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一个或多个改变的抗234和IgA2或通过利用独立于这种活性的测定，如使用识别并结合该多肽的免疫球蛋白的Western印[0256]“表达盒”指包含在细胞中表达至少所含的核酸所必需的诸如启动子和聚腺苷酸[0257]“表达载体”是提供在宿主细胞中表达所包含的一个或多个结构基因所需的全部该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从文另有说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号按照Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIHPublication91-3242中所述的EU编号案中，本文报道的复合物可以包含人Fc区或衍生自人来源的Fc区作为抗体重链铰链区多类。IgG4显示减少的Fcγ受体(FcγRIIIa)结合，但其他IgG亚类的抗体显示强结合。但是，酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(以单字母氨基酸密码给出)或IgG4的EFLG)。在一个实抗体的细胞毒性)和CDC(依赖补体的细胞毒性)。不结合Fcγ受体和/或补体因子C1q的复合似于天然抗体结构的结构或具有包含本文定[0264]“人抗体”是具有对应于由人或人细胞产生或衍生自利用人抗体库或其他人抗体102(Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIH酸残基31-35B、H2的氨基酸残基50-58和H3的氨基酸残基95-102(Almagro,J.C.和供独立的核糖体进入位点用于翻译刚好处于其下游(下游在本文中可与3’互换使用)的可读框有效连接的IRES的多顺反子转录物允许连顺次翻译该下游可读框来产生由同一转录包含天然存在的突变或在产生单克隆抗体制剂期间出现的可能的变体抗体(这类变体通常由形成二硫键的两条相同的轻链和两条相同的重链组成的约150,000道尔顿的异源四聚体的多核苷酸分子或一种或多种天然存在的多核苷酸分子与一种或多种合成的多核苷酸分样表征为由此编码的多肽的氨基酸序列。复制和选择的复制起点(例如ColE1复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性[0274]“多顺反子转录单位”是其中一个以上的结构基因处于同一启动子的控制下的转导型和阻抑型启动子的大量启动子为本领域公知(并在诸如GenBank的数据库中标识)，且可作为克隆的多核苷酸或在克隆的多核苷酸内获得(例如从诸如ATCC的保藏机构以及其他列元件常表征为共有核苷酸序列。这些启动子元件包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、糖皮质激素应答元件(GRE)及其他诸如CRE/ATF(O'Reilly,M.A.等,J.Biol.Chem.267MolecularBiologyoftheGene,第4版(TheBenjamin/CummingsPublishingCompany,在生长激素结合其在细胞表面上的受体时特异性激活。可以通过由例如CMV启动子及随后的两个Tet操纵基因位点组成的人工杂合启动子来达到受四环素(tet)调节的表达。Tet阻金属硫蛋白和热休克启动子的其他诱导型启动子，见例如Sambrook等(上文)和Gossen等,记的存在下)细胞选择过程之后获得稳定转的细胞。例如，可以借助电穿孔或显微注射来将核酸引入细胞。备选地，可以使用诸如FuGENE6(RocheDiagnosticsGmbH,德国)、X-tremeGENE(RocheDiagnosticsGmbH,德转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒的适当的病毒载体系统来将核酸引入细胞体的核酸的转录过程不受影响，且例如产生由附加体的核酸编码的蛋白质。瞬时转染产生构域包含四个保守的构架区(FR)和三个高变区(HVR)(见例如Kindt,T.J.等,Kuby互补的VL或VH结构域的文库来分离结合特定抗原的抗体(见例如Portolano,S.等,和scFv片段即下文所述的其他片段。某些抗体片段的综述见Hudson,P.J.等,Nat.Med.9(2003)129-134。scFv片段的综述见例如Plueckthun,A.,In:ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,113卷,Rosenburg和Moore(编辑),Springer-458。包含补救受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论见[0289]双抗体是具有两个抗原结合部位的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的(见[0290]单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的[0291]可以通过包括但不限于本文所述的完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主抗体(例如从其衍生HVR残基的抗体)的残基取代人源化抗体中的一些FR残基，例如以恢复[0294]人源化抗体和制备它们的方法综述于例如Almagro,J.C.和Fransson,J.,Methods36(2005)61-68；和Klimka,A.等,Br.J.Cancer83(2000)252-26010684和Rosok,M.J.等,J.Biol.Chem.271(19人抗体通常描述于vanDijk,M.A.和vandeWinkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374及Lonberg,N.,Curr.Opin.Immunol.20(2008)45XENOMOUSETM技术的US6,075,181和US6,150,584；描述HUMab技术的US5,770,429；描人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系(见例如Brodeur,B.R.等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,J.,XiandaiMianyixue26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中。人杂交瘤技术(三元杂交瘤技术和Brandlein,S.,HistologyandHistopathology20(2005)927-937及Vollmers,H.P.和Brandlein,S.,MethodsandFindingsinExperimentalandClinicalPharmacology[0299]还可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生领域已知用于产生噬菌体文库并针对具有希望的结合特征的抗体筛选这类文库的多种方J.Mol.Biol.338(2004)299-310；LeeJ.Immunol.Methods284(2004)119-针对结合抗原的噬菌体筛选该文库。噬菌体通常作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段展实验的库来提供抗广范围的非自身以及自身抗原的抗体的单一来源而无需任何免疫。最[0304]用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature305(1983)537-540；WO静电引导作用(WO2009/089004)；交联两种或多种抗体或片段(见例如US4,676,980和Brennan,M.等,Science229(1985)81-83)；用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(见例如Kostelny,S.A.等,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用用于制备双用单链Fv(scFv)二聚体(见例如Gruber,M.等,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；按例如Tutt,A.等,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。[0305]本文还包括具有三个或多个功能性抗原结合部位的改造抗体，包括“章鱼抗体”[0309]在某些实施方案中，用本文提供的方法来改变(即提高或降低)抗体糖基化的程通常包含分枝的双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2结构域的Asn297(见例如US2003/0115614；US2002/0164328；US2004/0093621；US2004/0132140；US2004/2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki,A.等,622。能够产生去岩藻糖基化的抗体的细胞系的实例包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13和US2005/0123546中。还可以产生在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。的载体；或(2)包含编码含有抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码含有抗链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序[0315]适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细K.A.,In:MethodsinMolecularBiology,248卷,Lo,B.K.C.(编辑),HumanaPress,的抗体的真菌和酵母菌株(见Gerngross[0317]适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多可以与昆虫细胞结合使420,548、US7,125,978和US6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(描述于例胞，包括DHFR阴性(DHFR-)CHO细[0325]已发现，用hEF1α启动子和bGHpolyA信号同时交换hCMV启动子和SV40poly信号[0326]已发现，hEF1α启动子产生大量产生良好的克隆及非常少量的非产生或低产生克[0328]用于充分控制的大规模发酵中的最终评价的适当克隆的选择通常基于摇瓶中的bGHpolyA信号取代SV40polyA提高了生产力。在分批分析中而不是在补料分批分析中，[0331]与SV40polyA信号相比，bGHpolyA信号显著降低克隆中抗体表达的稳定性。但择严格性的选择标记的不同表达水平也明显影响产生IgG的细胞的百分比。基于筛选过程[0338]-尽管稳定整合，但克隆的长期生产力可以快速降低(由于遗传基因沉默(例如通[0342]mRNA的聚腺苷酸化具有多种功能。