Chapter细菌与噬菌体的遗传重组

Chapter细菌与噬菌体的遗传重组第1页，共91页。待解决问题

细菌、噬菌体有什么特点？细菌、噬菌体中的基因是如何进行遗传重组？如何进行基因定位的？T4噬菌体第2页，共91页。细菌和噬菌体在遗传学研究中的优越性世代周期短

大肠杆菌（Escherichiacoli）20分钟可繁殖一代便于管理和生化分析

个体小，一半在1μm至几μm之间，操作管理方便便于研究基因突变

裸露的DNA分子（有的噬菌体为RNA分子），容易受环境条件的影响而发生突变；单倍体生物，不存在显性掩盖隐性问题，隐性突变也能表现出来第3页，共91页。便于研究基因的作用

影印培养，易检测出营养缺陷型突变，有利于从生化角度来研究基因的作用便于研究基因重组

细菌具有转化、转导和接合作用，可以进行精密的遗传分析便于研究基因的结构、功能和调控机制细菌和噬菌体的遗传物质简单，易于进行基因定位、结构分析和分离，基因的表达调控也使用能够与采用生理生化的方便进行深入研究便于进行遗传操作

染色体结构简单，没有组蛋白和其他蛋白的结合，更宜于进行遗传工程的操作第4页，共91页。1.细菌的遗传分析细菌的一般特征大肠杆菌的突变型及筛选细菌的遗传重组第5页，共91页。1.1细菌的一般特征大肠杆菌是最常见的原核生物试验材料，其基因组是一条完整的双链环状DNA链，长约4000kb，编码大约4000个基因第6页，共91页。第7页，共91页。1.2大肠杆菌的突变型及筛选1.2.1大肠杆菌的突变型E.coli突变类型合成代谢功能的突变型：如：甲硫氨酸缺陷型写作met-

（营养缺陷型）其相应的野生型写作：met+

抗性突变型：如：青霉素抗性菌株写作：penr

（抗生素抗性突变型）

青霉素敏感性菌株写作：pens

分解代谢功能的突变型：如：乳糖突变型写作lac-

（碳源突变型）其相应的野生型写作：lac+

第8页，共91页。1.2.2突变型的筛选(1)选择培养法：根据菌株在基本培养基和营养培养基上的生长表现将菌株分为原养型(原生营养型)与营养缺陷型。(2)显色(3)抗生素在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长第9页，共91页。1.2.3E.coli作遗传研究材料的优点（1）有许多营养缺陷型，且易于选择和鉴定（2）生活周期短：繁殖快，积累代谢物质多（3）结构简单:DNA裸露，单倍性，利于基因精细结构和基因功能表达调控的研究第10页，共91页。1.3细菌的遗传重组1、细菌的接合与中断杂交作图2、F′因子和性导3、细菌的转化与作图第11页，共91页。1.3.1细菌的接合

(1)LederbergandTatum(1946年)的实验1.3.1.1接合现象的实验证据

1958年诺贝尔奖

1940年代，不少科学家希望在细菌中寻找类似高等生物的有性生殖现象，因为遗传最重要的是有性生殖，只有透过有性生殖才能观察到基因重组的现象，但是可惜都没有成功。Lederberg有个新构想，想要用不同的突变种进行交配，希望通过遗传操作分析建立起交配系统。于是他向遗传学家Tatum提出合作研究构想。莱登伯格（1925-2008）塔特姆（1909-1975）第12页，共91页。1.3.1细菌的接合

why?营养互补？基因重组？(1)LederbergandTatum(1946年)的实验频率1×10-61.3.1.1接合现象的实验证据

1958年诺贝尔奖第13页，共91页。（2）1950年，DavisU型管实验1:两菌株细胞的直接接触对野生型的产生是必要的;2:野生型不是营养互补产生的,而是细菌发生了基因重组结论第14页，共91页。Lederberg和Tatum本以为参与接合的两个突变株接扮演同样角色，即都会变成原营养型菌株，但后来Hayes的实验推翻了这个观念。第15页，共91页。1.3.1.2遗传物质的单方向传递证据----HayesW.(1952)的杂交实验

