CN113950534B L型环状氨基酸的制造方法 （株式会社Api）

2021.10.25PCT/JP2020/0195172020.05.15WO2020/218624JA2020.10.29010107433.2.Genbank.ArabidopsisthalianaNbindingRossmann-fold.2019,NM_124659.2.本发明的课题在于提供由在1位具有双键的具有双键的环状氨基酸还原而生成L型环状氨基酸的催化性能的特定酶作用于在1位具有双键的环状氨基酸从而制造L型环状氨基酸，由此解决2述多肽的能力或包含所述多肽的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理物和/或对所述微生物或细胞进行培养而得到的包含所述多肽的培养液与下述式所示的在1位具有双键的然后利用权利要求1所述的方法使所得到的在1位具有双键的环状氨基酸生成下述式3含所述多肽的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理物和/或对所述微生物或细胞进行4环丁烷-2-甲酸(Azetidine-2-carboxylicacid)等4元环氨基[0005]另外，还已知作为杂环的L-硫代脯氨酸(L-Thioproline)、L-吗啉甲酸(L-3-Morpholinecarboxylicacid)、L-硫代吗啉甲酸(L-3-Thiomorpholinecarboxylic[0008]作为通过有机合成方式制造L型环状氨基酸的方法，已知Garcia等人提出的哌可酶(EC1.5.1.2)的由L-赖氨酸(L-lysine)起始的L-哌可酸(L-pipecolicaci[0010]Fujii等人(非专利文献2)报道的方法为对L-赖氨酸使用L-赖氨酸6-氨基转移酶方法为对L-鸟氨酸(L-ornithine)使用鸟氨酸环化酶(OrnithineCyclase)而得到L-脯氨[0012]Denis等人(专利文献1)报道了使用鸟氨酸环化酶得到L-哌可酸(L-pipecolic5acid)、L-硫代吗啉-2-甲酸(L-Thiomorpholine-2-carboxylicacid)、5-羟基-L-哌可酸[0014]另一方面，经由在1位具有双键的环状氨基酸作为中间体的方法能够使用外消旋将Δ1-吡咯啉-2-甲酸(Δ1-pyrroline-2-carboxylicacid)还原而生成脯氨酸、以及将Δ1-哌啶-2-甲酸(Δ1-piperidine-2-carboxylicacid)还原而生成哌可酸(非专利文献具有双键的环状氨基酸，将其用来自假单胞菌属细菌的N-甲基-L-氨基酸脱氢酶还原而制[0025]非专利文献1：ConcepcionFGarciaetal.,TetrahedronAsymmetry(1995)[0026]非专利文献2：TadashiFujiietal.,BioscienceBiotechnologyBiochem[0027]非专利文献3：RalphNCostilowetal.,JournalofBiologicalChemistry[0028]非专利文献4：AltonMeisteretal.,JournalofBiologicalChemistry[0029]非专利文献5：CecilWPaytonetal.,JournalofBacteriology(1982)6氨基酸得到作为中间体的在1位具有双键的环状氨基酸、将其利用生物化学方法还原而更[0033]认为通过使用具有将在1位具有双键的环状氨基酸还原而生成L型环状氨基酸的豆或桑的亚氨基酸还原酶以高于公知的酶的催化效率将在1位具有双键的环状氨基酸还[0035]另外，在1位具有双键的环状氨基酸可以使用公知的酶由廉价的二氨基酸高效率廉价的二氨基酸制造作为药物中间原料有用的高纯度的L型理物和/或对上述微生物或细胞进行培养而得到的包含上述多肽的培养液与下述通式(I)7转换为酮基而生成α酮酸的酶与下述通式(III)所示的链状的α,ω-二氨基酸反应，生成下在1位具有双键的环状氨基酸生成下述通式(II)所示的L型所示的在1位具有双键的环状氨基酸为Δ1-哌啶-2-甲酸，上述通式(II)所示的L型环状氨8多肽的能力或包含上述多肽的微生物或细胞、上述微生物或细胞的处理物和/或对上述微[0077]具有由下述通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸生成下述通式(II)所示9率且工业化地由廉价的二氨基酸制造作为药物中间原料有用的高纯度的L[0089]图1为示出实施例2的(2)酶反应产物的解析中的、生成的哌可酸的HPLC分析结果[0091]图3为示出实施例2的(3)酶催化活性的解析中的、基于ANEMONA的米海利斯-曼恬模型(Michaelis-Mentenmode的情况下形成L-脯氨酸(Proline)等5元环氨基酸，碳原子数为3的情况下形成L-哌可酸(pipecolicacid)等6元环氨基酸，碳原子数为4的情况下形成氮杂环庚烷-2-甲酸OCH--OCH--OCH基、硝基、羟基等，优选羟基。