它强烈影响mRNA的细胞核输出、翻译起始和(inefficient)转录终止引起的RNA聚合酶从第一表达单的序列，可以达到增强转录终止和防止例如抗体轻链和抗体重链的表达盒之间的转录干[0357]将这些载体瞬时转染入CHO-K1细胞，转染6天后，收集细胞培养物上清，并通过4.6仅SV40polyA仅bGHpolyA[0363]用载体p5068产生的最好的15个单克隆在分批抗体产生中的平均生产力为624μg/polyA信号和hGT的组合)产生的克隆具有分别提高了23％和40％的生产力(载体px6001为[0367]在载体px6051中，表达盒包含含有内含子A的全长人CMV启动子和SV40polyA信转录终止子含有内含子A的全长hCMVSV40polyA信号不含转录终止子含有内含子A的Ef1α启动子SV40polyA信号不含转录终止子含有内含子A的全长hCMVbGHpolyA信号人胃泌素转录终止子(hGT)含有内含子A的Ef1α启动子bGHpolyA信号人胃泌素转录终止子(hGT)[0373]bGHpolyA信号和hGT的组合交换SV40polyA信号增强了平均生产力：在hEF1α启[0374]生产力的提高还可以在排序靠前的克隆的水平上观察到(载体px6063(693μg/ml)对载体px6052(511μg/ml)的+36％及载体px6062(529μg/ml)对载体px6051(262μg/ml)的+102针对每种载体的三个最好的克隆计算值)(见图2)。链表达盒各在另一个转录方向上的双向载体组织(见px6052)的稳定转染中，hEF1α启动子标记表达盒在一个转录方向上而重链表达盒上游的轻链表达盒各在另一个转录方向上的[0377]还将bGHpolyA信号和hGT的组合用于瞬时转染方法。将载体px6062和px6063(包含具有bGHpolyA信号和hGT的组合的全长hCMV启动子或hEF1α启动子)直接与载体px6051和px6052(包含具有SV40polyA信号的全长hCMV启动子[0378]与稳定转染不同，bGHpolyA信号和人胃泌素终止子(hGT)的组合在含有内含子A的全长人CMV启动子的情况下和含有内含子A的人EF1α启动子的情况下都未提高瞬时转染的生产力(载体px6052的2.38μg/ml对载体px6063的2.32μg/ml)。在含有内含子A的全长人CMV启动子的情况下，bGHpolyA信号和人胃泌素终止子(hGT)的组合导致载体px6062A的甲基化可能更强和/或存在在CHO-K1细胞中抗性更强的启[0383]构建了包含全长hCMV启动子(px6051)、hEF1α启动子(px6052)和大鼠CMV启动子的全长hCMV启动子(px6051)的载体具有分别提高了53％和134％的生产力(载体px6051的[0388]还用包含全长人CMV启动子(载体px6051和px6062)或含有内含子A的hEF1α启动子[0390]稳定库的分批分析显示，来自用包含含有内含子A的hEF1α启动子的载体(载体px6052)转染的细胞的抗体效价比用包含短的hCMV启动子的载体(载体p5068)或用包含含有内含子A的全长hCMV启动子的载体(载体px6051)转染的细胞的抗体效价高4倍以上(载体px6063(二者都包含bGHpolyA信号和人胃泌素终止[0394]所测试的用载体px6063(包含与bGHpolyA信号和hGT组合的hEF1α启动子)转染的[0396]针对抗体产生的稳定性测试了克隆。在存在和缺乏潮霉素B的情况下培养用载体[0397]在缺乏选择压力(潮霉素B)三代的情况下，对于缺乏内含子A[0398]在存在选择压力的情况下，用载体p5068获得的克隆显示平均生产力降低27%[0399]测定了有选择压力或无选择压力三代之后，用包含缺乏内含子A的短的hCMV启动子的载体p5068或用包含含有内含子A的hEF1α启动子的载体px6052转染的稳定克隆的数体p5068产生的克隆不同，用载体px6052产生的12个克隆中的8个在存在选择压力的情况下[0402]载体px6014、px6014A和px6014B包含抗体轻链前面的hEF1α启动子和重链前面的[0406]已发现，通过用包含含有内含子A的人EF1α启动子的载体稳定转染获得的细胞克克隆在平均值和排序靠前的克隆的水平上显示强信号和hGT的组合在稳定转染中独立于所使用的启动子地标记在所使用的载体系统中的分开表达，该载体系统不对抗体表达施加选择压力(见例如[0415]选择标记和抗体链的IRES连锁表达对总抗体表达施加选择压力(即一个mRNA编码[0426]载体px6015B和px6015C(分别包含ELF4G和EMCV-IRES)显示0.1μg/ml至0.15μg/ml[0429]包含EMCV-IRES的载体px6010C显示13μg/ml的生产力。载体p5069显示14μg/ml的生产力。包含EV71-IRES(载体px6010A)或ELF4G-IRES(载体px6010B)[0433]因此，选择标记新霉素(介导对G418的抗性)可以通过EMCV-IRES连接至重链编码[0436]用载体px6010C产生的库在分批分析中显示14μg/ml的生产力。用载体p5069产生[0437]已发现，用载体px6010C产生的库由更多的产生细胞(或更多好的产生细胞)组成[0438]已发现，载体px6010C中的选择标记新霉素的IRES连锁表达还导致库的稳定性增显示239μg/ml的平均生产力。用载体px6010C产生的克隆的平均生产力提高不是由于更好[0442]通过在存在和缺乏选择压力的情况下培养45世代，分别针对17个克隆(p5069)和分批分析中测量了克隆的生产力。将第45代的IgG效价与稳定性测试开始时克隆的生产力[0443]在存在和缺乏选择压力的情况下，用载体p5069产生的17个克隆的平均生产力在[0451]-用于间接检测/定量所产生的蛋白质的共表达定量筛选标记(表面蛋白质或荧光[0453]GFP蛋白质(作为荧光标记的实例)稳定且趋向于累积。细胞中荧光标记的表达水平(荧光强度)和它们的生产力之间没有(大多数[0456]构建了通过IRES元件直接连接至抗体重链的绿色荧光蛋白(GFP)和选择标记新霉素的融合蛋白。