【酰胺酶研究文献综述2200字】

酰胺酶研究文献综述1.1酰胺酶的来源与分类酰胺酶（Amidase；EC:3.5.1.×）又称酰胺水解酶（Amidohydrolases），它能作用于分子内部的C-N键，催化酰胺生成对应酸和氨。由于酰胺酶高活性和良好的对映体选择性，因此被用于合成手性羧酸、α-氨基酸和酰胺化合物，近年来在化妆品、医药和农药行业等生物技术相关领域得到了广泛的开发和研究。20世纪60年代，科学家首先在在细菌和酵母中发现了酰胺酶。Kelly等从铜绿假单胞菌Pseudomonaaeruginosa中初步纯化并表征了一种酰胺酶，该酶显示出对脂肪酰胺的水解活性和酰基转移活性；Joshi和Handler从圆酵母Torulacremoris中鉴定出一种能够特异性催化尼克酰胺的酰胺酶[39-41]。酰胺酶酶资源丰富，广泛存在于动物、植物和微生物体内。微生物是其主要来源，包括Rhodococuuserythropolis[42]、BacilluscereusCECT5050T[43]、Klebsiellaoxytoca[44-45]、Rhodococcusrhodochrous[46]、Burkholderiamultivorans[47]、Delftiatsuruhatensis[48-49]以及Ochrobactrum[50-51]等。对酰胺酶进行分类需参考不同的标准。对含有酰胺酶基因的基因组片段的分析表明，大量酰胺酶基因与腈水合酶基因的α亚基和β亚基共转录。根据这样的特性，可将酰胺酶划分为腈水合酶偶联酰胺酶和腈水合酶非偶联酰胺酶；根据底物类型可将酰胺酶分为几种类型，如脂肪族酰胺酶、广谱酰胺酶和芳香族酰胺酶；根据对映体选择性可将酰胺酶划分为S-型和R型-酰胺酶。1991年，Chebrou和Mayaux等[52]对各种酰胺酶进行氨基酸序列比对，在分子水平上将酰胺酶进行分类。根据一级结构可将酰胺酶分为amidasesignature（AS）家族和腈水解酶超家族，2017年又增加了FmdA-AmdA家族分类[53]。AS家族酰胺酶的氨基酸序列中具备严格保守序列“GGSS”和特征性AS序列，酶蛋白一般是同源二聚体或同源八聚体。AS序列由大约130个氨基酸组成，富含甘氨酸和丝氨酸，并以Ser-Ser-Lys组成催化三联体。AS家族酰胺酶的底物谱广，可催化脂肪族酰胺、芳香酰胺和α-羟基酰胺[54]。到目前为止，大多数报道的酰胺酶都是AS家族的成员。腈水解酶超家族中的酰胺酶是一类含有保守亲核半胱氨酸残基的巯基酶，催化三联体由Cys-Glu-Lys组成，此类酰胺酶蛋白一般以同源四聚体或同源六聚体形式存在。序列同源性分析表明，腈水解酶超家族酰胺酶与腈水解酶、β-丙氨酸合成酶和腈合酶具有显著的序列同源性，且底物谱较窄，只能催化水解脂肪族酰胺化合物[55]。最早发现的FmdA-AmdA家族成员有乙酰胺酶和甲酰胺酶，这些研究大多集中在其在人类病原菌氮代谢的天然功能上，且只能催化水解短链脂肪族酰胺化合物[56-57]。1.2酰胺酶的催化机理基于对酶分子结构的预测，对酰胺酶的催化机理和构效关系的认识已愈发清晰。目前主要有脂肪酸酰胺水解酶FAAH和肽酰胺酶PAM两种假设催化机理[58]。FAAH催化机理（图1-4）主要分为四步：（1）酰胺酶的Ser241被激活，对底物的酰基进行亲核攻击生成酶连接的四面体中间体。（2）底物的氨基接受Ser217的质子，产生酰基-酶的中间形式和游离氨。（3）活化的水分子攻击酰基-酶中间体从而产生一个新的四面体中间体。（4）新的四面体中间体随后坍缩形成相应的酸，同时酰胺酶被再生。