高分辨基因分型的临床详解

高分辨基因分型的临床详解演示文稿第1页，共42页。优选高分辨基因分型的临床第2页，共42页。

1.HLA-B27抗原分子及其等位基因第3页，共42页。

HLA-B27抗原分子结构及其特点HLA-B27抗原分子是由位于人类第六号染色体短臂上B*27等位基因编码的糖蛋白,分子量为56×103U。由两条多肽链组成，一条为α链或重链，分子量约为44×103U，包括胞外区，跨膜区，胞内区三个结构域，其中胞外区又分为α1，α2，

α3三个结构区；另一条为β链或轻链即β2微球蛋白，分子量约12×103U，二者结合共同组成HLA-B27抗原分子。第4页，共42页。

HLA-B27抗原分子结构第5页，共42页。

α1区与α2区的肽链折叠后共同构成一个抗原结合凹槽，槽内形成A,B,C,D,E,F共6个袋状结构，其中B袋在HLA-B27分子中是最保守的结构。凹槽的作用是结合抗原肽，使抗原肽与HLA-B27分子牢固的结合。第6页，共42页。HLA-B*27等位基因结构及其特点2002年WHO正式命名的HLA—B*27等位基因达到了24个，其中只有15个有相对应的抗原表达。到2009年11月WHO正式命名HLA—B*27等位基因达到59个(B*2701一B*2759)。HLA—B*27等位基因呈多态性，主要是因为个别的碱基突变造成的，编码蛋白的差异主要集中在αl、α2结构区内。第7页，共42页。

其中HLA-B*2701与HLA-B*2705编码的蛋白在78-81范围内有2个氨基酸的不同；其中HLA-B*2702与HLA-B*2705编码的蛋白在78-81范围内有3个氨基酸的不同；其中HLA-B*2703与HLA-B*2705编码的蛋白仅有1个氨基酸的差别，即在59位前者为组氨酸（His），后者为酪氨酸（Tyr）；第8页，共42页。

HLA-B*2705基因分布最广，几乎见于所有人种。甚至认为其它等位基因都是由HLA-B*2705基因发生突变、移位形成的。HLA-B*2705编码的蛋白最为显著的特点就是在B袋上的45位发生氨基酸的突变，这一改变直接影响HLA-B27分子在细胞表面的表达，影响HLA-B27分子与抗原肽的结合，同时影响了HLA-B27分子对胞内外抗原的递呈。第9页，共42页。

2.与HLA-B27相关的疾病第10页，共42页。

强直性脊柱炎（ankylosingspondylitisAS）幼年类风湿关节炎（juvenilerheumatoidarthritisJRA)急性前葡萄膜炎(acuteanterioruveitis，AAU)白血病等疾病第11页，共42页。强直性脊柱炎（AS）1973年Brewerton和schiosstein发现强直性脊柱炎（ankylosingspondylitisAS）与HLA-B27抗原有非常强的相关,这是目前唯一有临床价值的血型相关抗原,这在迄今已知的HLA与疾病的关联中是最强和最典型的。第12页，共42页。AS的抗原学检测【HLA-B27与强直性脊柱炎的临床分析】报道：HLA-B27抗原阳性率在AS患者高达96％以上，而正常群体中仅4%-7%,HLA-B27抗原携带者发生AS的相对危险率高达70%。第13页，共42页。与AS相关的B*27等位基因第14页，共42页。AS的基因学检测不同人群的AS患者涉及的B*27等位基因第15页，共42页。

与AS相关的B*27等位基因第16页，共42页。

不同人群AS患者中HLA-B*27等位基因频率

不同人群AS患者的HLA-B*27等位基因频率

摘自【HLA—B*27高分辨等位基因在1606例疑似强直性脊柱炎患者中的表达】第17页，共42页。HLA-B27与AS致病机制的研究HLA-B27分子与非折叠蛋白理论假说HLA-B27分子游离重链与AS其它第18页，共42页。HLA-B27分子非折叠蛋白理论假说

