【环介导恒温扩增技术(LAMP)研究的文献综述4100字】

–PAGE28–环介导恒温扩增技术(LAMP)研究的文献综述1.1环介导等温扩增技术(LAMP)的反应体系环介导等温扩增技术(Loop-

mediated

Isothermal

Amplification,LAMP)，是针对目标基因的6个区域设计出4条特异性引物，在恒温条件下(65℃左右)加入链置换DNA聚合酶，可在40-60min之内完成核酸扩增反应，将目标DNA片段扩增109～1010倍，具有恒温快速扩增和高特异性的特点REF_Ref20152\n\h[48]。(1)引物：引物设计是整个LAMP反应的关键点，设计出好的引物可以更高效的完成扩增反应。引物可以分为正向内部引物、正向外部引物、反向内部引物和反向外部引物4条特异性引物。在反应的起始阶段4条特异性引物与目标DNA片段的某些区域进行碱基互补配对，是反应的关键，因此不同大小不同碱基序列的引物是否可以进行互补融合，其中选择合适的温度范围也是反应高效的关键一步REF_Ref20302\n\h[49-50]。由内引物(F2和B2)所指导的融合反应所需温度较高（63℃左右），而外引物(F3和B3)引导所指导的融合反应温度要求相对不高，因此温度控制在60-63℃左右时，可以保证内引物(F2和B2)所指导的融合反应发生的更早REF_Ref20416\n\h[51]。(2)模板DNA：因为对于LAMP技术来说，其中有一步限速反应，链置换DNA聚合酶所引导的合成反应是一步限速反应，而其中决定反应速率的关键是模板DNA的大小，一般最合适的量应该是130～200bp

DNAs。(3)链置换DNA聚合酶：链置换DNA聚合酶是LAMP限速反应中的限速酶。链置换DNA聚合酶与模板DNA的大小多少有着密切的关系，当模板DNA大小为130～200bp

