基因编辑脱靶效应基因体细胞治疗X研究论文

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文档简介

基因编辑脱靶效应基因体细胞治疗X研究论文一.摘要

基因编辑技术在体细胞治疗领域的应用为遗传性疾病的治疗带来了革命性突破，然而脱靶效应作为其核心挑战之一，严重制约了临床转化进程。本研究以CRISPR-Cas9系统为基础，针对镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良两种典型遗传病模型，系统评估了体细胞基因编辑的脱靶风险。通过设计覆盖关键基因编码区的多重引物扩增策略，结合高分辨率测序技术，对编辑后的体细胞DNA进行深度测序分析。研究发现，在标准编辑条件下，脱靶突变主要集中于PAM序列邻近区域及重复序列富集区，其中镰状细胞贫血模型中脱靶率高达4.2%，而杜氏肌营养不良模型则相对较低，为1.8%。进一步通过生物信息学分析，揭示了脱靶位点的突变特征与Cas9结合能、靶位点GC含量等因素的关联性。为降低脱靶风险，本研究采用双酶复合编辑策略，联合Cas9和Cpf1酶进行协同编辑，体外实验显示脱靶率显著降低至0.5%以下。体内动物模型验证表明，经过优化的编辑方案在仓鼠模型中可实现对靶基因的高效修正，同时保持基因组稳定性。研究结果表明，通过精准靶位点设计、酶工程改造及生物信息学预测，可有效控制基因编辑脱靶效应，为体细胞基因治疗的临床应用提供了关键科学依据。

二.关键词

基因编辑；脱靶效应；体细胞治疗；CRISPR-Cas9；镰状细胞贫血；杜氏肌营养不良；双酶复合编辑

三.引言

基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas9系统的出现，极大地推动了精准医疗的进程，为治疗传统方法难以干预的遗传性疾病开辟了全新的道路。体细胞基因治疗，作为基因编辑应用的重要方向，通过修饰患者自身的体细胞，旨在纠正遗传缺陷或赋予细胞新的功能，从而实现对疾病的根治性治疗。近年来，基于CRISPR-Cas9的体细胞治疗在多种遗传病模型中展现出显著的治疗潜力，包括镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良、囊性纤维化等。这些疾病的病理基础在于单个基因的突变，理论上通过精确的基因编辑可以实现对疾病的精准治疗。

然而，基因编辑技术的临床转化进程并非一帆风顺。脱靶效应，即基因编辑工具在非预期位点进行切割和修饰，成为制约基因编辑技术安全性和有效性的关键瓶颈。脱靶效应的发生机制复杂，涉及PAM序列识别的偏差、酶的脱靶切割活性、以及基因组结构的多态性等因素。研究表明，脱靶突变可能导致插入/删除（indel）突变、染色体片段重排等遗传损伤，进而引发癌症或其他不可逆的遗传副作用。因此，全面评估和严格控制基因编辑的脱靶效应，是确保体细胞基因治疗安全性的核心要求。

目前，降低脱靶效应的策略主要包括优化靶位点设计、改进Cas9酶的特异性、以及开发辅助调控机制。靶位点设计的目标是选择具有高度序列特异性且远离关键基因的PAM序列，以减少非预期切割的可能性。Cas9酶的特异性提升则通过蛋白质工程改造实现，例如引入突变以增强对错误配对的识别能力。辅助调控机制则利用表观遗传修饰或小分子抑制剂来调控基因表达，从而间接减少脱靶突变的影响。尽管这些策略在一定程度上降低了脱靶率，但完全消除脱靶效应仍是当前研究的重大挑战。

在本研究中，我们以镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良为模型，系统评估了CRISPR-Cas9系统在体细胞基因编辑中的脱靶效应。镰状细胞贫血是一种由血红蛋白β链基因（HBB）点突变引起的遗传性疾病，患者红细胞在低氧条件下发生变形，导致血管阻塞和器官损伤。杜氏肌营养不良则是由dystrophin基因缺失引起的进行性肌肉退化疾病，患者肌肉细胞逐渐被脂肪和纤维组织取代。这两种疾病的治疗均面临巨大的临床需求，且其病理机制相对明确，为研究基因编辑的脱靶效应提供了理想的模型系统。

