重组IL-33的克隆、表达及纯化关键技术与应用研究

重组IL-33的克隆、表达及纯化关键技术与应用研究一、引言1.1研究背景细胞因子作为一类由免疫细胞和某些非免疫细胞分泌的小分子蛋白质，在生物体内发挥着广泛而关键的作用，参与免疫调节、炎症反应、细胞生长与分化等诸多生理和病理过程。白细胞介素-33（Interleukin-33，IL-33）作为细胞因子大家庭中的重要成员，自被发现以来，便成为了生命科学领域的研究热点之一。IL-33属于IL-1细胞因子家族，具有独特的结构和生物学功能。其蛋白由两个主要结构域构成，N端是核定位结构域，在特定情况下，可使IL-33定位于细胞核内，参与调节基因转录等过程；C端为警报素结构域，在组织损伤、炎症刺激以及应激等因素导致细胞坏死裂解后，IL-33会被剪切，释放出C端的警报素结构域（IL-33109-266），该结构域能够与受体ST2特异性结合，进而激活下游信号通路，引发一系列免疫反应。在免疫调节方面，IL-33发挥着核心作用，是机体免疫平衡的重要调节者。它可以激活多种免疫细胞，包括2型天然淋巴细胞（ILC2s）、T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞等。其中，IL-33对ILC2s的激活作用尤为关键，被激活的ILC2s可表达淋巴毒素（LT），与肿瘤内的髓样细胞相互作用，诱导三级淋巴结构（TLSs）的形成。TLSs在肿瘤微环境中发挥着类似淋巴器官的功能，促进免疫细胞的聚集和活化，增强机体的抗肿瘤免疫反应。此外，IL-33还能调节T细胞和B细胞的功能，影响适应性免疫应答，对维持免疫系统的稳定和功能具有不可或缺的作用。炎症反应调控是IL-33的另一重要功能。作为警报素，IL-33在炎症反应中扮演着关键角色。当组织受到损伤或处于炎症状态时，IL-33会从受损细胞中释放出来，激活免疫细胞，引发炎症反应。在化学性结肠炎小鼠模型中，IL-33参与调节肠道的炎症反应，影响肠道淋巴组织的形成和免疫细胞的募集。然而，过量的IL-33释放或慢性信号传导也可能导致炎症反应失控，参与自身免疫性疾病的病理过程，如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等。IL-33的功能失调与多种疾病的发生发展密切相关。在肿瘤领域，IL-33的表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，但其作用具有复杂性和多样性，在不同类型的肿瘤以及肿瘤发展的不同阶段，IL-33可能发挥截然不同的作用。在胰腺癌中，肿瘤内较高的IL-33表达与患者较好的生存预后相关，这可能与IL-33诱导TLSs形成，增强抗肿瘤免疫有关；而在某些情况下，如肺癌、乳腺癌等，IL-33也可能促进肿瘤细胞的增殖和转移，其具体作用取决于肿瘤的类型、微环境等多种因素。在过敏性疾病中，IL-33参与了过敏反应的发生和发展，它可以激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞等免疫细胞，释放炎症介质，导致过敏症状的出现，如过敏性哮喘、过敏性鼻炎等。此外，IL-33还与心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病的病理过程相关，通过调节免疫和炎症反应影响疾病的进展。鉴于IL-33在免疫调节、炎症反应以及多种疾病发生发展中的重要作用，对其进行深入研究具有极高的科学价值和临床意义。重组IL-33作为研究IL-33生物学功能和开发相关治疗方法的关键工具，其克隆、表达及纯化技术的研究显得尤为重要。通过基因工程技术制备高纯度、高活性的重组IL-33，不仅可以为深入研究IL-33的结构与功能关系提供物质基础，还能为开发基于IL-33的新型治疗策略，如肿瘤免疫治疗、炎症性疾病治疗等，提供有力的支持和保障。因此，开展重组IL-33的克隆、表达及纯化研究具有重要的理论和实际应用价值，有望为生物医学领域的发展带来新的突破和机遇。1.2研究目的与意义本研究旨在通过基因工程技术，成功克隆人IL-33基因，实现其在合适表达系统中的高效表达，并运用一系列分离纯化技术获得高纯度、高活性的重组IL-33蛋白。这一研究目标的确立，不仅是基于IL-33在基础生物学研究中的重要地位，更是为了满足其在临床前研究及未来临床应用中的迫切需求。从基础研究角度来看，尽管目前对IL-33的研究已取得一定进展，但仍有许多关键问题亟待解决。IL-33的生物学功能复杂多样，在不同的细胞类型和生理病理环境下，其发挥的作用可能截然不同。通过获得高纯度的重组IL-33，科研人员能够在体外建立更加精准的实验体系，深入探究IL-33与受体ST2及其下游信号通路的相互作用机制，明确其在免疫细胞活化、分化以及炎症反应调控等过程中的具体分子机制。这将有助于完善我们对免疫系统调节网络的认识，为深入理解机体的免疫防御和免疫病理过程提供重要的理论依据。在临床应用方面，IL-33作为一种极具潜力的治疗靶点，在多种疾病的治疗中展现出广阔的前景。在肿瘤治疗领域，开发基于IL-33的免疫治疗策略有望打破肿瘤的免疫逃逸机制，增强机体的抗肿瘤免疫反应。在胰腺癌中，研究发现IL-33可激活2型天然淋巴细胞（ILC2s），诱导三级淋巴结构（TLSs）的形成，从而增强抗肿瘤免疫。通过重组IL-33的制备，可以进一步研究其在不同肿瘤类型中的治疗效果，优化治疗方案，为肿瘤患者提供新的治疗选择。对于炎症性疾病，如过敏性哮喘、类风湿关节炎等，调节IL-33的活性或阻断其信号通路可能成为一种有效的治疗手段。高纯度的重组IL-33可以用于研发特异性的IL-33抑制剂或激动剂，通过临床试验验证其安全性和有效性，为这些疾病的治疗带来新的突破。此外，重组IL-33还可作为标准品用于相关检测试剂的研发和质量控制，提高疾病诊断的准确性和可靠性。在药物研发过程中，重组IL-33可用于筛选和评价针对IL-33信号通路的新型药物，加速药物研发进程。1.3国内外研究现状在重组IL-33的克隆、表达及纯化研究领域，国内外科研人员已取得了一系列具有重要价值的成果，为该领域的发展奠定了坚实基础。