菌株A：met-thr+leu+thi+;菌株B：met+thr-leu-thi-，链霉素处理A或B，只是阻碍它们的分裂，但并不杀死它们。

1）菌株A×菌株B→野生型菌株2）链霉素处理的菌株A×菌株B→野生型菌株3）链霉素处理的菌株B×菌株A→无野生型菌株

频率相当1:E.coli有相当于高等生物的性别;2:其遗传物质是由菌株A(♂,donor)→B(♀,receptor)单向传递的.结论第16页，共91页。接合(conjugation)：遗传物质从供体(donor)(“雄性”)转移到受体(receptor)(“雌性”)的重组过程。

第17页，共91页。1.3.1.3F因子和高频重组F因子（Ffactor）：

Hayes等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作供体的能力受细胞内一种致育因子(fertilityfactor,F因子;sexfactor,性因子)控制。携带F因子的菌株称供体菌或雄性，用F+表示，没有F因子的菌株称为雌性，用F-表示。F因子的化学本质是DNA，可以自主状态存在于细胞质中或整合到细菌的染色体上。F因子可以在细菌细胞间进行转移并传递遗传物质。F-第18页，共91页。原点（origin）：转移的起点配对区（pairingregion）：该区域与细菌染色体上的多处序列相互配对。致育基因（fertilitygene）：使细菌具有侵染性。含有F因子的菌株称为F+不含F因子的菌株称为F-F因子全长94.5kb，由共价环状闭合DNA双链构成，编码约60个基因第19页，共91页。1）接合管的形成：菌株靠近→细胞膜融合→两细胞间形成接合管2）F因子转移：F因子从原点断裂，以原点为先导，边复制边转移,复制后的F因子转移到另一个细胞中。细胞分开，使F-变成F+。在此过程程中，F因子以高频率从F+菌向F-菌转移,而染色体基因的转移则很少发生，重组频率大约只有10-6，因此，F+菌称为低频重组（lowfrequencyrecombination，Lfr）。

细菌的接合第20页，共91页。第21页，共91页。

F+菌株中一个新的菌株，它在和F-菌株杂交时，出现重组子的频率很高，比F+×F-杂交所出现的重组子的频率高1000倍，该菌株被称作高频重组菌株，简称为Hfr菌株。

Hfr×F-→重组子的频率很高，但F-细菌很少有转变为F+细菌的。

Hfr菌株第22页，共91页。通过交换F因子整合到细菌染色体上形成Hfr菌株，由于Hfr仍包含F因子，因此具有侵染能力。Hfr菌株的形成第23页，共91页。Hfr的Ｆ因子转移特点:（1）F因子整合后呈线状；（2）转移起点位于中间；先转移F因子部分,F因子的致育基因最后转移。（3）转移过程中，接合管往往会自发断裂，形成部分二倍体。第24页，共91页。外基因子（exogenote）内基因子（endogenote）部分二倍体（partialdiploid）ABab第25页，共91页。细菌基因重组的特点:(1)细菌基因重组是在部分二倍体中进行;(2)只有偶数交换才产生有活性的重组子;(3)只出现一种重组子小结第26页，共91页。1.3.1.4用中断杂交技术作连锁图

根据供体基因进入受体细胞的顺序和时间绘制连锁图的技术，叫中断杂交技术（interruptedmating）。

与遗传连锁图有本质区别连锁基因在染色体上的相对位置第27页，共91页。(1)中断杂交实验作图原理：

①

Hfr染色体上的基因是从某一点（原点：O）开始，以线性方式进入Ｆ-的；②离原点愈近的基因进入Ｆ-愈早,出现在Ｆ-中的比例愈大,反之,则愈小；

Wollman和Jacob在五十年代设计了中断杂交试验，以证明接合时遗传物质从供体细胞的转移是直线式进行的。第28页，共91页。（2）实验过程：两种菌混合培养，计时t=0每隔一定时间搅拌菌液，打断结合管以中断杂交。稀释菌液，测试其基因型，以便确定每个基因转移到F-细胞的时间。例如：1min内出现受体A基因，则说明A近原点；2min内出现AB基因，则B在A之后，；3min内出现了ABC基因，则C在AB之后……即：按时间来定位，标出不同基因位于原点的先后位置，来定位基因。第29页，共91页。(3)实例

