武汉大学天然产物的提取葛根

武汉大学天然产物的提取葛根第一页，共26页。葛根简介

葛根始载于《神农本草经》,被列为中品。为豆科野葛或甘葛藤的干燥根。目前,在我国为药食两用的植物。它具有解肌退热、生津止渴、透发麻疹升阳止泻的功能。葛根中主要含有葛根素(puerarin)大豆苷(daidzin)和大豆苷元(daidzein)等异黄酮类有效成分。该成分都具有增加脑血流、改善微循环等功效。第二页，共26页。葛根及其提取物:第三页，共26页。葛根的主要成分葛根的主要有效成分是大豆苷元，大豆苷，葛根素和大豆苷元4,7－二葡萄糖甙等异黄酮类化合物。除这4种主要的黄酮物质之外,日本学者柴田承二等还从葛属植物P.ThunbergianaBenth等品种分离得到葛根素7－木糖甙;Bhutain等从葛属植物P.Tuberosa中分离得到另一种新的异黄酮类物质4,6－二乙酰基葛根素；野原稔弘等还首次从葛根中分离鉴定出金雀黄素8－芹糖基－葡萄苷和大豆黄素8－糖基－葡萄苷两种异黄酮物质。除上述主要有效成分异黄酮类化合物外,葛根中还含有少量的葛根苷(A，B，C)，三萜类物质(葛皂醇A，B，C)和生物碱类物质葛根的主要有效成分中以葛根素含量为最高第四页，共26页。葛根的药理作用改善心脑血管系统降血糖降血脂抗氧化抗肿瘤抑制血小板聚集增强免疫功能改善学习记忆第五页，共26页。改善心脑血管系统降低血压，减慢心率，降低心肌耗氧量：葛根对正常和高血压动物均有一定的降压作用，葛根黄酮和葛根素使正常和心肌缺血狗心率明显减慢。扩张冠状血管，改善正常和缺血心肌的代谢：葛根总黄酮和葛根素明显扩张冠状血管，可使正常和痉挛的冠状血管扩张，且其作用随着剂量的增加而加强第六页，共26页。降血糖降血脂口服葛根素能使四氧嘧啶性高血糖小鼠血糖明显下降,血清胆固醇含量减少,当选用最低有效剂量的葛根素与小剂量(无效量)阿司匹林组成复方后,降血糖作用加强,且可维持24h以上,并能明显改善四氧嘧啶性小鼠的糖耐量,明显对抗肾上腺素的升血糖作用,且认为葛根素可能是葛根治疗糖尿病的主要成分，口服葛根煎液能对抗饮酒大鼠因乙醇所致的血中APOA－1降低及胆固醇，甘油三酯的升高现象。第七页，共26页。抗氧化体内外实验表明,葛根异黄酮明显抑制小鼠肝，肾组织及大白兔血，脑组织的脂质过氧化产物丙二醛的升高,且对提高血，脑组织中超氧化物歧化酶活性有极显著作用。本品能通过清除氧自由基和抗脂质过氧化而使酒精所致的血液粘度异常变化恢复正常状态。第八页，共26页。抗肿瘤大豆苷元可抑制白血细胞HL－60的增殖,大豆苷元在10~20mg/ml浓度范围内明显抑制黑色素瘤B16细胞的增殖。另外,葛根提取物对ESC癌S18O肉瘤及Lewis的肺癌均有一定的抑制作用。第九页，共26页。抑制血小板聚集第十页，共26页。增强免疫功能葛根使巨噬细胞(M4)的异物吞噬功能活化,而使初期感染状态下的异物排除功能增强;同时通过活化的M4对细胞性免疫施以影响。第十一页，共26页。改善学习记忆据刘干中等用小鼠跳台法和大鼠操作式条件反射法观察了葛根醇提取物及总黄酮对动物学习记忆功能的影响结果,两者均能对抗东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍和40%乙醇所致的记忆再障碍,葛根醇提取物尚能对抗东莨菪碱所致的大鼠操作式条件反射的抑制研究发现,东莨菪碱能降低小鼠大脑皮层和海马乙酰胆碱含量,并降低海马乙酰胆碱转移酶活性，这可能是葛根能改善学习记忆作用的机制。第十二页，共26页。葛根素提取方法渗漉法冷浸法回流法提取法酶提取法超声提取微波提取第十三页，共26页。渗漉法:取100g葛根粉碎药材，装渗漉筒，加95%乙醇300mL浸泡12h，再加乙醇至600mL进行渗漉，将所得渗漉液抽滤，滤液回收乙醇并浓缩至稠膏状，然后真空干燥得干浸膏，称重。第十四页，共26页。冷浸法:取100g葛根粉碎药材置500mL圆底烧瓶中，加95%乙醇200mL浸泡12h，抽滤，滤液保留，药渣加200mL95%乙醇浸泡12h，抽滤，滤液保留，药渣再加200mL95%乙醇浸泡1h，抽滤，滤液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，后真空干燥得干浸膏，称重。第十五页，共26页。回流法：取100g葛根粉碎药材置500mL圆底烧瓶中，加300mL95%乙醇回流1h，抽滤，滤液保留，药渣加300mL95%乙醇回流1h，抽滤，滤液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏状，后真空干燥得干浸膏，称重。第十六页，共26页。葛根总黄酮分离方法：1大孔树脂法2铅盐沉淀法第十七页，共26页。大孔树脂法：崔九成等用大孔树脂分离葛根素，将浓缩至1ml相当于0.5g葛根药材的提取物100ml，加入到50g处理过的大孔树脂柱上，用蒸馏水洗至流出液色变淡，再用70%乙醇洗脱至无葛根素，洗脱液回收乙醇浓缩并蒸干即得葛根总黄酮，收率为药材总黄酮的84.58%第十八页，共26页。铅盐沉淀法