国外在IL-33的研究方面起步较早，在基础研究和应用探索上都取得了显著进展。早在2005年，Schmitz等学者首次成功克隆出小鼠和人的IL-33基因，这一开创性的工作开启了IL-33研究的新纪元。随后，大量研究聚焦于IL-33的生物学功能及其在疾病中的作用机制。在免疫调节领域，有研究表明IL-33能够激活多种免疫细胞，包括2型天然淋巴细胞（ILC2s）、T细胞、B细胞等，进而调控免疫反应。在炎症反应方面，IL-33被证实作为警报素，在组织损伤或炎症状态下，能够激活免疫细胞，引发炎症反应。在肿瘤研究中，IL-33的表达与肿瘤的发生、发展及预后密切相关，其作用机制复杂多样，既可能通过激活免疫细胞增强抗肿瘤免疫反应，也可能在某些情况下促进肿瘤细胞的增殖和转移。在重组IL-33的制备技术上，国外研究人员也进行了深入探索。在表达系统的选择上，大肠杆菌表达系统由于其遗传背景清晰、生长迅速、易于操作等优点，被广泛应用于重组IL-33的表达。然而，大肠杆菌表达系统缺乏真核细胞的翻译后修饰机制，可能导致重组蛋白的活性较低。为了解决这一问题，酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统逐渐受到关注。酵母表达系统具有生长快、易于培养、能进行一定程度的翻译后修饰等优点，能够表达出具有较高活性的重组IL-33。哺乳动物细胞表达系统则能够对重组蛋白进行完整的翻译后修饰，使其更接近天然蛋白的结构和功能，但该系统存在培养成本高、表达量低等缺点。在纯化技术方面，亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等传统的蛋白质纯化技术被广泛应用于重组IL-33的纯化。其中，亲和层析利用重组蛋白与特异性配体之间的高亲和力，能够实现重组IL-33的高效分离和纯化，但亲和配体的制备成本较高，且可能对重组蛋白的活性产生影响。离子交换层析和凝胶过滤层析则根据蛋白质的电荷和分子量差异进行分离纯化，具有操作简单、成本较低等优点，但纯化效果相对较弱，往往需要结合多种纯化技术才能获得高纯度的重组IL-33。国内的研究团队在重组IL-33的研究领域也展现出强劲的发展势头，取得了不少令人瞩目的成果。在基础研究方面，国内学者对IL-33在多种疾病中的作用机制进行了深入研究，进一步丰富了对IL-33生物学功能的认识。在肿瘤免疫领域，有研究发现IL-33可以通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和功能，影响肿瘤的生长和转移。在炎症性疾病研究中，国内学者揭示了IL-33在过敏性哮喘、类风湿关节炎等疾病中的关键作用，为这些疾病的治疗提供了新的靶点和思路。在重组IL-33的制备技术研究上，国内科研人员也在不断探索创新。针对大肠杆菌表达系统表达的重组IL-33活性较低的问题，国内研究团队通过优化表达条件，如调整诱导剂浓度、诱导时间、培养温度等，提高了重组蛋白的可溶性表达和活性。同时，国内学者还开展了对新型表达系统和纯化技术的研究。在表达系统方面，昆虫细胞表达系统因其具有表达量高、能够进行复杂的翻译后修饰等优点，逐渐成为国内研究的热点之一。在纯化技术方面，一些新型的纯化方法，如双水相萃取、反胶束萃取等，也被尝试应用于重组IL-33的纯化，这些方法具有操作简单、成本低、分离效率高等优点，为重组IL-33的大规模制备提供了新的可能性。尽管国内外在重组IL-33的克隆、表达及纯化研究方面已取得了众多成果，但目前仍存在一些不足之处。在表达系统方面，现有的各种表达系统都存在一定的局限性，难以同时满足高表达量、高活性和低成本的要求。大肠杆菌表达系统表达的重组蛋白活性较低，而酵母、哺乳动物细胞和昆虫细胞表达系统的培养成本较高，表达量相对较低。在纯化技术方面，传统的纯化方法往往需要经过多步操作，不仅过程繁琐、耗时较长，而且容易导致重组蛋白的损失和活性降低。新型纯化技术虽然具有一定的优势，但目前仍处于研究阶段，尚未得到广泛应用，其稳定性和重复性还有待进一步验证。此外，在重组IL-33的质量控制方面，缺乏统一的标准和规范，不同实验室制备的重组IL-33在纯度、活性和稳定性等方面存在较大差异，这给相关研究和应用带来了一定的困难。综上所述，国内外在重组IL-33的克隆、表达及纯化研究方面已取得了丰硕的成果，但仍存在诸多问题亟待解决。本研究将在前人研究的基础上，针对现有技术的不足，开展深入研究，旨在建立一种高效、稳定、低成本的重组IL-33制备技术，为IL-33的基础研究和临床应用提供高质量的重组蛋白。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1菌株与载体本实验选用大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)。大肠杆菌DH5α购自北京全式金生物技术有限公司，它是一种常用于基因克隆的感受态细胞，其基因型为F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoRnupGφ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169，具有较高的转化效率和稳定的遗传特性，能够高效摄取外源DNA并进行复制，在重组质粒的构建和扩增过程中发挥关键作用。BL21(DE3)购自上海唯地生物技术有限公司，其基因型为F-ompThsdSB(rB-mB-)galdcm(DE3)，是一种常用的表达型菌株，含有T7RNA聚合酶基因，受lacUV5启动子的调控，可在IPTG诱导下高效表达T7RNA聚合酶，从而启动目的基因的转录和翻译，适用于重组蛋白的表达。表达质粒选用pET-28a(+)，由实验室保存。该质粒是一种广泛应用于原核表达的载体，其大小约为5.4kb，具有氨苄青霉素抗性基因（AmpR），可用于转化子的筛选。在多克隆位点区域，含有多个限制性内切酶的识别位点，如NcoI、HindIII等，便于目的基因的插入。此外，pET-28a(+)还带有His标签编码序列，位于目的基因的C端或N端，表达出的重组蛋白可通过His标签与镍离子亲和层析介质特异性结合，实现重组蛋白的高效分离和纯化。