第30页，共91页。时间图谱（基因距离单位是分钟）基因离原点越远，进入的就越迟，甚至在杂交中断之前仍不能进入受体细胞。第31页，共91页。第32页，共91页。第33页，共91页。

在Hfr菌与F+菌的互相转变过程中，偶尔会出现不规则分离的现象，使F因子携带有一段相邻的细菌染色体，这种带有插入细菌基因的环状F因子称为F′因子(F-primefactor)。带有F′因子的菌能像F+菌一样把F因子转移给F-菌，转移F因子的能力很强，同时也能转移细菌基因。

利用F`因子将供体菌的基因导入受体形成部分二倍体的过程，叫做性导（sexduction）1.3.2F′因子和性导（sexduction）第34页，共91页。第35页，共91页。性导第36页，共91页。

F`因子携带的细菌染色体长度是不同的；F`因子携带全部的F因子基因；F`因子具有侵染性。F`因子的特征：第37页，共91页。1、以大肠杆菌为例，F因子三种不同的存在状态：F因子（F+、F-）F’因子Hfr2、带有自由状态的F因子的菌株--------F+菌株不带F因子的菌株------------------F-菌株F因子整合到染色体上的------------Hfr菌株含F`因子的菌株------------------F`菌株3、四种菌株之间的相互侵染及转变关系。小结第38页，共91页。1.3.3细菌的转化与作图1.3.3.1概念：转化（trnansformation）：供体DNA片断不经过中间媒介直接被受体吸收并整合到受体染色体上的过程。细菌的转化：一个供体菌株的DNA片断被感受态受体菌株吸收并整合到受体染色体上的过程。第39页，共91页。感受态细胞:转化子：由于转化导致基因重组而形成的各种类型的细菌细胞。第40页，共91页。1.3.3.2转化与作图利用转化绘制细菌连锁遗传图谱的基本原理：相邻基因发生共同转化的概率与两者的距离间成正比关系，基因间距离越近，发生共同转化的频率越高，反之越低。因此可通过测定两基因共同转化的频率来指示基因间的相对距离。第41页，共91页。第一步：确定两个基因是否为连锁关系ABAB方法：观察外源DNA浓度降低时转化频率的变化[在一定的范围内（较低的）转化频率和转化DNA的浓度成正比]。DNA浓度下降比率A转化率下降比率B转化率下降比率A与B共转化率下降比率A与B关系1/101/101/101/10连锁1/101/101/101/100不连锁第42页，共91页。第二步计算重组值例:已知枯草杆菌的三个基因连锁供体：typ2+his2+tyr1+受体：typ2-his2-tyr1-基因转化子类型typ2his2tyr1合计+---+++++-+--++++--+-11940366068541826001071180问题：为什么没有---基因型？第43页，共91页。基因转化子类型typ2his2tyr1合计+---+++++-+--++++--+-11940366068541826001071180RF（typ2-his2）=×100%=34%RF（typ2-tyr1）=40%RF（his2-tyr1）=13%13120+67853660+418+2600+107typ2tyr1his234cM13cM问题：40≠13+34？第44页，共91页。筛选

在发生了4次交换的时候两边的两个基因我们并没把交换的结果当重组型计算，而是当亲本计算了。typ2+tyr1+typ2-his2-tyr1-his2+typ2+his2-tyr1+第45页，共91页。2噬菌体遗传分析

2.1噬菌体的生物学特性

第46页，共91页。（2）温和噬菌体----感染细菌后，一般不出现溶菌现象的噬菌体，被称为温和噬菌体。

（1）烈性噬菌体----使宿主菌发生裂解的噬菌体

二者第47页，共91页。（1）烈性噬菌体的繁殖遗传学上应用较广泛的是大肠杆菌的T噬菌体。2.2噬菌体的繁殖第48页，共91页。（2）温和性噬菌体的繁殖温和噬菌体侵入细菌后，有两种选择途径，裂解途径和溶源途径。两种途径所产生的生活周期分别称为裂解周期和溶原周期。例如：λ噬菌体裂解周期与烈性噬菌体的感染周期相似；溶原周期的λ噬菌体则附着在大肠杆菌染色体的gal和bio位点之间的attλ座位上，它能通过交换而整合到细菌染色体上，整合的噬菌体称为原噬菌体。含有原噬菌体的细菌称为溶源性细菌，对同种噬菌体不敏感，具有免疫性。第49页，共91页。２.３第50页，共91页。第51页，共91页。透明/小半透明/大透明/大半透明/小第52页，共91页。大第53页，共91页。第54页，共91页。第55页，共91页。Lederberg和Zinder等1956年在对伤寒沙门氏菌的研究中发现了转导现象。