该融合蛋白中的绿色荧光蛋白和选择标记新霉素由PEST序列(对应于小鼠[0459]由于抗体和选择标记的IRES连锁共表达，PEST序列的使用提供了融合蛋白的GFP[0465]通过EV71-IRES、ELF4G-IRES和EMCV-IRES元件(见载体px6015A、px6015B和[0466]载体px6015B和px6015C(分别包含ELF4G和EMCV-IRES)显示0.1至0.15μg/ml的IgG[0468]按所述将其中IRES元件将选择标记连接至包含在载体px6011A、px6011B和[0469]包含EMCV-IRES的载体p[0470]在稳定库和稳定克隆的分批分析中测试了含有IRES连接的GFP-PEST-Neo融合蛋[0472]用包含IRES连接的选择标记的载体px6010C产生的稳定库显示9.5μg/ml的IgG生[0473]这些数据表明，用载体px6010C和px6011C产生的库明显由比用载体p5069产生的[0474]为了在稳定克隆中将表达载体p5068的生产力与载体px6010C和px6011C比较，通[0477]用IRES载体px6010C和px6011C及p5059产生的克隆在24孔筛选中显示载体分开4天后在具有未确定的细胞计数的24孔培养物中测定)。对于载体px6010C和px6011C，[0478]单克隆的分批分析显示，用载体px6010C产生的15个最好的克隆的平均生产力为每种载体获得的14至19个克隆45代。在稳定性测试开始(第0代)和第45世代时在分批分析中测量克隆的生产力。将第45代的IgG效价与克隆在稳定性测试开始的第0代的生产力(值生产力都降低(生产力丧失约43％)。在缺乏选择压力的情况下，分别用载体px6010C和中的10个及用载体px6011C产生的19个所测试的克隆中的17个显示高于第0代的生产力的关，通过FACS从稳定库分选具有不同GFP表达水平/荧光强度的群体(每种载体1,000个细[0491]可以通过基于FACS从稳定库分选高GFP荧光的单克隆来直接鉴定高产克隆。通过[0492]已发现，选择标记或GFP-PEST-Neo融合蛋白的EMCV-IRES连锁表达明显增强选择的选择性(产生更多的产生克隆)，它还增强选择的严格性(产生克隆的平均生产力更高)。用可能是由于该融合蛋白中的PEST序列，其介导该融合蛋白的半衰期减小和/或该融合蛋子(hEF1α)(基于载体组织LC-HC-SM)的载体分别具有提高了约+34％(px9003对px9002；[0499]向bGHpolyA信号序列加入人胃泌素终止子(hGT)对包含hCMV的启动子的生产力启动子(hEF1α或hCMV)和所使用的polyA信号序列(SV40或bGHpolyA信号序列)，与对照载织LC(3`-5`)-HC-SM(-28[0502]为了比较表达载体px9002和载体px9003-9007的生产力，通过核转染将载体转染[0503]稳定库的分批分析显示，来自用包含人延伸因子1α启动子的载体(px9003、px9006、px9007)转染的库的抗体效价比用包含短的hCMV启动子的参考载体(载体px9002)[0505]用载体px9001产生的最好的36个单克隆在分批分析中的平均生产力为3与对照载体px9001相比，用载体px9002或用载体px9004和9005(还包含bGHPolyA信号(单独或与HGT组合)代替SV40PolyA信号)产生的克隆显示生产力分别提高37％(px9002)、[0507](用载体px9001产生的)最好的15个单克隆在补料分批分析中的平均生产力为1345μg/ml。与对照载体px9001相比，用载体px9002或用载体px9004和px9005(还包含bGHPolyA信号序列(单独或与hGT组合)代替SV40PolyA信号序列)产生的克隆显示生产力分别的生产力而言，与对照载体px9001相比，载体px9002、px9004和px9005显示约64%[0510]载体px9002的载体组织几乎使产生细胞的百分比倍增(至26.0％)。还包含bGHPolyA信号序列单独取代单独(载体px9004)或与hGT组合(载体px9005)的SV40polyA信号序列的载体显示产生细胞的百分比(分比为39％和4[0511]用人延伸因子1α启动子取代hCMV启动子使产生细胞的数目提高了至多5倍(选择[0512]在存在和缺乏潮霉素B的情况下培养通过用载体px9001-9007转染获得的15个最载体px9007的-14.7％至载体px9002的[0515]满足所定义的稳定性标准(如在存在和缺乏选择标记的情况下，与起始点(G0)的选择压力/选择标记的情况下，载体px9005、px9007和px9002产生最高数目的稳定克隆[0519]-人延伸因子1α启动子(含有内含子A)的使用提供了增强的生产力(在LC-HC-SM组[0529]-用包含bGHpolyA信号序列和hGT的载体产生的克隆具有更高的生产力和稳定性载体启动子polyA信号转录终止子px5068不含内含子A的短的hCMVSV40polyA信号不含转录终止子px6001不含内含子A的短的hCMVSV40polyA信号hGT转录终止子px6008不含内含子A的短的hCMVbGHpolyA信号不含转录终止子px6007不含内含子A的短的hCMVbGHpolyA信号hGT转录终止子px6051含有内含子A的全长hCMVSV40polyA信号不含转录终止子px6052含有内含子A的hEF1α启动子SV40polyA信号不含转录终止子px6053含有内含子A的大鼠CMV启动子ratCMVSV40polyA信号不含转录终止子px6062含有内含子A的全长hCMVbGHpolyA信号hGT转录终止子px6063含有内含子A的hEF1α启动子bGHpolyA信号hGT转录终止子[0541]Xu等,J.Control.Release,81(2002)155-163.[0547]Li等,J.Immunol.Methods318(2007)113-124.