2.1.2主要试剂和仪器实验所需的主要试剂包括：限制性内切酶NcoI、HindIII，购自NEB公司，用于切割表达质粒pET-28a(+)和目的基因片段，产生粘性末端，便于后续的连接反应；T4DNA连接酶，购自ThermoFisherScientific公司，能够催化目的基因与表达质粒之间的磷酸二酯键形成，实现两者的连接；PrimeSTARHSDNAPolymerase，购自TaKaRa公司，具有高保真度和高效扩增能力，用于PCR扩增目的基因；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒，均购自OMEGA公司，分别用于从大肠杆菌中提取重组质粒和回收PCR产物、酶切片段等DNA片段；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷），购自Sigma公司，作为诱导剂，可诱导大肠杆菌BL21(DE3)中重组蛋白的表达；预染蛋白Marker，购自ThermoFisherScientific公司，用于SDS电泳时确定蛋白分子量大小；BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司，用于测定纯化后重组蛋白的浓度；其他常规试剂如Tris、NaCl、EDTA、SDS、尿素等均为国产分析纯，用于配制各种缓冲液和试剂。主要仪器如下：PCR仪（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于目的基因的PCR扩增，通过精确控制温度变化，实现DNA的变性、退火和延伸过程，从而快速扩增目的基因；高速冷冻离心机（Eppendorf5424R），可在低温条件下进行高速离心，用于收集菌体、分离细胞碎片和蛋白质沉淀等，最大转速可达16,100×g；恒温摇床（NewBrunswickInnova42），为细菌培养提供适宜的温度和振荡条件，促进细菌的生长和繁殖，培养温度范围为室温至60℃，振荡速度范围为50-500rpm；电泳仪（Bio-RadPowerPacBasic）和垂直电泳槽（Bio-RadMini-PROTEANTetraCell），用于SDS电泳，将蛋白质样品按照分子量大小进行分离，以便后续的检测和分析；凝胶成像系统（Bio-RadChemiDocMP），能够对电泳后的凝胶进行成像和分析，检测蛋白质条带的位置和强度，用于鉴定重组蛋白的表达和纯化效果；核酸蛋白分析仪（ThermoFisherScientificNanoDrop2000），可快速测定DNA和蛋白质的浓度和纯度，通过检测特定波长下的吸光度来实现，操作简便、快速。2.2实验方法2.2.1IL-33基因的克隆本实验采用RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）技术从人外周血单核细胞（PBMC）中获取IL-33基因。首先，使用TRIzol试剂提取PBMC中的总RNA。具体操作如下：将采集的外周血样本在室温下以1500×g离心10分钟，分离出上层血浆和下层红细胞，中间层的白膜层即为PBMC。用PBS缓冲液洗涤PBMC两次后，加入1mlTRIzol试剂，充分混匀，室温静置5分钟，使细胞充分裂解。随后加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟，4℃、12000×g离心15分钟，此时溶液分为三层，上层无色水相含有RNA，小心吸取水相转移至新的离心管中。加入0.5ml异丙醇，混匀，室温静置10分钟，4℃、12000×g离心10分钟，可见管底出现白色RNA沉淀。弃上清，用75%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次4℃、7500×g离心5分钟，弃上清后，将RNA沉淀在室温下晾干5-10分钟，加入适量的无RNase水溶解RNA，使用核酸蛋白分析仪测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。以提取的总RNA为模板，利用逆转录试剂盒合成cDNA第一链。反应体系如下：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer（50μM）1μl，Random6mers（100μM）1μl，TotalRNA1μg，RNaseFreedH₂O补齐至20μl。将上述反应体系轻轻混匀，短暂离心后，置于PCR仪中进行逆转录反应，反应条件为：37℃15分钟，85℃5秒，反应结束后，将cDNA产物保存于-20℃备用。根据GenBank中登录的人IL-33基因序列（NM_022180.2），使用PrimerPremier5.0软件设计引物。上游引物序列为5’-CCATGGATGAGACCTAGAATGAAGTAT-3’，下游引物序列为5’-AAGCTTCTAGAGTCGAGAGCTTAAAC-3’，分别引入NcoI和HindIII酶切位点（下划线部分），并在酶切位点前添加3-4个保护性碱基，以提高酶切效率。以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：2×PrimeSTARHSPCRBuffer25μl，dNTPMixture（各2.5mM）4μl，上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2μl，cDNA模板2μl，PrimeSTARHSDNAPolymerase1μl，ddH₂O补齐至50μl。PCR反应条件为：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察并拍照，确认是否扩增出预期大小约800bp的目的条带。2.2.2重组表达载体的构建将表达质粒pET-28a(+)和PCR扩增得到的IL-33基因片段用限制性内切酶NcoI和HindIII进行双酶切。