图1-4FAAH的催化机理Fig1-4ThecatalyticmechanismofFAAHPAM催化机理（图1-5）主要分为四步：（1）Ser202接受来自于Lys123的质子对底物中的羰基进行质子化，同时Ser226亲核攻击酰胺的羰基碳原子，形成四面体共价中间体。亲核攻击时，Ser202质子化Ser226的羰基氧。（2）四面体共价中间体的氨基被Ser202质子化，从而形成离去基团。Ser202从Lys123接受一个质子。（3）质子化的氨基形成氨，然后释放。同时Lys123从Ser202中重新捕获质子，而Ser202则捕获四面体中间体中羟基的质子后还原羰基，形成了酶-酰基中间体（4）最后，一个水分子通过氢键与Ser206结合，攻击酶-酰基中间体形成相应的酸，Ser206得到水分子的质子后得到再生。图1-5PAM的催化机理Fig1-5ThecatalyticmechanismofPAM1.3酰胺酶的重组表达酰胺酶是医药工业上重要的生物催化剂，而绝大部分酰胺酶来源于野生菌株。由于野生菌株酰胺酶表达量低不稳定，很难满足工业生产需求，因此实现外源表达并提高产量就变得格外重要。酰胺酶主要来源于细菌，大肠杆菌遗传背景明了、操作手段成熟、生长快速及易于培养等优点，使其成为异源表达酰胺酶的首选宿主。前期研究中表达量低或表达无活性包涵体[59-62]是大肠杆菌表达酰胺酶过程中存在的的问题，研究人员尝试了多种策略进行优化，例如低温诱导、不同IPTG浓度考察及延长诱导时间等，但都效果不佳。郭法谋[45]在重组表达KlebsiellaoxytocaKCTC1686来源酰胺酶KamH过程中发现，需要以原生肽的形式存在，KamH最终才能折叠成活性蛋白。当然也有部分酰胺酶与标签蛋白融合后，也能实现功能表达。Doran[63]等在大肠杆菌中重组表达了来源于Microbacteriumsp.AJ115的酰胺酶，N端融合CBP标签对重组蛋白活力无明显影响；殷金岗[64]在表达副球菌来源amiH时融合了pET29a载体上的多余氨基酸，但并不碍于其在大肠杆菌中的高效表达。综上所述，想要实现酰胺酶的高效重组表达，必须根据不同酰胺酶的性质制定不同的表达策略。1.4酰胺酶在合成医药中间体的应用羧酸类化合物、光学纯的氨基酸和酰胺类化合物是医药工业中的重要中间体，然而化学法合成常需要极端反应条件，通常手性选择性差且易生成副产物。酰胺酶通常具有良好的立体选择性，催化反应条件温和、产物光学纯度高的优点。近年来，研究者们尝试用酰胺酶介导的生物催化法进行替代，随着研究深入，已有许多酰胺酶被开发出来应用于医药中间体合成。（S）-哌嗪-2-甲酸是艾滋病治疗药物——Crixivan的手性前体，目前生产上采用化学拆分法，但工艺复杂，效率较低。Eichhorn[65]课题组分离到一株酰胺酶生产菌株PseudomonasfluorescensDSM9924，创建了全细胞催化法拆分外消旋哌嗪-2-甲酰胺生产（S）-哌嗪-2-甲酸关键中间体，反应路线如图1-6。该路线批次转化率达到41%，产物（S）-哌嗪-2-甲酸的光学纯度为99.4%。图1-6酰胺酶催化合成（S）-哌嗪-2-甲酸流程图Fig1-6Amidase-catalyzedprocessforsynthesisof(S)-Piperazine-2-carboxylicacid西司他丁作为肾脱氢二肽酶抑制剂，常与亚胺培南复配在临床上广泛用于各类敏感菌所致的感染。有报道[66]筛选到DelftiatsuruhatensisZJB-05174来源酰胺酶，选择性水解外消旋2,2-二甲基环丙烷甲酰胺，动力学拆分得到西司他丁关键手性中间体——（S