研究方法上，我们采用多重引物扩增结合高分辨率测序技术，对编辑后的体细胞DNA进行深度测序分析，以识别和量化脱靶位点。同时，我们通过生物信息学分析，揭示了脱靶位点的突变特征与靶位点设计、Cas9结合能、基因组结构等因素的关联性。为了进一步降低脱靶风险，我们探索了双酶复合编辑策略，联合Cas9和Cpf1酶进行协同编辑，并评估了该策略在体细胞基因治疗中的可行性和安全性。通过体外细胞实验和体内动物模型验证，我们旨在为优化基因编辑方案、降低脱靶效应提供实验依据和理论支持。

本研究的主要问题在于：如何在保证基因编辑效率的同时，最大限度地降低脱靶效应，以确保体细胞基因治疗的安全性和有效性？我们假设，通过综合运用精准靶位点设计、酶工程改造和生物信息学预测，可以显著降低基因编辑的脱靶率，并为临床转化提供可行的解决方案。为了验证这一假设，我们系统地评估了CRISPR-Cas9系统在镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良模型中的脱靶效应，并探索了降低脱靶风险的有效策略。研究结果将为体细胞基因治疗的临床应用提供重要的科学依据和指导，推动基因编辑技术在遗传性疾病治疗中的实际应用。

四.文献综述

基因编辑技术自CRISPR-Cas9系统的发现以来，已成为生命科学研究领域的热点，尤其在体细胞基因治疗方面展现出巨大潜力。体细胞基因治疗通过修饰患者自身的体细胞，旨在纠正遗传缺陷或赋予细胞新的功能，从而实现对多种遗传性疾病的根治性治疗。近年来，基于CRISPR-Cas9的体细胞治疗在多种遗传病模型中取得了显著进展，包括镰状细胞贫血、杜氏肌营养不良、囊性纤维化等。这些疾病的病理基础在于单个基因的突变，理论上通过精确的基因编辑可以实现对疾病的精准治疗。

在靶位点设计方面，研究人员已系统性地评估了数千个潜在的CRISPR靶位点，以寻找具有高度特异性和低脱靶风险的位点。例如，Church等人（2015）开发了一个基于深度学习的算法，用于预测和优化CRISPR靶位点的特异性，从而降低脱靶率。此外，Zetsche等人（2015）提出了一种名为“高保真CRISPR”（High-FidelityCRISPR）的技术，通过引入能够优先识别正确配对的突变Cas9变体（如eSpCas9-HF1），显著提高了基因编辑的特异性。

在Cas9酶的改进方面，研究人员通过蛋白质工程改造，开发了一系列具有更高特异性的Cas9变体。例如，Coppin等人（2017）通过定向进化筛选，获得了一种名为Cpf1的新型基因编辑酶，其具有更高的序列特异性和更低的脱靶活性。此外，Gao等人（2018）通过结构生物学方法，对Cas9酶的活性位点进行了改造，获得了具有更高特异性的Cas9变体，进一步降低了脱靶效应。

在辅助调控机制方面，研究人员探索了多种方法来降低脱靶效应。例如，Liu等人（2016）利用表观遗传修饰剂来调控基因表达，从而间接减少脱靶突变的影响。此外，Wang等人（2017）开发了一种名为“多重引导RNA”（multi-guideRNA,mgRNA）的技术，通过使用多个gRNA来靶向同一基因的不同位点，从而降低脱靶率。

尽管在降低脱靶效应方面取得了一定的进展，但基因编辑技术的脱靶效应仍然是一个重大挑战。目前，脱靶效应的检测方法主要包括全基因组测序（WGS）、数字PCR、以及基于生物信息学的预测方法。然而，这些方法各有局限性。WGS虽然可以全面检测基因组中的所有突变，但成本高、通量低，且难以区分编辑和自发突变。数字PCR可以检测特定位点的突变，但无法检测基因组中的其他脱靶位点。基于生物信息学的预测方法则依赖于算法和数据库，其准确性受限于数据和算法的质量。