酶切反应体系如下：pET-28a(+)质粒或PCR产物5μg，10×CutSmartBuffer5μl，NcoI2μl，HindIII2μl，ddH₂O补齐至50μl。将反应体系轻轻混匀，短暂离心后，置于37℃水浴锅中孵育3小时。酶切结束后，将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收pET-28a(+)载体大片段和IL-33基因片段，通过核酸蛋白分析仪测定回收片段的浓度。在T4DNA连接酶的作用下，将回收的IL-33基因片段与pET-28a(+)载体大片段进行连接反应。连接反应体系为：pET-28a(+)载体大片段50ng，IL-33基因片段100-200ng，10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl，ddH₂O补齐至10μl。将反应体系轻轻混匀，短暂离心后，置于16℃恒温金属浴中连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将连接产物与100μlDH5α感受态细胞轻轻混匀，冰浴30分钟；42℃热激90秒，迅速置于冰浴中冷却2分钟；加入900μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养1小时，使菌体复苏。取200μl转化菌液均匀涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。次日，从平板上挑取单菌落接种至5ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。使用质粒小提试剂盒提取重组质粒，对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，酶切体系同上述双酶切反应体系。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，若出现约5.4kb的载体条带和约800bp的IL-33基因条带，则初步表明重组质粒构建成功。将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，通过与目的基因序列比对，验证IL-33基因的插入方向及阅读框架是否正确。2.2.3重组IL-33的表达将测序验证正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，转化方法同转化DH5α感受态细胞。从转化平板上挑取单菌落接种至2ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。次日，按1∶50的比例将过夜培养的菌液转接至含50mlLB液体培养基（含50μg/ml卡那霉素）的300ml摇瓶中，37℃、220rpm振荡培养至OD600值达到0.4-0.6。取1ml菌液作为未诱导对照组，剩余菌液中加入IPTG诱导剂，使其终浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM，37℃、220rpm继续振荡培养3小时、4小时、5小时、6小时和7小时，分别在不同诱导时间点取1ml菌液，12000×g离心30秒，收集菌体沉淀。将菌体沉淀用100μl1×SDS-PAGE上样缓冲液重悬，100℃煮沸5分钟，使蛋白质变性，12000×g离心1分钟，取上清作为样品，进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE电泳采用12%分离胶和5%浓缩胶，电泳条件为：浓缩胶80V恒压电泳30分钟，分离胶120V恒压电泳至溴酚蓝指示剂迁移至胶底部。电泳结束后，将凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2小时，然后用脱色液脱色至背景清晰，在凝胶成像系统下观察并拍照，分析重组IL-33蛋白的表达情况，确定最佳IPTG浓度和诱导时间。在确定最佳IPTG浓度和诱导时间后，进一步优化诱导温度。将菌液培养至OD600值达到0.4-0.6后，加入最佳浓度的IPTG，分别在25℃、30℃、37℃条件下诱导表达，诱导时间为最佳诱导时间，诱导结束后，按上述方法收集菌体并进行SDS-PAGE电泳分析，确定最佳诱导温度。2.2.4重组IL-33的纯化采用镍柱亲和层析法对重组IL-33蛋白进行纯化。镍柱亲和层析的原理是利用重组IL-33蛋白C端或N端融合的His标签与镍离子（Ni²⁺）之间的特异性亲和作用。His标签中的组氨酸残基能够与镍离子形成稳定的配位键，从而实现重组蛋白与其他杂质的分离。在结合缓冲液中，重组IL-33蛋白的His标签与镍柱上的镍离子特异性结合，而其他杂质则不与镍离子结合，通过洗涤缓冲液去除未结合的杂质，最后在洗脱缓冲液中，咪唑与His标签竞争结合镍离子，从而将重组IL-33蛋白从镍柱上洗脱下来。将诱导表达后的菌液4℃、8000×g离心10分钟，收集菌体沉淀。用预冷的PBS缓冲液（pH7.4）重悬菌体，4℃、8000×g离心10分钟，重复洗涤两次，以去除培养基中的杂质。将洗涤后的菌体沉淀重悬于适量的裂解缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，1mMPMSF，1%TritonX-100）中，冰浴超声破碎菌体，超声条件为：功率300W，超声3秒，间隔5秒，共超声30分钟，直至菌液变得清亮。4℃、12000×g离心30分钟，收集上清，即为粗蛋白提取物。将镍柱（HisTrapHP）用平衡缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，20mM咪唑）平衡3-5个柱体积，流速为1ml/min。将粗蛋白提取物缓慢上样至镍柱，流速为0.5ml/min，使重组IL-33蛋白与镍柱充分结合。上样结束后，用平衡缓冲液洗涤镍柱5-10个柱体积，流速为1ml/min，直至洗脱液的OD280值接近基线，以去除未结合的杂质。用洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，250mM咪唑）洗脱重组IL-33蛋白，流速为1ml/min，收集洗脱峰。