微生物检验技术-绪论

微生物检验技术-绪论第一页，共25页。微生物的概念和种类

（二）微生物的种类与命名

1.非细胞型微生物2.原核细胞型微生物3.真核细胞型微生物2第二页，共25页。微生物检验技术的发展趋势微生物检验常规技术包括显微技术，染色技术，灭菌和消毒技术，培养基制备技术，接种，分离纯化和培养技术，无菌取样技术，微生物的计数技术，菌种保藏技术，微生物常规鉴定技术等。传统常规的微生物检测方法检测时限长，过程烦琐。随着食品、药品及其他工业的发展以及人们对各类产品质量安全的重视，传统检测方法已经远不能满足微生物检测的需要，迫切需求灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的微生物检测技术和方法，建立和完善适应国际贸易的各类产品微生物检测技术和体系迫在眉睫。3第三页，共25页。传统检验技术显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一，也是应用比较早的技术。实验室中常用的有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。利用血细胞计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。4第四页，共25页。传统检验技术革兰氏染色技术：是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法。培养计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后,其中的微生物充分分散成单个细胞,取一定量的稀释样液涂在平板上,经过培养,由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落,即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。菌落形成单位cfu，colony-formingunit。5第五页，共25页。现代微生物检测技术近几年世界各国的许多机构和学者都致力于快速、简便、特异、敏感、低耗且实用的检测技术和方法的研究。对微生物的检测，其研究的技术手段产生了很大的变革：微生物检测技术已由培养水平逐步向分子水平迈进；近年来兴起的基因芯片技术及自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法；气相色谱法、气质联用等现代仪器分析法也应用于微生物检测中。6第六页，共25页。基因芯片技术基因芯片：采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体而得到的一种信息检测芯片，其本质名称是脱氧核糖核酸微阵列（DNA微阵列）。基因芯片的工作原理：利用碱基配对的原则来检测样品的基因。将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，将待测微生物样品的DNA或RNA通过PCR或RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入标记分子后，与位于芯片上的已知碱基顺序的DNA探针杂交，再通过扫描系统检测探针分子杂交信号强度，然后以计算机技术对信号进行综合分析后，即可获得样品中大量基因序列及表达信息，以对之做出定性及定量的研究，来确定检测样品是否存在某些特定微生物。7第七页，共25页。目前，在世界各国的积极推动下，基因芯片的应用从最初的医学领域向其他方面扩展。近几年来，基因芯片的应用也开始在食品工业中崭露头角，许多学者利用基因芯片对食品中的常见致病菌进行了分析、检测，不仅敏感度高于传统方法，且操作简单，重复性好；基因芯片技术也是近几年运用的病毒检测新技术之一，现在世界各国都在积极地进行能够对人类构成危害的各种病毒快速检测芯片的研究；应用基因芯片可对病人、出入境食品、动植物及其产品进行检测。随着社会的发展和科技进步，特别是近年来兴起的基因芯片技术及自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法。8第八页，共25页。仪器法的应用原理是当细菌生产繁殖时,将蛋白质、糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机酸等带电荷的小分子物质,改变培养液的导电度,这样,测量电阻和导电度的变化,就可推算出样品原来的含菌数。Bactometer系统是利用电阻抗、电容抗或总阻抗等三种参数的自动微生物监测系统。它能快速测定样品中细菌的污染程度,从而快速提供品质控制的信息。1、电阻电导检测器9第九页，共25页。应用电阻抗技术的全自动微生物监测系统——BACTOMETER用于快速检测食品、化妆品、药品等的细菌总数、大肠菌群、酵母菌/霉菌、乳酸菌数…