李稳宏等用铅盐沉淀法对葛根黄酮进行分离，将醇回流法所得浓缩物用95%乙醇溶解，加入饱和中性醋酸铅溶液至不再有沉淀生成为止，过滤，沉淀用水洗2~3次，弃去滤渣，滤液与洗液合并，再加入碱式醋酸铅溶液，至不再有沉淀生成，将沉淀物干燥后悬浮于300ml95%乙醇中，通入H2S脱铅过滤后，沉淀用醇洗2~3次，合并滤液与洗液，调pH为6.5~7.0，减压浓缩回收乙醇至50ml左右，转移至蒸发皿中，真空干燥，得总异黄酮为浅棕色粉末。铅盐沉淀法得到的成品中总异黄酮含量高，可达62.81%，但其收率较低。第十九页，共26页。葛根素含量的测定1高效液相色谱法2薄层扫描法3紫外可见分光光度计法第二十页，共26页。高效液相色谱法葛根素对照品(中国药品生物制品检定所提供)；甲醇(色谱纯)；磷酸(优级纯)；重蒸蒸馏水，样品为含有葛根素的保健食品，所用的溶剂和溶液在分析前都要经过0.45µm滤膜过滤。第二十一页，共26页。色谱条件：色谱柱用DiamonsilTMC185µ4.6mm×250mm柱;柱温为室温;流动相用甲醇：水=30：70(v/v;用磷酸调节pH值为3.0);流量为1.0mL/min-1;检测波长250nm;进样量0.5~30µL第二十二页，共26页。标准溶液的制备：第二十三页，共26页。2薄层扫描法取上述各提取方法中干膏一定量(相当于2g药材的浸膏量)，用薄层扫描法，以药材葛根素含量为对照测定各方法干膏中葛根素的含量，将所称取的干浸膏分别溶于95%乙醇中，定量转移至100mL容量瓶中，加乙醇至刻度定容，摇匀即得。TLC条件:硅胶G板，氯仿-甲醇-水(7：2.5：0.25)为展开剂。扫描条件:λS=265nm，λR=365nm;点样量:1µL;标准品对照:葛根素(0.28mg/mL)，并以药材葛根素含量为100%，得到各提取方法的相对回收率第二十四页，共26页。3紫外可见分光光度计法标准曲线的制备：精密称取对照品葛根素5mg于25ml量瓶中，加95%乙醇溶解并稀释至刻度，