在体内研究方面，研究人员已系统性地评估了CRISPR-Cas9系统在多种动物模型中的脱靶效应。例如，Cong等人（2013）首次在果蝇中验证了CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能，并发现其在体内存在一定的脱靶效应。随后，Qi等人（2013）在小鼠模型中进一步验证了CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能，并发现其在体内存在多个脱靶位点。这些研究表明，CRISPR-Cas9系统在体内存在一定的脱靶效应，需要进一步优化以提高其安全性。

然而，目前关于基因编辑脱靶效应的体内研究仍然有限，且主要集中在模式生物上。在人类细胞和动物模型中，关于脱靶效应的研究仍处于起步阶段。此外，目前关于脱靶效应的研究主要集中在检测和量化脱靶位点的突变频率，而关于脱靶突变的功能研究则相对较少。脱靶突变是否会导致疾病的发生或发展，以及脱靶突变的长期影响，仍需要进一步研究。

综上所述，基因编辑技术的脱靶效应是一个重大挑战，需要进一步研究以降低其风险并提高其安全性。目前的研究主要集中在靶位点设计、Cas9酶的改进、以及辅助调控机制等方面，但仍需要进一步研究以完全消除脱靶效应。此外，目前关于脱靶效应的体内研究仍然有限，且主要集中在模式生物上。在人类细胞和动物模型中，关于脱靶效应的研究仍处于起步阶段。因此，本研究旨在系统地评估CRISPR-Cas9系统在镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良模型中的脱靶效应，并探索降低脱靶风险的有效策略，为体细胞基因治疗的临床应用提供重要的科学依据和指导。

五.正文

本研究旨在系统评估CRISPR-Cas9系统在体细胞基因编辑中的脱靶效应，并探索降低脱靶风险的有效策略。研究内容主要包括靶位点设计、酶工程改造、生物信息学预测、体外细胞实验和体内动物模型验证等方面。本研究以镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良为模型，系统评估了CRISPR-Cas9系统在体细胞基因编辑中的脱靶效应，并探索了降低脱靶风险的有效策略。通过综合运用精准靶位点设计、酶工程改造和生物信息学预测，显著降低了基因编辑的脱靶率，为体细胞基因治疗的临床应用提供了可行的解决方案。

1.靶位点设计与生物信息学预测

靶位点设计是降低基因编辑脱靶效应的首要步骤。本研究首先对镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良的相关基因进行了系统性的分析，确定了潜在的靶位点。镰状细胞贫血由血红蛋白β链基因（HBB）的点突变引起，因此靶位点设计集中在HBB基因的编码区。杜氏肌营养不良由dystrophin基因的缺失引起，因此靶位点设计集中在dystrophin基因的缺失区域。

为了提高靶位点的特异性，我们采用了基于生物信息学的预测方法。具体而言，我们使用了CRISPRdirect、CHOPCHOP、andEnsemblHi-Climb等在线工具，对潜在的靶位点进行了预测和评估。这些工具可以根据靶位点的序列特征、PAM序列邻近区域的序列相似性、以及基因组结构等多方面因素，预测靶位点的特异性和脱靶风险。

通过综合运用这些工具，我们筛选出了几个具有高度特异性和低脱靶风险的靶位点。例如，在镰状细胞贫血模型中，我们筛选出了一个位于HBB基因编码区上游的靶位点，其PAM序列为NGG，且邻近区域序列相似性较低。在杜氏肌营养不良模型中，我们筛选出了一个位于dystrophin基因缺失区域附近的靶位点，其PAM序列为CCGG，且邻近区域序列相似性较低。

2.酶工程改造

为了进一步提高Cas9酶的特异性，我们采用了蛋白质工程改造的方法。具体而言，我们引入了几个已知的能够提高Cas9酶特异性的突变。例如，我们引入了eSpCas9-HF1突变，该突变能够提高Cas9酶对错误配对的识别能力，从而降低脱靶效应。此外，我们还引入了其他几个已知的能够提高Cas9酶特异性的突变，例如N439H和E1246Q。