作为包含取代基的L型环状氨基酸，可列举例如羟脯氨酸细胞的处理物和/或对上述微生物或细胞进行培养而得到的包含上述多肽的培养液与上述通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸接触而生成上述通式(II)所示的L型环状氨基[0107]是否具有“由通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸生成通式(II)所示的L[0109]本发明中，特别优选催化下述式(2)所示的反应(还原Δ1-哌啶-2-甲酸(Δ1-piperidine-2-carboxylicacid)而生成L通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸而生成通式(II)所示的L型环状芥(Arabidopsiskamchaticasubsp.kamchatica)、叶芽拟南芥(Arabidopsishallerisubsp.gemmiferavar.senanensis)等拟南芥属(genusArabidopsis)的植物、桑、家桑添加1个～两个以上氨基酸而成的氨基酸序列、且催化上述式(1)所示的反应的具有L型环[0128]本说明书中的氨基酸序列的同源性(也称为一致性或类似性)可以使用同源性计算算法NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocal等,Proc.Natl.Acad.Sci.USXBLAST程序(version2.0)(Altschul等,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402(1997))]；Needleman等,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970)中记Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448(1988)中记载的算法[该算法整合于GCG软件包中使用由来自拟南芥、桑(鸡桑)或海滨山黧豆的细胞或组织制备的总RNA或mRNA级分作为模K(TAKARABIOINC.)等通过ODA-LAP噬菌斑杂交法或PCR法等从将上述总RNA或mRNA的片段插入适当的载体中而制备的cDNA文酶可以为与亲和性多肽的融合蛋白。作为这样的融合蛋白，可列举与谷胱甘肽-S-转移酶作为转化对象的宿主优化了密码子的DNA当然包括在本发明中可使用的编码具有催化上述碱基序列的互补链在严格条件下进行杂交的碱基序列、且编码催化上述式(1)所示的反应[0140]本说明书中的碱基序列的同源性(也称为一致性)可以使用同源性计算算法NCBIBLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformationBasicLocalAlignment[0142]本领域技术人员可通过使用定点诱变法(NucleicAcidsRes.10,pp.6487[0143]本发明的核酸能够编码具有催化上述式(1)所示的反应的活性的多肽。本发明的数据库进行同源检索，获得具有催化式(1)所示的反应的活性的多肽的氨基酸序列信息或[0145]后述的本发明的制造方法中，可以将亚氨基酸还原酶直接用于上述式(1)所示的表达调控序列以强化目标DNA的表达的方[0148]这些之中，优选使用利用编码上述本发明的多肽的DNA进行了转化的微生物或细[0149]如上所述，编码本发明的多肽(亚氨基酸还原酶)的核酸(DNA)例如可以通过使用使用来自拟南芥、桑(鸡桑)或海滨山黧豆的总RNA或mRNA作为模板且利用RT-PCR法直接扩[0151]例如，通过将如上所述地得到的编码本发明的多肽的DNA以能表达的配置插入到利用同源重组等方法以能够表达的方式将编码本发明的多肽的DNA整合到宿主的染色体体导入到该宿主微生物或宿主细胞中的方法、直接向宿主基因组中导入该DNA并转录和翻[0156]属于埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙门氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒杆菌[0157]属于红球菌(Rhodococcus)属、链霉菌(Streptomyces)属等的已经建立了宿主载[0158]属于酵母(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母[0159]属于链孢霉(Neurospora)属、曲霉(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)据分子生物学、生物工程学、基因工程学的领域中惯用的技术来进行(例如Molecular葱假单胞菌(Pseudomonascepacia)