2.4转导（Transduction）

A:phe-trp-met-his＋B:phe＋trp＋met＋his-

混合培养出现约10-5的野生型菌株，说明有遗传重组。U形管实验第56页，共91页。LT-2LT-22U形管实验第57页，共91页。LT-22是携带P22的溶源性细菌，LT-2是对P22敏感的非溶源性细菌。LT22突变型释放P22到培养液中穿过隔膜侵染LT2LT2裂解，释放P22及转导噬菌体穿膜侵染LT22，发生基因重组LT22原养型第58页，共91页。转导（Transduction）：

以噬菌体为媒介，将细菌的小片段染色体或基因从一个细菌转移到另一细菌的过程。分类:普遍性转导（Generalizedtransduction）特异性转导（Specializedtransduction）

具有转导功能的噬菌体称为转导噬菌体。第59页，共91页。2.4.1普遍性转导与作图普遍性转导：供体基因组中所有基因具有同等机会被转导形成部分二倍体，经交换和重组后形成不同的转导子，这种转导称为普遍性转导。机理：第60页，共91页。普遍性转导的过程：第61页，共91页。普遍性转导的特点：（1）频率很低；一般只有0.3%的噬菌体是转导噬菌体。（2）如果细菌的两个基因距离较大，大于噬菌体的染色体长度，一般就不能同时被转导。（3）如果细菌的两个基因被同时转导说明两个基因紧密连锁，这称为共转导或并发转导（cotransduction）。共转导频率越高说明两个基因的距离越近，连锁越紧密；反之，说明两个基因离得越远。细菌的基因作图第62页，共91页。普遍性转导的应用：第63页，共91页。第64页，共91页。2.4.2局限性转导局限性转导：

一些温和性噬菌体只能转移供体染色体上原噬菌体整合位置附近的特定基因，这种转导称为局限性转导，又称特异性转导

。λ噬菌体特异的转导gal+和bio+

基因。例：温和性噬菌体λ，它可以自主状态存在，也可以整合到大肠杆菌K12染色体上的特定位点attB，形成原噬菌体。第65页，共91页。a）溶源性细菌的产生b）原初裂解物的产生原噬菌体不正常环出离开细菌染色体时带走整合位点附近的基因gal，但是丢掉自己的部分基因，成为一个有缺陷的噬菌体，记作：λdgal+或λdbio+，但是仍具有侵染力，所有可以将bio或gal基因转导。λ噬菌体的转导机制第66页，共91页。C）λdgal+与已整合的野生型λ通过单交换进行同源重组而形成λ/λdgal+，其裂解物中，具有等量大量的λ和λdgal+，感染gal-受体菌时，转导子gal+出现的频率非常高，故称为高频转导（HFT）。双重溶源菌highfrequencytransduction双重溶源菌

第67页，共91页。细菌中常用的若干突变型基因符号第68页，共91页。1、噬菌体的条件致死突变型条件致死突变(conditionallethalmutations)

噬菌体大部分基因的功能是复制和产生子代噬菌体所必需的，这些基因的突变是致死的，不能形成噬菌斑，其中有些致死突变在限制条件下是致死的，而在许可条件下可形成噬菌斑，这种突变称为条件致死突变。

2.6噬菌体基因的精细作图第69页，共91页。表野生型与几种突变型的区别表现型不同大肠杆菌平板上噬菌斑表型BK(

)

野生型小噬菌斑小噬菌斑rI大噬菌斑小噬菌斑rII大噬菌斑无噬菌斑（致死）rIII大噬菌斑小噬菌斑Benzer实验所用的T4的rⅡ突变就是一个条件致死突变型第70页，共91页。2、Benzer的重组实验与精细作图