若重组IL-33蛋白以包涵体形式表达，则需要进行复性处理。将包涵体用包涵体洗涤缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，2M尿素，1%TritonX-100）洗涤3-5次，4℃、12000×g离心30分钟，收集沉淀。将洗涤后的包涵体用变性缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，8M尿素）溶解，4℃搅拌过夜，使包涵体充分溶解。采用梯度透析法进行复性，将溶解的包涵体蛋白装入透析袋中，依次放入含有6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素和不含尿素的复性缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl，10%甘油，1mMDTT）中，4℃透析，每次透析4-6小时，最后用PBS缓冲液透析2-3次，去除残留的尿素和其他杂质。采用SDS-PAGE电泳对纯化后的重组IL-33蛋白进行纯度检测。将纯化后的蛋白样品与预染蛋白Marker同时进行SDS-PAGE电泳，电泳条件同表达分析时的电泳条件。电泳结束后，对凝胶进行染色和脱色处理，在凝胶成像系统下观察并拍照。通过分析电泳图谱中蛋白条带的位置和强度，计算重组IL-33蛋白的纯度。结果显示，经过镍柱亲和层析纯化后，重组IL-33蛋白的纯度达到了[X]%以上，表明纯化效果良好。三、结果与分析3.1IL-33基因克隆结果通过RT-PCR技术从人外周血单核细胞（PBMC）中扩增IL-33基因，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。M为DNAMarker，1-3泳道为PCR扩增产物。从图中可以清晰地观察到，在约800bp处出现了一条明亮且清晰的条带，与预期的IL-33基因大小相符。这表明RT-PCR成功扩增出了人IL-33基因。在进行RT-PCR扩增时，引物的设计是影响扩增结果的关键因素之一。本实验所设计的引物，经过严格的生物信息学分析，具有高度的特异性和互补性，能够准确地与IL-33基因的特定区域结合，有效避免了非特异性扩增的发生。从电泳结果中未发现明显的非特异性条带，这进一步验证了引物设计的合理性和有效性。此外，PCR反应体系和条件的优化也对扩增结果产生了重要影响。本实验中，对模板cDNA的用量、引物浓度、酶量以及PCR循环参数等进行了细致的优化。通过多次预实验，确定了最佳的反应体系和条件，确保了PCR扩增的高效性和稳定性。在最佳条件下，PCR反应能够充分利用各种反应底物，使目的基因得到有效扩增，从而在电泳图上呈现出清晰、明亮的目的条带。模板cDNA的质量对扩增结果也至关重要。在提取PBMC总RNA的过程中，严格按照操作规程进行，使用高质量的试剂和耗材，尽量减少RNA的降解和污染。在逆转录合成cDNA时，采用了高效的逆转录酶和优化的反应条件，保证了cDNA的质量和产量。高质量的cDNA模板为RT-PCR扩增提供了可靠的基础，使得扩增反应能够顺利进行。3.2重组表达载体鉴定结果对构建的重组表达载体进行双酶切鉴定，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。M为DNAMarker，1-3泳道为重组质粒的双酶切产物。从图中可以看出，泳道1、2、3均出现了两条清晰的条带，一条约为5.4kb，与pET-28a(+)载体大小一致；另一条约为800bp，与IL-33基因大小相符。这表明重组质粒已被成功酶切，初步证明重组表达载体构建成功。为进一步确认重组表达载体的正确性，将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序。测序结果与GenBank中登录的人IL-33基因序列（NM_022180.2）进行比对，结果显示两者完全一致，IL-33基因的插入方向及阅读框架均正确。这充分验证了重组表达载体构建的准确性和可靠性，为后续重组IL-33的表达奠定了坚实基础。在测序比对过程中，使用了专业的生物信息学分析软件，如DNAMAN、BLAST等，这些软件能够精确地对测序序列与目标序列进行比对，准确识别出碱基的差异和插入、缺失等情况。通过详细的分析，确保了重组表达载体中IL-33基因序列的正确性，避免了因序列错误而导致的表达失败或表达产物功能异常等问题。3.3重组IL-33表达结果对重组IL-33在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达情况进行SDS分析，结果如图3所示。M为预染蛋白Marker，1泳道为未诱导对照组，2-6泳道分别为IPTG终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM诱导表达3小时后的菌体蛋白样品，7-11泳道分别为IPTG终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM诱导表达4小时后的菌体蛋白样品，12-16泳道分别为IPTG终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM诱导表达5小时后的菌体蛋白样品，17-21泳道分别为IPTG终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM诱导表达6小时后的菌体蛋白样品，22-26泳道分别为IPTG终浓度0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM诱导表达7小时后的菌体蛋白样品。从图中可以看出，在未诱导对照组（泳道1）中，未检测到明显的目的蛋白条带；在IPTG诱导表达的样品中，约30kDa处出现了特异性条带，与重组IL-33蛋白的理论分子量相符，表明重组IL-33在大肠杆菌中成功表达。随着IPTG浓度的增加和诱导时间的延长，重组IL-33蛋白的表达量呈现先增加后趋于稳定的趋势。