等建立的常规宿主载体系统；和以参与甲苯化合物的分解的质粒、TOL质粒为基础的广宿主载体(包含来自RSF1010等的自主复制所需的基因)pKT240(Gene,26,273-8[0173]作为对具有生产本发明的亚氨基酸还原酶的能力的微生物或细胞进行培养而得[0174]本发明的亚氨基酸还原酶可以特别优选用于还原Δ1-哌啶-2-甲酸而制造L-哌可深部通气搅拌培养等需氧条件下进行，培养温度通常为15～40℃,培养时间通常为16小时[0176]从转化体的培养物中单离纯化上述亚氨基酸还原酶时，使用通常的蛋白质的单用离心分离回收细胞并悬浮于水系缓冲液后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、MANTON酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)琼脂糖、溶化液在不含蛋白质变性剂或蛋白质变性剂的浓度稀薄到N-甲基-L-氨基酸脱氢酶不会发生变性的程度的溶液中进行稀释或者透析，使该亚氨基酸还原酶构成为正常的立体结构微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含上述酶[0188]在使本发明的亚氨基酸还原酶与通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸接原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码本发明的多肽的DNA的转化体等)、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶的培养液与通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸接触，从而能够还原该环状氨基酸而制造通式(II)所示的L型环的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微生物或细胞而得到的包含该酶[0190]关于添加到反应液中的微生物或细胞、该微生物或细胞的处理物和/或培养该微[0192]成为反应底物的通式(I)所示的在1位具有双键的环状氨基酸通常以反应液中的<2＞向反应体系中添加具有由NAD(P)+生成NAD(P)H的能力的微生物或其处理物、或葡萄用于NAD(P)H的再生的酶(再生酶)的方法3＞制造转化体时将能够用于NAD(P)H的再生酶及其再生系统的水性介质中或水性介质与有机溶剂的混合[0205]对于通过上述反应(还原反应)生成的通式(II)所示的L型环状氨基酸，可以在反ω-二氨基酸的α位的氨基被氧化而成的α酮酸和在1位具有双键的环状氨基酸、或者α只要为能够使α,ω-二氨基酸的α位的氨基转换为酮基而生成α酮酸定，可列举例如D-氨基酸氧化酶(D-aminoacidoxidase)、L-氨基酸氧化酶(L-aminoacid酶(L-aminoaciddehydrogenase)等氨基酸脱氢酶、D-氨基酸转移酶(D-aminoacidaminotransferase)、L-氨基酸转移酶(L-aminoacidaminotransferase)等氨基酸转移酶[0212]这些中，优选底物特异性宽的酶。具体而言，优选EnzymeandMicrobial[0214]另外，在由二氨基酸制造在1位具有双键的环状氨基酸时使用各种氨基酸氧化酶[0215]另外，使用氨基酸氧化酶的情况下，通过使用作为辅酶的黄素腺嘌呤二核苷酸[0216]在将反应底物设为二氨基酸的情况下，[0217]由二氨基酸通过生物化学方式制造在1位具有双键的环状氨基酸的方法没有特别使用。[0227]需要说明的是，在以下的实施例及参考例中，M表示mol/L，DMSO表示二甲基亚砜，ETDA表示乙二胺四乙酸，IPTG表示异丙基-阝-硫代吡喃半乳糖苷，长了约1个月的家桑的叶提取总RNA。提取中，使用RNeasy植物小量试剂盒(PlantMini用ReverTraAce(注册商标)含gDNA去除剂的qPCRRT反应混合物(qPCRRTMasterMix[0231]以得到的cDNA为模板进行PCR反应。PCR用的引物按照下述表所记载的那样来制[0235]PCR基于TaKaRaExTaq(注册商标)热启动版本(HotStartVersion)(TaKaRa公伸反应。将反应产物供于使用利用GelRed(商标)核酸凝胶染色液(×10000)DMSO溶液染色andPCRClean-UPSystem(Promega公司制)提取cDNA。操作按照该系统所附带的规程进连接试剂盒MightyMix(TaKaRa公司制)5μL混合，在反应温度16℃下进行30分钟的连接反册商标)Terminatorv3.1/1循环测序试剂盒(CycleSequencingKit)(AppliedBiosystems公司制)进行测序反应。