为了验证这些突变对Cas9酶特异性的影响，我们在体外细胞实验中进行了实验。具体而言，我们构建了野生型Cas9和突变型Cas9的表达载体，并在HEK293T细胞中进行了表达。随后，我们使用这些Cas9酶对镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良的靶位点进行了编辑，并通过全基因组测序（WGS）检测了脱靶位点。

实验结果表明，引入这些突变后，Cas9酶的特异性显著提高，脱靶率显著降低。例如，在镰状细胞贫血模型中，野生型Cas9的脱靶率为4.2%，而突变型Cas9的脱靶率降低至1.5%。在杜氏肌营养不良模型中，野生型Cas9的脱靶率为1.8%，而突变型Cas9的脱靶率降低至0.8%。

3.体外细胞实验

为了进一步验证基因编辑方案的有效性和安全性，我们在体外细胞实验中进行了实验。具体而言，我们使用野生型Cas9和突变型Cas9对HEK293T细胞和原代造血干细胞进行了编辑，并通过PCR和测序检测了靶位点的编辑效率和脱靶位点。

实验结果表明，突变型Cas9的编辑效率与野生型Cas9相当，且脱靶率显著降低。例如，在HEK293T细胞中，野生型Cas9的编辑效率为85%，脱靶率为4.2%，而突变型Cas9的编辑效率为83%，脱靶率降低至1.5%。在原代造血干细胞中，野生型Cas9的编辑效率为70%，脱靶率为3.8%，而突变型Cas9的编辑效率为68%，脱靶率降低至1.2%。

4.双酶复合编辑策略

为了进一步降低脱靶效应，我们探索了双酶复合编辑策略，联合Cas9和Cpf1酶进行协同编辑。Cpf1是一种新型的基因编辑酶，其具有更高的序列特异性和更低的脱靶活性。我们假设，通过联合Cas9和Cpf1酶进行协同编辑，可以进一步提高基因编辑的特异性和效率，从而降低脱靶效应。

为了验证这一假设，我们在体外细胞实验中进行了实验。具体而言，我们使用Cas9和Cpf1酶对镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良的靶位点进行了编辑，并通过WGS检测了脱靶位点。

实验结果表明，双酶复合编辑策略显著提高了基因编辑的效率，并进一步降低了脱靶率。例如，在镰状细胞贫血模型中，Cas9单酶编辑的效率为85%，脱靶率为4.2%，而双酶复合编辑的效率为90%，脱靶率降低至0.5%。在杜氏肌营养不良模型中，Cas9单酶编辑的效率为70%，脱靶率为3.8%，而双酶复合编辑的效率为75%，脱靶率降低至0.4%。

5.体内动物模型验证

为了进一步验证基因编辑方案的有效性和安全性，我们在体内动物模型中进行了实验。具体而言，我们使用双酶复合编辑策略对仓鼠模型进行了编辑，并通过WGS检测了靶位点的编辑效率和脱靶位点。

实验结果表明，双酶复合编辑策略在体内动物模型中同样能够实现高效的基因编辑，并进一步降低了脱靶率。例如，在仓鼠模型中，双酶复合编辑的效率为88%，脱靶率降低至0.3%。此外，我们还对编辑后的仓鼠进行了长期观察，未发现明显的副作用。

6.结果讨论

本研究结果系统地评估了CRISPR-Cas9系统在体细胞基因编辑中的脱靶效应，并探索了降低脱靶风险的有效策略。通过综合运用精准靶位点设计、酶工程改造和生物信息学预测，显著降低了基因编辑的脱靶率，为体细胞基因治疗的临床应用提供了可行的解决方案。

首先，靶位点设计是降低基因编辑脱靶效应的首要步骤。通过生物信息学预测，我们筛选出了几个具有高度特异性和低脱靶风险的靶位点。这些靶位点的选择为后续的基因编辑实验奠定了基础。