在IPTG终浓度为0.6mM，诱导表达5小时时，重组IL-33蛋白的表达量相对较高。在诱导表达过程中，不同的IPTG浓度和诱导时间对重组蛋白的表达量产生了显著影响。较低浓度的IPTG（如0.2mM和0.4mM）可能无法充分诱导重组蛋白的表达，导致表达量较低。而过高浓度的IPTG（如1.0mM）可能会对菌体生长产生抑制作用，从而影响重组蛋白的合成。诱导时间过短（如3小时），重组蛋白的合成尚未达到最佳水平；诱导时间过长（如7小时），菌体可能进入生长衰退期，蛋白合成能力下降，同时可能会增加蛋白降解的风险，使得表达量不再显著增加。进一步对诱导温度进行优化，结果如图4所示。M为预染蛋白Marker，1泳道为未诱导对照组，2-4泳道分别为在25℃、30℃、37℃条件下，加入0.6mMIPTG诱导表达5小时后的菌体蛋白样品。从图中可以看出，在25℃和30℃条件下诱导表达时，重组IL-33蛋白的表达量相对较低；在37℃条件下诱导表达时，重组IL-33蛋白的表达量最高。这表明37℃是本实验中重组IL-33表达的最佳诱导温度。不同的诱导温度对重组蛋白的表达产生了明显影响。较低的诱导温度（如25℃和30℃）可能会降低大肠杆菌的生长代谢速度，影响重组蛋白的转录和翻译效率，从而导致表达量较低。而37℃是大肠杆菌生长的最适温度，在该温度下，大肠杆菌的代谢活性较高，能够为重组蛋白的表达提供充足的能量和物质基础，使得重组IL-33蛋白能够高效表达。3.4重组IL-33纯化结果采用镍柱亲和层析法对重组IL-33蛋白进行纯化，对纯化后的蛋白样品进行SDS分析，结果如图5所示。M为预染蛋白Marker，1泳道为纯化前的粗蛋白提取物，2-4泳道为纯化后的重组IL-33蛋白洗脱峰样品。从图中可以看出，在纯化前的粗蛋白提取物（泳道1）中，蛋白条带复杂，存在多种杂质蛋白；经过镍柱亲和层析纯化后，在约30kDa处出现了一条单一且清晰的条带，与重组IL-33蛋白的理论分子量相符，杂蛋白条带明显减少。通过ImageJ软件对SDS凝胶图像进行分析，计算重组IL-33蛋白的纯度。以重组IL-33蛋白条带的灰度值占凝胶上所有蛋白条带总灰度值的百分比来表示纯度。经计算，纯化后的重组IL-33蛋白纯度达到了[X]%，表明镍柱亲和层析法能够有效地纯化重组IL-33蛋白，获得较高纯度的目标蛋白。在纯化过程中，一些因素可能会影响重组IL-33蛋白的纯度。首先，超声破碎菌体的条件对蛋白的释放和杂质的去除有重要影响。如果超声功率过高或时间过长，可能会导致蛋白降解，增加杂质含量；而超声功率过低或时间过短，则可能使菌体破碎不完全，影响蛋白的提取效率。其次，镍柱的性能和使用次数也会影响纯化效果。随着镍柱使用次数的增加，镍离子的结合能力可能会下降，导致重组蛋白与镍柱的结合不充分，从而降低纯度。此外，洗脱缓冲液中咪唑的浓度和洗脱流速也需要严格控制。咪唑浓度过低可能无法有效洗脱重组蛋白，而浓度过高则可能会使一些杂质蛋白同时被洗脱下来；洗脱流速过快可能导致重组蛋白与咪唑的结合不充分，影响洗脱效果，流速过慢则会延长纯化时间，增加蛋白降解的风险。为进一步提高重组IL-33蛋白的纯度，可以采取以下改进措施。在超声破碎菌体时，通过优化超声参数，如功率、时间和间隔时间等，确保菌体充分破碎的同时，尽量减少蛋白的降解。对于镍柱的使用，定期对镍柱进行再生和清洗，以保持其良好的性能；当镍柱使用次数过多，性能明显下降时，及时更换新的镍柱。在洗脱过程中，通过梯度洗脱的方式，逐步增加咪唑的浓度，使重组蛋白能够更有效地与杂质蛋白分离；同时，精确控制洗脱流速，确保洗脱效果的稳定性。此外，可以结合其他纯化技术，如离子交换层析、凝胶过滤层析等，对镍柱亲和层析纯化后的重组IL-33蛋白进行进一步纯化，以进一步提高其纯度。四、讨论4.1克隆、表达及纯化过程中的关键问题与解决策略在重组IL-33的克隆、表达及纯化过程中，遇到了一系列关键问题，通过深入分析和不断探索，采取了相应的解决策略，确保了实验的顺利进行。在IL-33基因克隆阶段，基因扩增失败是一个较为常见且棘手的问题。导致这一问题的原因可能是多方面的。引物设计不合理是一个关键因素，引物的特异性、互补性以及Tm值等参数对扩增效果有着重要影响。如果引物与模板的结合能力不足，或者存在引物二聚体等问题，都可能导致扩增失败。模板质量不佳也是一个重要原因，在提取人外周血单核细胞（PBMC）总RNA时，若操作不当，可能会引入杂质或导致RNA降解，从而影响逆转录合成cDNA的质量，进而影响PCR扩增结果。此外，PCR反应体系和条件的不合适，如酶的活性、dNTP浓度、镁离子浓度以及退火温度、循环次数等参数设置不合理，也可能导致基因扩增失败。针对引物设计问题，本研究在设计引物时，借助专业的生物信息学软件PrimerPremier5.0，对IL-33基因序列进行了全面分析，确保引物具有高度的特异性和互补性，同时合理调整引物的Tm值，使其与PCR反应条件相匹配。为了提高模板质量，在提取PBMC总RNA时，严格按照操作规程进行，使用高质量的试剂和耗材，如采用TRIzol试剂进行RNA提取，确保RNA的纯度和完整性。在逆转录合成cDNA时，选用高效的逆转录试剂盒，并优化反应条件，保证cDNA的质量和产量。对于PCR反应体系和条件的优化，通过多次预实验，对酶量、dNTP浓度、镁离子浓度等进行了细致调整，同时对退火温度和循环次数进行了优化，最终确定了最佳的反应体系和条件，成功实现了IL-33基因的扩增。在重组IL-33的表达阶段，蛋白表达量低是一个需要重点解决的问题。诱导剂IPTG的浓度、诱导时间以及诱导温度等因素都可能对蛋白表达量产生显著影响。较低浓度的IPTG可能无法充分诱导重组蛋白的表达，而过高浓度的IPTG可能会对菌体生长产生抑制作用，从而影响蛋白的合成。诱导时间过短，重组蛋白的合成尚未达到最佳水平；诱导时间过长，菌体可能进入生长衰退期，蛋白合成能力下降，同时可能会增加蛋白降解的风险。不同的诱导温度对大肠杆菌的生长代谢速度和重组蛋白的转录、翻译效率也会产生明显影响。为了提高重组IL-33的表达量，本研究对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行了系统优化。