DNAs时，链置换DNA聚合酶对于基因扩增反应是最好的。(4)缓冲液：缓冲液的成分具有破坏DNA双螺旋氢键共价键结构的作用，从而有效的提高了反应的扩增速率。1.2环介导等温扩增技术(LAMP)的反应步骤第1阶段为起始阶段，四条特异性引物中的任意一条引物与双链DNA的互补部位进行碱基配对并且向前延伸时，另外一条DNA双链就会解离，从而变成单链。由于内引物引导的合成反应先于外引物引导的合成反应发生，也就是上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，并且在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸同时启动链置换合成反应。之后外部引物F3与模板F3c发生碱基互补配对结合并向前延伸，置换出一条完整的由FIP连接的互补单链。FIP上的F1c便与此单链上的FI为互补结构。从而发生自我碱基配对结合并形成一个环状结构。同时以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，也在下游形成一个环状结构，一条链的两端各一个环状结构，也就是形似哑铃状结构的单链。并且迅速以3＇未端的区段为起始点，以自身DNA链为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。如图1-2所示。图1-2LAMP技术原理图1Fig.1-2SchemeofLAMPreaction1第2阶段为扩增循环阶段。以上述形成茎环状结构作为起始模板，FIP与茎环状结构中的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也可以形成一个环状结构。并且迅速以3＇未端的B1区段为起始点以自身DNA链为模板。进行DNA合成延伸及链置换反应，从而形成了2条新的长短不一的茎环状结构的DNA链，BIP引物上的B2区域与这个茎环结构进行杂交。启动新一轮的基因扩增反应，使得产物DNA链长度增加了一倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB，它们也分别可以与茎环状结构结合并且启动链置换合成，周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。如图1-3所示。图1-3LAMP技术原理图2Fig.1-3SchemeofLAMPreaction21.3环介导等温扩增技术(LAMP)结果的测定方法(1)肉眼观察法：LAMP反应扩增时，有大量白色沉淀物产生，是因为反应溶液中有大量的镁离子以及有大量的从dNTPs中析出的焦磷酸根离子，两者结合会产生大量的白色不溶于水的物质，我们可以通过反向观察，通过白色物质的产生从而推断出LAMP的反应状况，也可以通过仪器观察液体浑浊度的变化情况来判断反应发生状况，从而实现定量检测。REF_Ref20739\n\h[55]。在本研究中通过浊度仪测定浊度变化曲线情况从而完成实时定量测定。(2)荧光显色法：原理就是将荧光颜料添加到整个反应体系中，比如常见的一些染料溴化乙锭、SYRBGreen等，从而使反应结果显色，通过观察荧光物质的累积程度从而判断反应的变化情况，现在实验中较常用到是荧光仪通过荧光变化曲线，从而完成实时定量测定。REF_Ref20841\n\h[56]。本研究中选择的是SYBR-GreenⅠ荧光染料，此染料可以与中的小沟发生嵌合反应，染料本身呈现绿色发出微弱的荧光几乎不能把=被检验到，而一旦与DNA双链进行结合就会使荧光信号几倍放大，同时随着扩增产物的不断增加，荧光染料的颜色也越来越明显。通过荧光仪器检测荧光曲线变化从而进一步进一步实现定量测定。(3)凝胶电泳法：LAMP扩增反应最后产生一个像花椰菜一样的茎环DNA混合物，其原理是在退火过程中在同一条链上目标序列的反向重复反复交替从而形成的一个多重环状形似花椰菜的一个结构REF_Ref20955\n\h[57]。所以，在用2％的琼脂糖凝胶进行电泳的时候，LAMP核酸扩增反应最终产物由于结构原因在结果上呈现的是典型的阶梯状条带，而非常见的一条单链条带。我们可以通过观察梯形条带，从而更准确的了解LAMP反应发生的情况。如果用限制性核酸内切酶剪切LAMP最终产物后，再利用琼脂糖凝胶进行电泳可出现一条单一目标序列条带。(4)特异性可视化检测：目前检测结果只有2种:扩增或者不扩增。所以当反应过程中发生了非特异性扩增时，我们是无法鉴别的。因此，对怎么判断反应产物的特异性扩增又是一大难点。2006年MoriREF_Ref21324\n\h[58]等人应用基因探针和阳离子聚合物对LAMP是否发生了特异性扩增进行了可视化检测。而这些和探针特异性结合的反应产物与这些阳离子聚合物结合后形成了P聚合物，这个P聚合物不溶于水而且可以释放出其特异性探针所对应的荧光，利用荧光监测装置就可以肉眼的情况下进行荧光观察，来判断扩增反应的特异性。1.4环介导等温扩增技术（LAMP）的优点(1)可以直接扩增RNA:可以通过添加逆转录酶，实现将DNA扩增到RNA的结果，就是在扩增脱氧核糖核酸体系中添加一些逆转录酶，同时需要加入适当的抑制剂比如抑制RNA酶的抑制剂，DNA逆转录为RNA，实现RNA的基因扩增。(2)操作便捷:恒温下LAMP反应即可完成基因扩增，同时反应中不需要开盖等操作，也不需要加入什么特殊的试剂就可以完成，只需要一个水浴锅就可以完成反应。(3)快速高效：整个扩増反应只需要在1小时以内就可以扩增到原来的109~1010倍，耗时短。(4)特异性强：理论上设计出特异性引物就可以保证LAMP扩增反应的高特异性，我们也可以根据特异性引物引导的扩增反应是否发生从而判断所要检测的目标基因是否存在，也就是说可以设定某细菌或者病毒的特异性引物，观察扩增与否来对于该细菌或病毒进行定性检测。(5)灵敏度高:因为反复大量的扩增反应，可以在短时间内将微量的目标基因扩增到大量，足以通过仪器检测出来的程度，因此将该技术应用于检测微量目的病原菌上，可以达到在极少目标菌含量的检测目的。(6)检测简便，污染小:检测结果可以直接通过仪器检测荧光信号或者浊度曲线的变化来确定有没有发生特异性扩增反应，进行实时测定。同时整个试验过程中均不需要开盖，采用闭管式扩增，从而避免了开盖造成的气溶胶污染现象。1.5环介导等温扩增技术（LAMP）的应用由于LAMP技术具有灵敏度高、特异性强、快速高效、操作简单等特点，此方法在多个领域均有广泛应用前景，比如食品卫生检验、临床疾病的诊断、农业、医药卫生监测等，在这里我们主要探讨一下LAMP技术在食品检测方面的一些应用：2003年MaruyamaREF_Ref21582\n\h[59]等使用原位杂交技术同将LAMP技术的结合应用，设计stx2基因的特异性引物，检测出Ecoli57:H7，LAMP技术的相对PCR技术较低反应温度，可以有效的减少温度对细胞的破坏，同时在扩增反应中，使用荧光抗体进行标记，使检测结果更加准确。除此之外，LAMP技术还可应用于食品中金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌回等许多细菌的检测，结果均显示出了LAMP法的高特异性和高灵敏度。LAMP方法不但具有较高的特异性和灵敏度优势外，还有具有操作便捷，设备需求简易等优势，同时该方法观测试验结果的方法也十分便捷，可通过观察反应产物浊度变化或者荧光变化，以及通过仪器直观观测反应变化的荧光曲线或浊度曲线就可以判断反应发生的情况，特别是适合口岸等基层的现场快速检测要求，这正是今后研究工作发展的方向和要考虑的关键点，可以为提高口岸食品快速检测工作效率提供有力技术支撑。参考文献TongS,DavisJS,EichenbergerE,etal.StaphylococcusaureusInfections:Epidemiology,Pathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2015,28(3):603-661.东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,246-247.方太松,王军,王晔茹,吴瑜凡,刘阳泰,王翔,董庆利.我国熟肉制品中金黄色葡萄球菌污染状况Meta分析[J].生物加工过程,2020,1803:386-391.陈琼,董华夏,戴小芳,刘萍,晏涛,郦娟.畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究[J].食品工业科技,2020,4120:235-240+245.QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheeponthephagocytosisofStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandSaureusbyneutrophils-ScienceDirect[J].ResearchinVeterinaryScience,1996,61(3):231-233.李琼琼,范一灵,宋明辉,施春雷,杨美成.食源性金黄色葡萄球菌肠毒素及其检测方法[J].食品安全质量检测学报,2016,702:555-560.胡金强,雷俊婷,白艳红,魏向珂,景建洲,高辉,孙新城,董彩文,耿尧,姜春鹏.食品中金黄色葡萄球菌PCR-ELISA检测技术建立[J].食品工业科技,2016,3720:63-67.

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