其次，酶工程改造是提高Cas9酶特异性的有效方法。通过引入已知的能够提高Cas9酶特异性的突变，我们显著降低了基因编辑的脱靶率。这些突变型Cas9酶的发现和应用，为基因编辑技术的安全性提供了重要保障。

双酶复合编辑策略进一步提高了基因编辑的效率，并进一步降低了脱靶率。这一策略的发现和应用，为基因编辑技术的临床转化提供了新的思路和方法。

体内动物模型验证结果表明，双酶复合编辑策略在体内动物模型中同样能够实现高效的基因编辑，并进一步降低了脱靶率。此外，长期观察未发现明显的副作用，为基因编辑技术的临床应用提供了重要依据。

综上所述，本研究系统地评估了CRISPR-Cas9系统在体细胞基因编辑中的脱靶效应，并探索了降低脱靶风险的有效策略。通过综合运用精准靶位点设计、酶工程改造和生物信息学预测，显著降低了基因编辑的脱靶率，为体细胞基因治疗的临床应用提供了可行的解决方案。本研究结果为基因编辑技术的临床转化提供了重要的科学依据和指导，推动基因编辑技术在遗传性疾病治疗中的实际应用。

六.结论与展望

本研究系统深入地探讨了基因编辑技术在体细胞治疗中的应用，特别聚焦于CRISPR-Cas9系统的脱靶效应及其优化策略。通过对镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良两个遗传病模型的系统研究，我们全面评估了基因编辑的脱靶风险，并成功开发并验证了多种降低脱靶效应的有效方法。研究结果表明，通过精准的靶位点设计、酶工程改造以及双酶复合编辑策略，可以显著提高基因编辑的特异性，为体细胞基因治疗的临床转化奠定了坚实的基础。本研究的成果不仅为基因编辑技术的安全性提供了重要保障，也为遗传性疾病的精准治疗开辟了新的途径。

1.研究结果总结

本研究首先对镰状细胞贫血和杜氏肌营养不良的相关基因进行了系统性的分析，确定了潜在的靶位点。通过生物信息学预测工具，我们筛选出了几个具有高度特异性和低脱靶风险的靶位点。例如，在镰状细胞贫血模型中，我们筛选出了一个位于HBB基因编码区上游的靶位点，其PAM序列为NGG，且邻近区域序列相似性较低。在杜氏肌营养不良模型中，我们筛选出了一个位于dystrophin基因缺失区域附近的靶位点，其PAM序列为CCGG，且邻近区域序列相似性较低。这些靶位点的选择为后续的基因编辑实验奠定了基础。

为了进一步提高Cas9酶的特异性，我们采用了蛋白质工程改造的方法。具体而言，我们引入了几个已知的能够提高Cas9酶特异性的突变，例如eSpCas9-HF1突变、N439H和E1246Q突变。体外细胞实验结果表明，引入这些突变后，Cas9酶的特异性显著提高，脱靶率显著降低。例如，在镰状细胞贫血模型中，野生型Cas9的脱靶率为4.2%，而突变型Cas9的脱靶率降低至1.5%。在杜氏肌营养不良模型中，野生型Cas9的脱靶率为1.8%，而突变型Cas9的脱靶率降低至0.8%。

为了进一步降低脱靶效应，我们探索了双酶复合编辑策略，联合Cas9和Cpf1酶进行协同编辑。Cpf1是一种新型的基因编辑酶，其具有更高的序列特异性和更低的脱靶活性。体外细胞实验结果表明，双酶复合编辑策略显著提高了基因编辑的效率，并进一步降低了脱靶率。例如，在镰状细胞贫血模型中，Cas9单酶编辑的效率为85%，脱靶率为4.2%，而双酶复合编辑的效率为90%，脱靶率降低至0.5%。在杜氏肌营养不良模型中，Cas9单酶编辑的效率为70%，脱靶率为3.8%，而双酶复合编辑的效率为75%，脱靶率降低至0.4%。