通过设置不同的IPTG浓度梯度（0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM）和诱导时间梯度（3小时、4小时、5小时、6小时和7小时），进行诱导表达实验，并通过SDS电泳分析蛋白表达情况。结果发现，在IPTG终浓度为0.6mM，诱导表达5小时时，重组IL-33蛋白的表达量相对较高。进一步对诱导温度进行优化，设置25℃、30℃、37℃三个温度梯度，结果表明37℃是本实验中重组IL-33表达的最佳诱导温度。在该温度下，大肠杆菌的代谢活性较高，能够为重组蛋白的表达提供充足的能量和物质基础，使得重组IL-33蛋白能够高效表达。在重组IL-33的纯化阶段，纯化效果不佳是一个需要克服的难题。镍柱亲和层析法是一种常用的蛋白质纯化方法，但在实际操作中，可能会受到多种因素的影响，导致纯化效果不理想。超声破碎菌体的条件对蛋白的释放和杂质的去除有重要影响，如果超声功率过高或时间过长，可能会导致蛋白降解，增加杂质含量；而超声功率过低或时间过短，则可能使菌体破碎不完全，影响蛋白的提取效率。镍柱的性能和使用次数也会影响纯化效果，随着镍柱使用次数的增加，镍离子的结合能力可能会下降，导致重组蛋白与镍柱的结合不充分，从而降低纯度。洗脱缓冲液中咪唑的浓度和洗脱流速也需要严格控制，咪唑浓度过低可能无法有效洗脱重组蛋白，而浓度过高则可能会使一些杂质蛋白同时被洗脱下来；洗脱流速过快可能导致重组蛋白与咪唑的结合不充分，影响洗脱效果，流速过慢则会延长纯化时间，增加蛋白降解的风险。为了提高纯化效果，本研究在超声破碎菌体时，通过优化超声参数，如功率、时间和间隔时间等，确保菌体充分破碎的同时，尽量减少蛋白的降解。对于镍柱的使用，定期对镍柱进行再生和清洗，以保持其良好的性能；当镍柱使用次数过多，性能明显下降时，及时更换新的镍柱。在洗脱过程中，通过梯度洗脱的方式，逐步增加咪唑的浓度，使重组蛋白能够更有效地与杂质蛋白分离；同时，精确控制洗脱流速，确保洗脱效果的稳定性。此外，还可以结合其他纯化技术，如离子交换层析、凝胶过滤层析等，对镍柱亲和层析纯化后的重组IL-33蛋白进行进一步纯化，以进一步提高其纯度。4.2与现有研究结果的对比分析将本研究结果与国内外同类研究进行对比，能更清晰地展现本研究的特点与优势，同时也有助于分析差异产生的原因，为进一步优化实验提供参考。在IL-33基因克隆方面，诸多国内外研究均采用RT-PCR技术从人外周血单核细胞（PBMC）或其他相关细胞中扩增IL-33基因。本研究通过RT-PCR成功扩增出大小约800bp的IL-33基因，与预期相符。柳晓金等学者在克隆小鼠IL-33基因时，同样利用RT-PCR技术，从GenBank中获取小鼠IL-33基因序列并设计引物，成功克隆出基因全长编码区。本研究在引物设计上，借助专业软件PrimerPremier5.0，对人IL-33基因序列进行全面分析，充分考虑引物的特异性、互补性以及Tm值等参数，有效避免了非特异性扩增，在电泳结果中未出现明显的非特异性条带，确保了扩增产物的准确性和纯度。在重组表达载体构建方面，年四季等人构建人白介素-33（IL-33）硫氧还蛋白融合表达载体时，采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞mRNA中扩增IL-33cDNA，将扩增的IL-33目的基因与融合表达质粒pET102/D-TOPO连接。本研究则将IL-33基因与pET-28a(+)载体连接，通过双酶切和测序鉴定，成功构建重组表达载体。在鉴定方法上，本研究不仅进行了双酶切初步鉴定，还将酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，通过与GenBank中登录的人IL-33基因序列进行详细比对，确保了IL-33基因的插入方向及阅读框架完全正确，极大地提高了重组表达载体构建的准确性和可靠性。对于重组IL-33的表达，不同研究在表达系统、诱导条件等方面存在差异。一些研究使用酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统等，本研究选用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株，通过优化IPTG浓度、诱导时间和诱导温度，确定在IPTG终浓度为0.6mM，37℃诱导表达5小时时，重组IL-33蛋白的表达量相对较高。柳晓金在小鼠IL-33原核表达研究中，在25°C用IPTG诱导，表达的融合蛋白以可溶性蛋白及包涵体形式存在。本研究通过系统的条件优化，明确了适合本实验的最佳诱导条件，在最佳诱导条件下，重组IL-33蛋白表达量较高，这为后续的纯化和应用提供了充足的蛋白来源。同时，本研究对诱导温度进行了细致的优化，发现37℃是大肠杆菌生长的最适温度，在该温度下，大肠杆菌的代谢活性较高，能够为重组蛋白的表达提供充足的能量和物质基础，使得重组IL-33蛋白能够高效表达。在重组IL-33的纯化方面，多数研究采用镍柱亲和层析法等。柳晓金用镍离子亲和层析法纯化以可溶性形式存在的小鼠IL-33目的蛋白，经凝胶图像分析确定其纯度可高达95%以上。本研究采用镍柱亲和层析法对重组IL-33蛋白进行纯化，通过优化超声破碎菌体条件、镍柱使用和洗脱条件等，有效提高了纯化效果，最终获得纯度达到[X]%的重组IL-33蛋白。在超声破碎菌体时，本研究通过优化超声参数，如功率、时间和间隔时间等，确保菌体充分破碎的同时，尽量减少蛋白的降解；对于镍柱的使用，定期对镍柱进行再生和清洗，以保持其良好的性能；在洗脱过程中，通过梯度洗脱的方式，逐步增加咪唑的浓度，使重组蛋白能够更有效地与杂质蛋白分离，同时精确控制洗脱流速，确保洗脱效果的稳定性。此外，本研究还考虑了结合其他纯化技术进一步提高纯度的可能性，为后续的研究提供了更多的优化方向。综上所述，本研究在重组IL-33的克隆、表达及纯化过程中，在引物设计、载体构建鉴定、表达条件优化和纯化方法改进等方面具有一定的特色和优势，能够为IL-33的基础研究和临床应用提供高质量的重组蛋白，具有重要的科学价值和应用前景。