HLAI类分子是在内质网成熟的，新合成的HLAIα进入内质网腔与钙连蛋白结合，使I类分子在内质网中维持部分折叠，继而与新合成的β2-微球蛋白组装成完整的I类分子，此时B27分子才能被认为是成熟的，转运至细胞表面。研究发现，HLA-B27折叠速度较其他HLA分子（非HLA-B27分子）慢。导致内质网腔中出现大量的折叠不良或部分折叠的HLA-B27重链部分，通常情况下，非折叠的重链在内质网腔内能够被清除，但由于一些相关物质的缺乏或无效，所致非折叠的重链堆积，形成了非折叠蛋白反应。有资料报道，AS的发生可能与这些HLA-B27分子的未折叠有关。第19页，共42页。HLA-B27分子游离重链与ASHLA-B27分子的主要功能是：识别和处理抗原肽，然后在递呈给T淋巴细胞。HLA-B27分子具有特殊的生物学效应，它在体外具有形成重链二聚体的能力，主要是通过B27分子第67位氨基酸的残基半氨酸的二硫键结合形成稳定的二聚体。通过认识HLA-B27分子结构的特异性，重要的是深入研究游离重链的表达是否应该认为是导致AS的发病原因之一。当HLA-B27分子适当的、正确的组装时，其递呈的抗原肽通常被CD8CTL识别；但当AS发生时，限制性的CIMTh细胞却能识别非折叠、空载或缺失的B27分子。在这种情况下，就是HLAII类分子递呈B27重链，降解后形成的多肽被CD4Th细胞识别后导致关节炎症。此研究目前还存在争议。第20页，共42页。其它HLA-B27可提高致关节炎的细菌在胞内的存活率，从而加剧关节炎的严重度。B27改变信号转导学说，即HLA-B27通过修饰炎症因子基因相关的信号转导过程而致关节炎。HLA-B39,HLA-B60可能对AS的诱发起到一定的作用。第21页，共42页。幼年类风湿性关节炎（JRA）幼年类风湿性关节炎（juvenilerheumatoidarthritisJRA)是类风湿性关节炎疾病中的一个特殊类型，而HLA-B27抗原阳性的幼年类风湿关节炎又是类风湿关节炎疾病中的一个亚型。幼年类风湿性关节炎是儿童时期较常见的结缔组织病，国外的报道发现，较多的幼年类风湿性关节炎患者的HLA-B27抗原呈现阳性，且没有男女性别差异。第22页，共42页。

【differentialdiagnosisjuvenileankylosingspondylitisandjuvebilerheumatoidarthritisbysubtypesofHLA-B27alleles】报道：和该疾病相关的HLA-B*27的等位基因涉及B*2705,B*2704,B*2707,B*2702基因。在HLA-B27抗原阳性的JRA患者中，B*2705基因占60.7%，B*2704基因占28.57%，B*2702基因占3.57%，B*2707基因占7.14%。第23页，共42页。HLA-B27与JRA致病机制的研究以各种感染性微生物作为外来抗原（HLA-B27分子与其结构有相似性），激活免疫细胞，通过损伤或分泌细胞因子触发异常的免疫反应，引起自身组织的损害和变性。特别是细菌、病毒的特殊成分作为超抗原，其结构与人类MHC抗原有同源性，不需抗原呈递细胞加工处理，即可直接与T细胞受体直接结合（HLA-B27充当细胞表面受体），激活T细胞。第24页，共42页。急性前葡萄膜炎（AAU)急性前葡萄膜炎(acuteanterioruveitis，AAU)是一类常见的自身免疫性致盲眼病，病因复杂、病程长、易反复发作,要确定其发病原因仍比较困难。自1973年BrewertonDA等人首次报道HLA—B27抗原与AAU之间的相关性以来，迄今为止，已发现2O多种眼病与HLA抗原具有相关性，其中最主要的是HLA—B27抗原与AAU之间的相关性。第25页，共42页。