是总计三次独立转染的用每种载体获得的最好的15个克隆在分批分析是总计三次独立转染的每种载体的最好的18个克隆在分批分析0代(设为100黑色柱)及有选择压力(G418)(白色柱)和无选择压力(有图案的柱)的第30[0612]图8.介导IRES介导的GFP-PEST-NEO融合蛋白表达的载体px6011C的载体设计的示合蛋白的编码序列由短的人CMV启动子转录在一条mRNA中。此mRNA的翻译产生抗体的重链[0613]图9.通过载体p5069、px6011C和px6010[0614]图10.通过载体p5069、px6010C(通过与抗体的选择标记新霉素的载体)和px6011C(通过与抗体的重链连接的EMCV-IRES元件来表达GFP-PEST-新霉素的融合蛋白的载体)产生的最好的15个克隆的生产力。(A)总计两次独立转染的每种载体的最好的15个克隆在分批分析中的生产力分布。(B)总计两次独立转染的每种载体的最好的15个克隆在分批分析中的平均[0615]图11.所显示的是用载体px6011C产生的11个克隆的GPF表达水平/荧光强度和分中分析。通过FACS测定GFP荧光强度的几何平均值(GM)和每个克隆的GFP阳性细胞的百分克隆的GFP阳性细胞百分比和分批分析中的[0621]表达质粒p5068和p5069包含用于表达WO2005/100402中报道的抗-P-选择蛋白抗[0623]从而连接编码抗-P-选择蛋白HuMab轻链可变区(VL)和人κ轻链恒定区(CL)的基因区段，正如抗-P-选择蛋白HuMab重链可变区(VH)和人γl重链恒定区或人γ4重链恒定区[0624]关于可以从其推断密码子选择的人轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991),NIH[0630]-基因组人κ基因恒定区，包括内含子2小鼠Ig-κ增强子(Picard,D.和Schaffner,[0637]-基因组人γl重链基因恒定区，包括小鼠Igμ增强[0645]用Sambrook等,1999(上文)中所述的标准[0649]通过在SequiServe[0653]CHO-K1细胞培养在补充了1xHT补充物(InvitrogenCorp.,Gibco8,目录号11067-030)的CD-CHO培养基[0655]所有细胞系都在120至140转/分钟的恒定搅拌下维持在37℃、5％CO2的增湿培养箱中。每3至4天将细胞分入新鲜培养基。用CaseyTT或CedexHires细胞计数仪(RocheinnovatesAG,Bielefel[0656]此外，按例如Bonifacino,J.S.等,(编辑),CurrentProtocolsinCellBiology,JohnWileyandSons,Inc.(2000)中所述应用标[0659]CASY8TechnologyTT型细胞计数仪(RocheInnovatisAG,Bielefeld)用电流进行细胞计数。用脉冲面积分析(PulseAreaAnalysis)来从细胞通过低压电场中的测量[0661]用CedexHiRes系统(RocheInnovatisAG,Bielefeld)来在库选择期间测定细胞[0664]诸如DNA的量和质量的几种因素强烈影响转染效率和从而影响生产力。为了确保[0666]按照厂家的说明通过HighSpeedMaxi质粒分离试剂盒(QiagenGMBH,Hilden)同[0668]通过酚/氯仿纯化同时纯化所有载体。将各500μg线性化的质粒DNA与200μlTris[0672]在0.8％琼脂糖凝胶上检验了每种质粒[0674]按照厂家的说明通过Amaxa96孔穿梭系统(LonzaGmbH,德国)来将所有载体转染ELISA(Dianova)分析了无细胞的细胞培养物上清的I[0676]通过850转/分钟离心5分钟来沉淀培养在细胞培养瓶中的CHO-K1细胞，并重悬在培养基中。将环状质粒按1μg参考表达载体p5068或p5069的等摩尔浓度铺板在96孔核转染[0678]按照厂家的说明通过核转染技术(AmaxaBiosystems,LonzacologneAG)进行稳过施加脉冲来进行转染。然后将细胞转入包含预热的4ml新鲜培养基和4ml条件培养基的含预热的4ml新鲜培养基和4ml条件培养基的T25组织培养瓶中静置培养所转G418)，并用自动化高通量克隆分离系统(ScicloneALH3000工作站，CaliperLifeSciencesGmbH,Mainz)将细胞按每孔350至700个细胞的浓度接种在384[0686]10至14天后，用基于ELISA的超高通量筛选(ELSIAuHTS)针对IgG水平筛选384孔按3x105细胞/ml的浓度和3.0ml的总体积均一地接种入平底6孔板。所有分批培养物均培[0690]通过使用一步法通用ELISA来测定瞬时实验中及筛选形式(384孔至24孔)中的IgG[0692]用一步法通用ELISA(Dianova)来测定来自细胞培养物上清的人IgG水平。使用稀瑞士)的0.3125-20ng/ml范围的系列稀释物制备标准曲线。向链霉抗生物素蛋白包被的96孔MTP(StreptaWell,RocheDiagnosticsGmbH)中加入95μl含有0.5μg/ml生物素化F涤抗体包被的平板三次。向平板中加入100μlABTS(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,[0694]与一步法通用ELISA组合，用基于HPLC的层析通过蛋白A来测定分批分析的IgG效[0696]用荧光激活细胞分选来测定稳定或瞬时转染的细胞的转染效率(根据表达GFP的[0706]3.实施方案1至2任一项的方法，[0709]6.实施方案1至5中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、[0722]10.实施方案8或9的方法，其特合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合特异述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL结含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的抗[0746]20.