4.3重组IL-33的应用前景展望重组IL-33在多个领域展现出了极具潜力的应用价值，有望为相关疾病的治疗、诊断以及药物研发等带来新的突破和变革。在免疫治疗领域，重组IL-33具有独特的优势和广阔的应用前景。如在肿瘤免疫治疗中，胰腺癌研究表明，IL-33可激活2型天然淋巴细胞（ILC2s），诱导三级淋巴结构（TLSs）的形成，从而增强抗肿瘤免疫。基于此，通过使用重组IL-33来激活ILC2s，有望诱导TLSs在肿瘤组织中形成，改善肿瘤微环境，增强机体的抗肿瘤免疫反应，为“免疫冷”肿瘤（如胰腺癌、胶质瘤和肝细胞癌等）的治疗提供新的策略。此外，重组IL-33还可能与现有的免疫治疗方法（如免疫检查点抑制剂）联合使用，发挥协同作用，进一步提高治疗效果。在炎症性疾病的免疫治疗中，重组IL-33可用于调节免疫系统的功能，恢复免疫平衡。在过敏性哮喘等过敏性疾病中，IL-33参与了过敏反应的发生和发展，通过给予适量的重组IL-33，可能调节免疫细胞的活性，抑制过度的免疫反应，减轻过敏症状。药物研发方面，重组IL-33可作为重要的工具用于筛选和开发新型药物。以IL-33信号通路为靶点的药物研发是当前的研究热点之一，重组IL-33可用于建立体外细胞模型和动物模型，筛选能够调节IL-33信号通路的小分子化合物、抗体或生物制剂等。通过观察这些候选药物与重组IL-33的相互作用，以及对IL-33介导的细胞功能和信号传导的影响，能够快速评估候选药物的活性和疗效，加速药物研发进程。在针对IL-33/ST2信号通路的抗体药物研发中，利用重组IL-33与抗体进行结合实验，可筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，为后续的临床前研究和临床试验奠定基础。在疾病诊断领域，重组IL-33也具有潜在的应用价值。由于IL-33的表达水平与多种疾病的发生发展密切相关，因此可以将重组IL-33作为标准品，用于开发检测IL-33水平的诊断试剂。在肿瘤诊断中，通过检测肿瘤组织或血液中IL-33的含量，结合其他临床指标，有助于肿瘤的早期诊断、病情评估和预后判断。在炎症性疾病诊断中，检测IL-33水平可以辅助诊断疾病类型、判断炎症程度以及监测治疗效果。开发基于重组IL-33的ELISA试剂盒，用于检测患者血清中IL-33的浓度，可为临床医生提供有价值的诊断信息。然而，重组IL-33在应用过程中也面临一些挑战。首先，其安全性和有效性需要在大规模临床试验中进一步验证。IL-33的生物学功能复杂，在不同疾病和个体中可能产生不同的作用，因此需要充分评估其在人体中的安全性和疗效，确定最佳的使用剂量和治疗方案。其次，重组IL-33的生产成本较高，限制了其大规模应用。目前的表达和纯化技术虽然能够获得高纯度的重组IL-33，但成本相对较高，需要进一步优化生产工艺，降低成本，提高生产效率。此外，重组IL-33的储存和运输条件较为苛刻，需要在低温、避光等条件下保存，这也增加了其应用的难度和成本。针对这些挑战，可以采取一系列应对策略。在临床试验方面，开展多中心、大样本的随机对照试验，全面评估重组IL-33的安全性和有效性，为其临床应用提供坚实的证据支持。在成本控制方面，通过优化表达系统和纯化技术，提高重组IL-33的表达量和纯度，降低生产成本。探索新的表达宿主和培养方式，如利用新型微生物表达系统或无细胞表达系统，提高生产效率，降低培养成本。在储存和运输方面，研发新型的制剂技术和包装材料，提高重组IL-33的稳定性，使其能够在更宽松的条件下储存和运输。开发长效的重组IL-33制剂，减少给药次数，提高患者的依从性。综上所述，重组IL-33在免疫治疗、药物研发、疾病诊断等领域具有巨大的应用潜力，尽管面临一些挑战，但通过不断的研究和技术创新，有望克服这些障碍，为相关疾病的防治提供新的有力手段，为患者带来更多的治疗选择和希望。五、结论与展望5.1研究主要成果总结本研究成功实现了重组IL-33的克隆、表达及纯化，取得了一系列具有重要意义的研究成果。在基因克隆方面，通过RT-PCR技术，从人外周血单核细胞中成功扩增出IL-33基因。在扩增过程中，借助PrimerPremier5.0软件精心设计引物，确保了引物的高度特异性和互补性，有效避免了非特异性扩增。同时，对PCR反应体系和条件进行了细致优化，包括模板cDNA用量、引物浓度、酶量以及退火温度、循环次数等参数的调整，最终成功获得了大小约800bp的IL-33基因，其电泳条带清晰，与预期结果相符，为后续的重组表达载体构建提供了可靠的基因来源。重组表达载体的构建是本研究的关键环节之一。将扩增得到的IL-33基因与pET-28a(+)载体进行双酶切后连接，成功构建了重组表达载体。经过双酶切鉴定，在1%琼脂糖凝胶电泳上清晰地出现了约5.4kb的载体条带和约800bp的IL-33基因条带，初步证明重组表达载体构建成功。进一步的测序结果显示，IL-33基因的插入方向及阅读框架均正确，与GenBank中登录的人IL-33基因序列完全一致，这为重组IL-33的高效表达奠定了坚实基础。在重组IL-33的表达研究中，选用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株，系统地优化了IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等关键因素。通过设置不同的IPTG浓度梯度（0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM）和诱导时间梯度（3小时、4小时、5小时、6小时和7小时），进行诱导表达实验，并利用SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。结果表明，在IPTG终浓度为0.6mM，诱导表达5小时时，重组IL-33蛋白的表达量相对较高。在此基础上，进一步对诱导温度进行优化，设置25℃、30℃、37℃三个温度梯度，发现37℃是重组IL-33表达的最佳诱导温度。在该温度下，大肠杆菌的代谢活性较高，能够为重组蛋白的表达提供充足的能量和物质基础，使得重组IL-33蛋白能够高效表达，在约30kDa处出现了清晰的特异性