Benzer最初得到8个rII独立的突变型，将8种突变型两两组合感染E.coliB菌株（双重感染），从混合培养物中提取噬菌体颗粒感染E.coliK(λ)菌株。

实验结果：E.coliK(λ)上出现野生型噬菌斑。第71页，共91页。RF=×100%=×100%2×r+噬菌斑数2×K12（λ）上的噬菌斑数总噬菌斑数B上的噬菌斑数K12（λ）B第72页，共91页。根据多个两点杂交的结果，绘制rII遗传学图（P298图14-5）该方法，实际观察到的最小重组频率为0.02%，即0.02cM，约等于2bp（T4噬菌体的染色体长1.8*105bp，长度为1500cM）在基因内，相邻核苷酸位置上的突变是可能发生重组的第73页，共91页。

对于两个独立起源的、表型相似的隐性突变，如何判定是属于同一基因（功能单位）还是两个基因突变产生的呢？第74页，共91页。第75页，共91页。互补测验的原理和方法：

在同源染色体中（二倍体），可以建立双突变杂合体。双突变体杂合体有两种形式：顺式(cis)和反式(trans)第76页，共91页。在互补实验中，如果表现出互补效应，表明两个突变属于不同基因；不出现互补效应，表明两个突变属于同一基因根据两突变反式双杂合体的表现

突变型

无互补作用

为同一功能单位的突变野生型

有互补作用

为不同功能单位的突变第77页，共91页。第78页，共91页。rII区段突变的性质：rII突变具有共同性状，按经典遗传学理论，rII区段为一个基因(功能单位)互补测验结果发现：

rⅡ突变型可分成rⅡA和rⅡB两个互补群。所有rⅡA突变型的突变位点都在rⅡ区的一头，是一个独立的功能单位,所有rⅡB突变型的突变位点都在rⅡ区的另一头，也是一个独立的功能单位.|A|B|第79页，共91页。凡是属于rⅡA的突变之间不能互补,凡是属于rⅡB的突变之间也不能互补,只有rⅡA和rⅡB的突变之间可以互补,即双重感染大肠杆菌K(λ)株后可产生子代。说明:rⅡA和rⅡB是两个独立的功能单位,分别具有不同的功能,但它们的功能又是互补的。他们属于两个顺反子。第80页，共91页。rII区段作为经典遗传学意义上的一个基因实际上有两个顺反子(功能单位)；经典遗传学中的基因不是遗传的最小功能单位；Benzer提出“一个顺反子一条多肽链”。顺反子（cistron）：不同突变之间没有互补的功能区，包含多个基因位点，是遗传上的一个功能单位，但不是一个突变单位或重组单位。第81页，共91页。在原核和低等真核细胞中，通常一个基因对应一相应产物，因此基因和顺反子是等价的在高等真核生物中，基因和产物之间的关系较为复杂，基因和顺反子不等价，仅相当于真核基因的外显子第82页，共91页。互补测验可以确定突变型是否属于同一顺反子：第83页，共91页。章节总结接合与中断杂交作图转化与作图性导转导与作图精细作图理解是做谁的图（细菌染色体？噬菌体？）？重组的出现是利用什么因子作为媒介的？第84页，共91页。

七个突变株之间的互补测验结果如表，“+”代表互补，“-”代表不能互补，这七个突变型分别属于多少个顺反子？（中山大学，2003）菌株abcdefga-++-++-b+-++-++c++-++-+d-++-++-e+-++-++f++-++-+g-++-++-互补指两个突变型混合感染后，能产生野生型性状两个突变型间能互补，说明二者的突变位点不在同一顺分子中不能互补，说明二者突变位点在一个顺反子中第85页，共91页。

细菌中断杂交实验，Hfr基因型为MNOP，F-为mnop。试验Ⅰ之结果，基因传递次序为M，P，N，O；试验Ⅱ为M，O，N，P；试验Ⅲ为P，M，O，N。据以上结果，绘出细菌染色体示意图。标明上述基因。另外绘制3个细菌染色体图，分别标明上述三个试验的F因子的插入位置和方向。（中国农业大学1995