实施方案17至19中任一项的[0747]21.实施方案17至20中任一项的方法，其特征在[0748]22.实施方案17至21中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细[0749]23.实施方案17至22中任一项的方[0756]27.实施方案24至26中任一项的[0757]28.实施方案24至27中任一项的表达载体，其特征[0768]30.实施方案24至29中任一项的表达[0769]31.实施方案24至30中任一体具有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二结合[0781]34.实施方案24至33中任一项的表达载[0782]35.实施方案24至34中任一项的表达载[0783]36.实施方案24至35中任一项的表达载编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体重链CH1结构域的抗体轻链变体，和/或所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻[0784]37.实施方案24至36中任一项的表达编码包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域[0794]41.实施方案38至40中任一[0795]42.实施方案38至41中任一项的方法，其特征在于所述[0796]43.实施方案38至42中[0797]44.实施方案38至43中任[0799]46.实施方案38至45中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细[0800]47.实施方案46的方法，其特征在于[0809]51.实施方案48至50中任一[0810]52.实施方案48至51中任一项的方法，其特征在于所述[0811]53.实施方案48至52中任[0812]54.实施方案48至53中任[0814]56.实施方案48至55中任一项的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细[0822]61.实施方案58至60中任一项的[0823]62.实施方案58至61中任一项的表达载体，其特征[0824]63.实施方案58至62中任一[0825]64.实施方案58至63中任一项的表达载[0834]69.实施方案66至68中任一项的用途，其特征且是hGT终止子序列。[0836]71.实施方案66至69中任一项的用途，其特征在于所述哺乳动物细胞选自CHO细[0848]74.实施方案66至73中任一项的[0849]75.实施方案66至74中任一项的有特异性结合第二抗原或抗原上的第二表位的第二[0861]78.实施方案66至77中任一项的用途，其[0862]79.实施方案66至78中任一项的用途，[0863]80.实施方案66至79中任一项的用途所述抗体轻链表达盒之一编码包含抗体轻链可变结构域和作为恒定结构域的抗体轻链CL[0864]81.实施方案66至80中任一项的包含抗体轻链恒定结构域(CL)作为第一恒定结构域的抗体重链变体，和/或所述抗体重链表达盒之一编码包含抗体重链CH1结构域作为第一恒定结构域的[0872]85.实施方案82至84中任一项的表达载体[0873]86.实施方案82至84中任一项的表达载体[0877]-培养包含i)实施方案87的表达质粒和ii)编码不由实施方案87的表达质粒编码链的核酸序列和polyA信号序列的表达质粒的用途，用于表达抗体，由此所述IRES元件是[0882]-培养包含i)实施方案90的表达质粒和ii)编码不由实施方案90的表达质粒编码[0003]<120>表达载体元件组合、新的生产用细胞产生方法及其在重组产生多肽中的用途[0004]<130>30789[0005]<150>EP11195361[0006]<151>2011-12-22[0008]<170>PatentIn版本3.5[0012]<213>人巨细胞病毒[0014]gttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60[0015]gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120[0016]ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180[0017]ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240[0018]atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300[0019]cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360[0020]tattagtcatcgctattagcatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggat420[0021]agcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgt480[0022]tttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc540[0023]aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctccgtttagtgaac600[0028]<213>人巨细胞病毒[0030]gttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcata60[0031]gcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgc120[0032]ccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatag180[0033]ggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtac240[0034]atcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccg300[0035]cctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacg360[0036]tattagtcatcgctattagcatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggat420[0037]agcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgt480[0038]tttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgc540[0039]aaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctccgtttagtgaac600[0040]gtcagatctagctctgggagaggagcccagcactagaagtcggcggtgtttccattcggt660[0041]gatcagcactgaacacagaggaagcttgccgccacc696[0045]<213>人巨细胞病毒[0047]ctgcagtgaataataaaatgtgtgtttgtccgaaatacgcgttttgagatttctgtcgcc[0048]gactaaattcatgtcgcgcgatagtggtgtttatcgccgatagagatggcgatattggaa[0049]aaatcgatatttgaaaatatggcatattgaaaatgtcgccgatgtgagtttctgtgtaac[0050]tgatatcgccatttttccaaaagtgatttttgggcatacgcgatatctgg240cgatagcgct240[0051]tatatcgtttacgggggatggcgatagacgactttggtgacttgggcgattctgtgtgtc[0052]gcaaatatcgcagtttcgatataggtgacagacgatatgaggctatatcgccgatagagg[0053]cgacatcaagctggcacatggccaatgcatatcgatctatacattgaatc420aatattggcc420[0054]attagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctatt480ggccattgca480[0055]tacgttgtatccatatcataatatgtacatttatattggctcatgtccaacattaccgcc[0056]atgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggt600cattagttca600[0057]tagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgc660ctggctgacc660[0058]gcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat[0059]agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagt[0060]acatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacg840gtaaatggcc840[0061]cgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggc900agtacatcta900[0062]cgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatca960atgggcgtgg960[0063]atagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagttt[0064]gttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgac[0065]gcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaa[0066]ccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccggga[0067]ccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacgcggattccccgtgccaagag[0068]tgacgtaagtaccgcctatagagtctataggcccacccccttggcttcttatgcatgcta[0069]tactgtttttggcttggggtctatacacccccgcttcctcatgttataggtgatggtata[0070]gcttagcctataggtgtgggttattgaccattattgaccactcccctattggtgacgata[0071]ctttccattactaatccataacatggctctttgccacaactctctttattggctatatgc[0072]caatacactgtccttcagagactgacacggactctgtatttttacaggatggggtctcat[0073]ttattatttacaaattcacatatacaacaccaccgtccccagtgcccgcagtttttatta[0074]aacataacgtgggatctccacgcgaatctcgggtacgtgttccggacatgggctcttctc[0075]cggtagcggcggagcttctacatccgagccctgctcccatgcctccagcgactcatggtc[0076]gctcggcagctccttgctcctaacagtggaggccagacttaggcacagcacgatgcccac[0077]caccaccagtgtgccgcacaaggccgtggcggtagggtatgtgtctgaaaatgagctcgg[0078]ggagcgggcttgcaccgctgacgcatttggaagacttaaggcagcggcagaagaagatgc[0079]aggcagctgagttgttgtgttctgataagagtcagaggtaactcccgttgcggtgctgtt[0080]aacggtggagggcagtgtagtctgagcagtactcgttgctgccgcgcgcgccaccagaca2040[0081]taatagctgacagactaacagactgttcctttccatgggtcttttctgcagtcaccgtcc2100[0082]ttgacacggtttaaacgccgccacc2125<211>575<212>DNA<400>4cccgggctgggctgagacccgcagaggaagacgctctagggatttgtcccggactagcga60gatggcaaggctgaggacgggaggctgattgagaggcgaaggtacaccctaatctcaata120caacctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcg180gcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaa240aaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtag300aacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtg360gagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacag420tccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcg480gggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggag540aaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgtt575<210>5<212>DNA<213>人<400>5cccgggctgggctgagacccgcagaggaagacgctctagggatttgtcccggactagcgagatggcaaggctgaggacgggaggctgattgagaggcgaaggtacaccctaatctcaatacaacctttggagctaagccagcaatggtagagggaagattctgcacgtcccttccaggcggcctccccgtcaccaccccccccaacccgccccgaccggagctgagagtaattcatacaa240aaggactcgcccctgccttggggaatcccagggaccgtcgttaaactcccactaacgtagaacccagagatcgctgcgttcccgccccctcacccgcccgctctcgtcatcactgaggtggagaagagcatgcgtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacag420tccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcg480gggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgcca600gaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcc660cttgcgtgccttgaattacttccacgcccctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcac840cttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacct900gctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacact960ggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgatcttttggagtacgtcgtctttaggttgg[0126]ggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttagg[0127]ccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttgg[0128]ttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtggtttaa[0129]acgccgccacc[0133]<213>人工序列[0135]<223>