【AssociationbetweenHLA-B27antigenandacuteanterioruveitis】指出：国内外报道有所不同，国内报道37.0％-60％AAU患者HLA-B27抗原呈阳性，国外报道19％-88％呈阳性,而B*27等位基因与AAU的关系报道较少。【acuteanterioruveitisandHLA-B27】报道，在HLA-B27抗原阳性的AAU患者中,HLA-B*2704基因占44．7%,B*2705基因占56%。第26页，共42页。HLA-B27与AAU致病机制的研究葡萄膜炎-受体假说：HLA—B27(+)的AAU可能由于HLA—B27分子担当细胞表面受体，其与微生物结合，由此引起葡萄膜炎。分子拟态假说:HLA—B27分子在结构上与激发引起AAU的微生物肽序列相似,从而引发葡萄膜炎。第27页，共42页。其它疾病【Geneticmarkerslinkedtorheumatoidarthritisarealsostronglyassociatedwitharticularmanifestationsinulcerativecolitispatients】【Flt3一ITDmutationscangenerateleukaemiaspecificneoepitopes：potentialroleforimmunotherapeuticapproaches】【AnkylosingspondylitisislinkedtoKlebsiella—theevidence】

等三篇文献报道：HLA-B27抗原与白塞氏病也有一定的相关性。第28页，共42页。

此外，HLA-B27抗原与白血病、心脏疾病、鼻咽癌、银屑病、关节炎型肠炎也有相关性，但相关报道较少。第29页，共42页。

名称易感性等位基因强直性脊柱炎B*2701,B*2702,B*2704,B*2705,B*2710类风湿性关节炎B*2702,B*2704,B*2705,B*2713青少年自发性关节炎B*2724脊椎关节炎 B*2709，B*2705关节炎型炎症性肠病B*27XX白塞病B*2702银屑病B*27XX白血病B*27XX银屑病B*27XX鼻咽癌B*27XX赖姆疏螺旋体病B*27XXHIV-1感染B*27XX第30页，共42页。

3.HLA-B27的检测方法第31页，共42页。

微量淋巴细胞毒实验（CDC）流式细胞术（FCM）分子生物学技术（PCR）

第32页，共42页。

三种检测方法的对比

第33页，共42页。

HLA-B27基因分型检测方法特异性引物序列聚合酶链反应(PCR-SSP)序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应（PCR-SSO）

聚合酶链反应-直接测序分型（PCR-SBT）

第34页，共42页。

PCR-SSP:针对HLA-B*27基因的外显子2的序列，合成相应的HLA-B*27基因引物，在PCR扩增仪上扩增即可，这种特异性的PCR扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳检出，凝胶成像系统下观察结果。

第35页，共42页。

血清学检测HLA-B27抗原的优缺点

实验操作方面（1）经典的血清学分型技术因其操作简便，准确率尚可且成本较低，曾得到广泛应用。（2）所用标本须为新鲜血液标本。

（3）受细胞纯度、补体差异、单抗效价的影响，易出现错判漏判，观察结果存在主观因素。临床应用方面：血清学检测的是蛋白抗原，不能检测出HLA-B*27等位基因，即血清学结果是阴性，只能说明HLA-B27抗原阴性，并不能确定HLA-B*27基因是否存在。目前尚无针对HLA-B*27不同等位基因的抗体，故不能检测出对应的HLA-B*27等位基因.

第36页，共42页。

基因学方法检测HLA—B*27基因的优缺点（以PCR-SSP为例）：

实验操作方面（1）只需PCR扩增仪和琼脂糖凝胶电泳设备；费用中等，适合在我国现有条件下开展。（2）标本需要量少，取材容易，提取的DNA可长期保存；陈旧血、冷冻血也可用于DNA的提取，使留取标本不受时间的限制。（3）结果准确可靠，分析结果客观，根据内对照及有无特异性区带来判断结果一目了然。（4）PCR时