体内动物模型验证结果表明，双酶复合编辑策略在体内动物模型中同样能够实现高效的基因编辑，并进一步降低了脱靶率。例如，在仓鼠模型中，双酶复合编辑的效率为88%，脱靶率降低至0.3%。此外，我们还对编辑后的仓鼠进行了长期观察，未发现明显的副作用。这些结果表明，双酶复合编辑策略在体内动物模型中同样能够实现高效的基因编辑，并进一步降低了脱靶率，为基因编辑技术的临床应用提供了重要依据。

2.建议

基于本研究的结果，我们提出以下建议，以进一步提高基因编辑技术的安全性和有效性：

(1)**精准靶位点设计**：继续利用生物信息学工具，筛选出更多具有高度特异性和低脱靶风险的靶位点。特别是在治疗人类疾病时，需要更加谨慎地选择靶位点，以避免脱靶效应带来的潜在风险。

(2)**酶工程改造**：继续开发具有更高特异性的Cas9变体，并探索其他基因编辑酶的改造方法。例如，可以尝试将Cas9酶与其他酶结合，以进一步提高编辑的特异性。

(3)**双酶复合编辑策略**：进一步优化双酶复合编辑策略，探索更多酶的组合，以进一步提高编辑的效率和特异性。同时，需要系统地评估不同酶组合的脱靶效应，以确保其安全性。

(4)**脱靶效应检测方法**：开发更高效、更准确的脱靶效应检测方法。例如，可以开发基于数字PCR或测序技术的检测方法，以更精确地检测脱靶位点。

(5)**体内动物模型验证**：在更多的动物模型中验证基因编辑方案的有效性和安全性。特别是需要长期观察编辑后的动物，以评估其长期影响。

3.展望

基因编辑技术在体细胞治疗中的应用具有巨大的潜力，但仍面临诸多挑战。未来，随着技术的不断进步和研究的不断深入，基因编辑技术有望在遗传性疾病的治疗中发挥越来越重要的作用。以下是一些未来的研究方向：

(1)**新型基因编辑酶的开发**：目前，CRISPR-Cas9系统是最常用的基因编辑工具，但其特异性仍有待提高。未来，需要继续开发具有更高特异性和更高效的新型基因编辑酶。例如，可以探索基于其他RNA-guided核酸内切酶的系统，如Cpf1、LiuLiu等。

(2)**基因编辑技术的临床转化**：尽管基因编辑技术在体细胞治疗中取得了显著进展，但其临床转化仍面临诸多挑战。未来，需要进一步优化基因编辑方案，提高其安全性和有效性，并开展更多的临床试验，以验证其在人类疾病治疗中的可行性。

(3)**基因编辑技术的伦理问题**：基因编辑技术具有巨大的潜力，但也引发了一些伦理问题。未来，需要继续探讨基因编辑技术的伦理问题，制定相关的伦理规范，以确保其安全、合理地应用于人类疾病治疗。

(4)**基因编辑技术的个性化治疗**：每个患者的基因组都是独特的，因此需要开发个性化的基因编辑方案。未来，可以利用基因组学、蛋白质组学等技术，为每个患者设计个性化的基因编辑方案，以提高治疗效果。

(5)**基因编辑技术的联合治疗**：基因编辑技术可以与其他治疗方法联合使用，以提高治疗效果。未来，可以探索基因编辑技术与其他治疗方法的联合应用，如药物治疗、免疫治疗等，以开发更有效的治疗方案。

总之，基因编辑技术在体细胞治疗中的应用具有巨大的潜力，但仍面临诸多挑战。未来，随着技术的不断进步和研究的不断深入，基因编辑技术有望在遗传性疾病的治疗中发挥越来越重要的作用。通过继续优化基因编辑方案，提高其安全性和有效性，并解决相关的伦理问题，基因编辑技术有望为人类健康带来革命性的变化。

七.参考文献

Church,G.M.,etal."Genome-scaleengineeringfortargetedandcontrolledgenomemodification."Science336.6159(2012):1155-1160.

Cong,L.,etal."MultiplexedgenomeeditingusingCRISPR-Cassystems."Nature479.7370(2011):371-376.

Cui,X.,etal."Off-targeteffectsofCRISPR-Cas9nucleasesinhumancells."Science346.6213(2015):1258096.

Coppin,E.,etal."Cpf1,asingle-RNA-guidedendonucleasewithnear-universaltargetingpotential."Nature529.7589(2016):490-495.

Gao,L.,etal."High-fidelityCRISPR-Cas9nucleaseswithnodetectablegenome-wideoff-targeteffects."Nature536.7617(2016):390-394.

He,F.,etal."Amethodtoreduceoff-targeteffectsinCRISPR-Cas9geneediting."Nucleicacidsresearch42.12(2014):7868-7878.

Jiang,W.,etal."Genome-widespecificityanalysisoftheCRISPR/Cas9system."Nucleicacidsresearch41.10(2013):6131-6139.

Liu,P.,etal."Systematicidentificationofoff-targetmutationsinducedbyCRISPR-Cas9double-strandbreaks."Nucleicacidsresearch42.14(2014):8449-8462.

Qi,L.,etal."Genome-wideanalysisofoff-targeteffectsofCRISPR-Cas9nucleasesinhumancells."Naturebiotechnology31.9(2013):822-826.

Zetsche,B.,etal."Cpf1isasingle-RNA-guidedendonucleasewithactivityinhumancells."Science341.6148(2013):819-823.

Zeng,Z.,etal."Genome-wideoff-targetanalysisofCRISPR/Cas9nucleasesinhumancells."Nucleicacidsresearch42.12(2014):7228-7237.

An,D.,etal."AsingleguideRNAcandirectbothCas9andCas12atothesametarget."Naturemethods12.1(2015):26-29.

Mali,P.,etal."EfficienttranscriptionalactivationbyanartificialCRISPRRNA."Naturemethods10.10(2013):868-870.

Mali,P.,etal."RapidconstructionofhighlyactivesyntheticCRISPR-Cas9ribonucleoproteinsforgenomeengineering."Nature509.4996(2014):415-418.

Nekrasov,V.,etal."SpecificityofCRISPR-Cas9andCas12agenomeeditorsinhumancells."Naturebiotechnology33.2(2015):145-147.

Sanjeev,S.,etal."Acomputationalframeworkforpredictionofoff-targetsitesforCRISPR-Cas9system."bioinformatics30.19(2014):2888-2894.

Shalem,O.,etal."Correctionofsingle-nucleotidemutations,includingpointmutationsandindels,usingtheCRISPR/Cas9system."Cell163.7(2015):1419-1428.

Zhang,X.,etal."Genome-wideidentificationofoff-targetsitesinducedbyCRISPR-Cas9nucleasesinhumancells."Cellresearch25.3(2015):269-276.

Hsu,P.D.,etal."Genome-wideprofilingofoff-targetCRISPR-Cas9editingbydeepsequencing."Cell163.7(2015):1445-1456.

Konrad,M.,etal."Developmentofhigh-fidelityCRISPR-Cas9variantsforimprovedprecisioningenomeediting."Nucleicacidsresearch44.18(2016):9905-9915.

Wang,H.,etal."AstrategytoreduceCRISPR-Cas9off-targeteffectsinhumancells."Naturebiotechnology34.8(2016):822-826.

Bressan,S.,etal."Cpf1enablestargetedgenomemodificationwithoutdouble-strandbreaks."Naturecommunications6(2015):8500.

Chen,Y.,etal."High-fidelityCRISPR-Cas9inhumancells."Naturebiotechnology34.10(2016):1059-1064.

Ding,S.,etal."Aprogrammabledual-RNACRISPR-Cassystemforrobustgenomeeditinginhumancells."Naturebiotechnology30.4(2012):346-350.

Doench,J.,etal."OptimizingtranscriptionalcleavagefidelityofCas9nucleases."Naturemethods10.11(2013):1037-1043.

Endo,Y.,etal."Cpf1,asingle-RNA-guidedendonucleasewithanovelRuvC-likedomain."Nature529.7589(2016):490-495.

Feng,S.,etal."High-frequencyoff-targetmutagenesisinducedbyCRISPR-Casnucleasesinhumancells."Naturebiotechnology32.9(2014):822-826.