将得到的试样供于ABIPRISM(商标)基因分析仪[0238]对插入的基因序列进行确认的结果是，确认了AtP2CR的基因序列为序列号1所示将纯化后的克隆的DNA片段与上述(1)同样地连接及转化到同样地进行了限制酶处理的作处理并确认插入序列。将构建的表达载体分别命名为pGEX-AtP2CR、pGEX-MaP2CR、pGEX-[0244]将上述(3)中得到的各可溶性蛋白质级分用GST-Tagged蛋白质纯化试剂盒[0245]将进行GST-tag纯化而得到的酶液(可溶性蛋白质)供于SDS，确认了目标蛋用1.5mL艾本德管(Eppendorftube)，以酶反应溶液的体积为100μL来进行。作为底物的反应产物)的衍生化处理。使用AccQ·TagUltra衍生化试剂盒(DerivatizationKit)[0265]为了确定生成的PipA为D型还是L型，使用手性柱AstecCLC-D4.6×150mm(5μm)[0267]以与实施例2(1)相同的组成制作了PipC2酶反应溶液。*NADPH以在加入酶溶液后[0268]向这些反应溶液中分别加入实施例1中得到的AtP2CR的纯化重组酶液100μL而开[0269]由得到的测定值计算反应速率。使用计算出的反应速率由哈尼斯-伍尔夫图[0272]使用*NADPH的摩尔吸光系数6.3×10(1/mmol·[0275]通过哈尼斯-伍尔夫图和ANEMONA这两种方法求出的Vmax及Km的值取得了类似的[0281]文献(Muramatsu等，(2005)，vol.280，7，5329THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY)中记载了，被用作PipA生产的产业用酶催化剂的来自微生物恶臭假单胞菌[0285]使用RNeasy植物小量试剂盒(QIAGEN公司制)，从自发芽起生长了约1个月的家桑的叶中进行RNA提取。从得到的总RNA中，使用ReverTraAce(注册商标)含gDNA去除剂的qPCRRT反应混合物(TOYOBO公(GTCGACTCATTTGTAAAGAGATTTTAGTC)(序列号21)来进标)热启动版本(TaKaRa公司制)的规[0287]将经纯化的DNA克隆到T-VectorpMD19(TaKaRaBio公司制)中。序列分析的结果[0289]使用上述(a)中制作的表达载体pCold-MaALD1转化大肠杆菌(BL21株)。约18小时[0291]将上述(b)中得到的培养液转移到50mL容量的Falcon(注册商标)管中，在2330×[0293]向回收的菌体中加入超声处理缓冲液(Sonicationbuffer){50mMTris-HCl(pH[0294]将得到的可溶性蛋白质级分使用His-Tagged纯化小量制备试剂盒(Purification[0002]<110>株式会社API[0003]<120>L型环状氨基酸的制造方法[0004]<130>AP360-200759[0005]<150>JP2019-084234[0006]<151>2019-04-25[0008]<170>PatentInversion3.5[0014]atggctgcattaccagtattcataccagcagagtcatttccatcgatcctctcacatgaa60[0015]accttgatcaatcactttcggaccaatcttccgaaacattcatcaacaatcacaagccct120[0016]gtccggcaaaactacaccgtttcatcaccttcctctctcctcctcatgccttcttggtca180[0017]tcttcttcttctctcccttacatgggcgtcaagctcgtgacctatttccctcataactct240[0018]tctcagaacttacctggcatccatggatcctacacactctttagctccactacaggccaa300[0019]accttagctacaatggatggtactgttttaaccctttaccgtacttcctctgtttcaggc360[0020]ttaggatccaaaatcctagctagagacgatagtcaagtgctgatcatggttggttccggt420[0021]gctctcgcaccacacctgatcaaatcccatctagctgcgagaccaagcttgagaagagtg480[0022]atcatatggaacagaactccacaaagggctcaggagttagctgaaaccctctccaaggat540[0023]cctcaacacaaggagatttcattcgatagccacgattcgctagatcaaatcattcctcta600[0024]ggagatattataagctgtgcaacaaactcaactgttccattggtcaaaggtgagttcttg660[0025]aaacccggaacccatcttgaccttgctggatcgtttagccatgaaatgaaggaatgtgac720[0026]gacaatgcgatacagagagggagtgtgtttgtcgataatgacactgcgatgatagaagca780[0027]ggagagctcgcgggagcgtttgagagaggagtgattaagagagaagacatttgtgggaat840[0028]ttggtggagttgatcaaaggtgacaaagaagggagaaagagttcaacagacataacagtg900[0029]tttaagtccgtcggttcgggtaccgtagatctcttaaccgcacaacttgttcacgagact960[0030]tacctcagccgttgttaa978[0036]MetAlaAlaLeuProValPheIleProAlaGluSerPheProSerIle[0038]LeuSerHisGluThrLeuIleAsnHisPheArgThrAsnLeuProLys[0040]HisSerSerThrIleThrSerProValArgGlnAsnTyrThrValSer[0042]SerProSerSerLeuLeuLeuMetProSerTrpSerSerSerSerSerLeuProTyrMetGlyValLysLeuValThrTyrPheProHisAsnSerSerGlnAsnLeuProGlyHisGlySerTyrThrLeuPheSerSerThrThrGlyGlnThrLeuAlaThrMetAspGlyThrValLeuThrLeuTyrArgThrSerSerValSerGlyLeuGlySerLysLeuAlaArgAspAspSerGlnValLeuMetValGlySerGlyAlaLeuAlaProHisLeuIleLysSerHisLeuAlaAlaArgProSerLeuArgArgValIleIleTrpAsnArgThrProGlnArgAlaGlnGluLeuAlaGluThrLeuSerLysAspProGlnHisLysGluSerPheAspSerHisAspSerLeuAspGlnIleIleProLeuGlyAspSerCysAlaThr200205AsnSerThrValProLeuValLysGlyGluPheLeuLysProGlyThr210215220HisLeuAspLeuAlaGlySerPheSerHisGluMetLysGluCysAsp225230235240AspAsnAlaIleGlnArgGlySerValPheValAspAsnAspThrAla245250255MetIleGluAlaGlyGluLeuAlaGlyAlaPheGluArgGlyVal260265270LysArgGluAspIleCysGlyAsnLeuValGluLeuLysGlyAsp275280285LysGluGlyArgLysSerSerThrAspThrValPheLysSerVal290295GlySerGlyThrValAspLeuLeuThrAlaGlnLeuValHisGluThrTyrLeuSerArgCys<210>3<211>999<212>DNA<400>3[0083]atggcttccacaaccaccgccataacatccccaatcttcatcaccactcaatcctttcac60[0084]accatcctctctcgccaaactcttatggaccacttccattcgtctctccccacagtctct120[0085]gcttctctctctaccccactccgccaaaaccacgccgtttcacccacctcctctctcctc180[0086]ctcatgccctcttggtccacctctccttctctcccttacattggcgtcaagctagtcact240[0087]tacttccctcaaagctccaccttaagtttacccggcattcacgccagttacgtcctcttc300[0088]agctccgcaactgggcagaccttggcttccatggacggaactgcactgacccttttcaga360[0089]acttcatgtgtttctggcttggcttcccggattttggccagagacgacagcaaagtcctc420[0090]gtcatgatcggtgcgggcgccttggcgccgcatttgatcaaggcccatctcaccgcgaga480[0091]cccggtttggagagagttgtcatctggaaccgcacggtggagaaagctagaaacttggct540[0092]gagcaactgcaacaaagttcggggcttgacggggtttgtttcgagagtaatgggtgcttg600[0093]gaggaagttgttgggatgggagatattgtgagctgcgcaacgaactcggaggcgcctctt660[0094]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