10第十页，共25页。2.微型全自动荧光酶标分析仪(Mini-VIDAS)主要应用酶联荧光技术(ELFA),ELFA技术具有优异的敏感性和特异性。可检验李斯特氏菌、单增李斯特氏菌、沙门氏菌、葡萄球菌肠毒素、空肠弯曲杆菌、大肠杆菌O157等。使用该仪器操作简便,只需加1次样品,按1次键,整个检测过程都由仪器自动完成。11第十一页，共25页。3.微生物的微型、自动化鉴定系统API系统：法国Bio-梅里埃公司生产，有20种不同的生化反应，可鉴定700多种细菌，分不同系列，如20A—厌氧菌，20E—肠道菌，为长形卡片。Enterotube系统：美国罗氏公司生产，用一条有8-12个分隔小室的划艇形塑料管制成，面上覆盖膜。有15种生化反应，专门鉴定肠道菌。Biolog系统：96孔板型，美国安普公司生产，可自动化鉴定，可鉴定1140种细菌。BBL系统：BD公司专门为中小型微生物实验室以及科研机构设计的经济型微生物鉴定系统。12第十二页，共25页。细菌半自动鉴定系统API数值鉴定系统BBL鉴定系统Biolog鉴定系统程序：1、获取辅助特征2、培养菌悬液加入生化板培养扫描鉴定打印结果13第十三页，共25页。微生物快速自动鉴定系统美国Biolog公司致力于微生物鉴定领域新技术新产品的开发、生产和销售，是全球高新技术百强之一，其独创的碳源利用方法已获美国FDA认可。Biolog鉴定系统可鉴定包括细菌、酵母和真菌在内约2000种微生物，便于各领域的微生物实验室用于对微生物的鉴定；另外，Biolog的智能软件和独特的设计理念又使其特别适用于生态研究领域。14第十四页，共25页。鉴定原理Biolog公司独创的碳源利用方法，利用微生物对不同碳源代谢率的差异，针对每一类微生物筛选95种不同碳源，配合四唑类显色物质（如TTC、TV），固定于96孔板上（A1孔为阴性对照），接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化（吸光度）以及由于微生物生长造成的浊度差异（浊度），与标准菌株数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。15第十五页，共25页。4.全自动微生物分析系统(Vitek-AMS)该系统为用于微生物鉴定及药敏试验的设备,能同时进行60~480个样品分析。其原理是将微生物数码鉴定的方法与计算机技术结合起来,实现了从读数、编码、解码、打印结果的鉴定全过程的自动化。根据不同的试卡,可以鉴定各种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌、奈瑟菌、酵母菌、芽孢杆菌等300余个种(属)的微生物,还可以进行临床细菌的药敏试验。16第十六页，共25页。其特点:①鉴定细菌类型广。②具有最大的准确性。国内外报道,鉴定最常见的细菌准确率98.4%。③鉴定时间短。鉴定细菌需6~10h,鉴定真菌需16~18h。④高度可重复性。AMS内的记忆系统,采用计算机处理,可随时补充最新的鉴定程序软件。⑤仪器操作方便,不需要专业人员,只要有一定的英语基础即可短期完成培训。17第十七页，共25页。全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK32/60/120法国biosMerieumx(生物梅里埃）生产的全自动微生物分析仪的一个系列，包括：VITEK－32、VITEK－60、VITEK－120等。

工作原理自动生化鉴定VITEK试卡的反应池内含风干底物。试卡由标准浓度菌液充填，然后放入测试槽内，读取器每小时量度卡片内样本在培养介质内生长变化值，直至最后结果打印出来。动态学方法：每小时自动检测每张卡片的反应情况，与数据库中的数据进行比较分析，达到系统预设的阈值时，自动报告结果。18第十八页，共25页。VITEK试卡由30个光化学反应微孔组成,每个微孔中含有用于鉴定或其他实验所需的底物/药物。然后通过培养后仪器对显色反应进行判断，利用数值法进行判定。根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。19第十九页，共25页。4.ATP生物发光法ATP广泛存在于各种活的生物体中,活的菌体中也有ATP,细菌死亡后,在细胞内酶的作用下,ATP将很快被分解。因此,通过测定样品的ATP浓度,即可推算出活菌数。ATP生物发光法要求样品中细菌浓度最低不少于1000个/mL,但这种灵敏度有时达不到卫生学要求。ATP生物发光法具有简便、灵敏、快速等优点,小型化的测试仪器便于随身携带,非常适合现场卫生监测。20第二十页，共25页。5.微热量计技术微热量计技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量,用微量热计测量产热量等数据,均存储于计算机中,经过适当信号上的数字模拟界面,在记录器上绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图。根据这些实验所得的热曲线图和已知细菌热曲线图直观比较,即对细菌进行鉴别。21第二十一页，共25页。6.快速、自动化微生物分析仪器（1）通用仪器：气相色谱仪及高压液相色谱仪（尤其适用于厌氧菌，分析脂肪酸和醇类）、质谱仪等。（2）专用仪器：药敏自动测定仪、生物发光测量仪、自动微生物检测仪、微生物菌落自动识别计数仪、微生物传感器等。（3）生物芯片仪：包括DNA和蛋白质芯片仪。（4）免疫学方法：免疫检测试剂盒、酶标仪。22第二十二页，共25页。三、微生物检验的质量管理微生物检验是疾病控制机构、产品质量监督管理部门、检测机构、产品生产企业等质量控制中心的重要检测项目，是疾病防治、卫生监测、产品卫生质量保证等不可缺少的依据和手段。随着社会的发展以及人们对各类产品质量安全的重视，对检验工作的质量和效率的要求越来越高，因此，对微生物检验实行全面质量管理和控制是必需的。23第二十三页，共25页。1.建立质量体系，抓好质量管理(1)为保证微生物检验工作的质量，首先应建立质量体系。以中