ISO 20186-32019 分子体外诊断检查 - 血液预检过程规范 - 细胞RNA - 第3部分血浆中分离的循环无细胞DNA标准立项发展报告

分子体外诊断检查—血液预检过程规范—细胞RNA—第3部分：血浆中分离的循环无细胞DNA标准立项发展报告报告编号：2023-SDR-ISO20186-3发布日期：2023年10月27日英文标题StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpre-examinationprocessesforvenouswholeblood—Part3:IsolatedcirculatingcellfreeDNAfromplasma摘要循环游离细胞DNA（circulatingcell-freeDNA,cfDNA）检测作为液体活检的核心技术，在肿瘤早筛、产前诊断、器官移植监测及感染性疾病诊断等领域展现出巨大的临床价值。然而，cfDNA检测结果的准确性高度依赖于分析前阶段（即血液样本的采集、处理、运输和储存）的标准化程度。样本采集后细胞裂解、DNA释放以及核酸酶降解等不可控因素，均可能导致检测结果的假阳性或假阴性。ISO20186-3:2019《分子体外诊断检查—血液预检过程规范—细胞RNA—第3部分：血浆中分离的循环无细胞DNA》正是在此背景下由国际标准化组织（ISO）发布的一项重要国际标准。本报告系统梳理了该标准的立项背景、核心技术内容、对临床实践的指导意义及其在全球范围内的推广应用情况。报告深入分析了标准中关于采血管选择、离心条件（包括二次离心法）、血浆分离时效性、储存温度及冻融循环等关键环节的规范化要求。研究表明，该标准的实施显著提升了不同实验室间cfDNA检测结果的可比性和可重复性，有效降低了分析前变异对下游分子诊断（如NGS、PCR）的干扰。通过明确预检过程的质量控制指标，该标准为液体活检技术的规范化、产业化发展提供了坚实的技术支撑。展望未来，随着微流控芯片、自动化样本前处理系统等新技术的涌现，以及cfDNA甲基化、片段组学等新标志物的发现，该标准将面临持续修订与更新的需求，以保持其与临床需求的同步性和技术先进性。关键词中文：循环游离DNA；液体活检；分子诊断；分析前过程；标准化；预检过程；血浆；ISOKeywords:Circulatingcell-freeDNA;Liquidbiopsy;Moleculardiagnostics;Pre-analyticalprocess;Standardization;Pre-examinationprocess;Plasma;ISO正文1.引言：液体活检时代的标准呼唤随着精准医疗的深入发展，以循环游离细胞DNA（cfDNA）为代表的液体活检技术，因其无创、可重复、能克服肿瘤异质性等优势，正逐步从科研实验室走向临床常规检测。从NIPT（无创产前检测）到早期肿瘤筛查，从微小残留病灶监测到抗药性突变发现，cfDNA分析已成为现代分子诊断不可或缺的工具。然而，液体活检技术的高度敏感性也使其极易受分析前变量的影响。在临床实践中，血液样本从采集到血浆分离，再到cfDNA的抽提及后续检测，其间的每一步操作都可能引入系统性偏差。例如，不恰当的抗凝剂可能导致细胞破裂释放基因组DNA（gDNA）稀释cfDNA；延迟离心可能导致白细胞裂解，释放大量gDNA污染；不规范的冻融循环可能导致cfDNA片段化加剧。这些问题若不加控制，将直接导致检测结果失真，甚至误导临床决策。为解决这一行业共性问题，国际标准化组织（ISO）于2019年发布了ISO20186-3:2019标准。该标准并非孤立的检测方法学标准，而是聚焦于“预检过程”——即从患者准备、样本采集直至分析前最终处理的整个链条。它的发布标志着液体活检领域进入了一个“标准化”的新阶段，为全球范围内cfDNA检测的质量保证提供了权威的技术依据。2.标准立项背景与必要性2.1临床需求的迫切性在ISO20186-3标准发布前，尽管cfDNA检测技术发展迅猛，但各实验室普遍采用“自建方法”或参照有限的文献进行样本前处理。这种做法导致不同机构间的检测结果难以互认，严重限制了多中心临床试验的顺畅进行。此外，由于缺乏统一规范，许多实验室在样本处理环节存在隐性缺陷——例如使用普通EDTA抗凝管（而非专门的cfDNA保存管）或仅进行一次低速离心，从而影响cfDNA产量与纯度。2.2技术迭代催生标准化需求从最初的血沉棕黄层分析到如今的高通量测序，cfDNA检测技术对样本质量的要求日益严格。特别是基于甲基化模式的分析，对gDNA污染的容忍度极低，任何分析前的污染都可能导致甲基化信号被淹没。ISO20186-3标准的立项，正是为了回应这一技术发展趋势——它提供的不仅是“步骤说明书”，更是一种“质量控制思维”。3.标准核心技术内容解析ISO20186-3:2019标准全文共分为多个章节，核心内容涵盖从血液采集到血浆制备的全程预检要求。以下为关键技术条款的解析：3.1样本采集与抗凝剂管理标准明确指出，用于cfDNA分析的血样应采集于含有EDTA（乙二胺四乙酸）的抗凝管中。这是因为EDTA能有效螯合钙离子，抑制核酸内切酶活性，减少CFDNA降解。值得注意的是，标准建议使用“cfDNA专用保存管”，这类采血管内置有稳定剂，可显著抑制细胞代谢和裂解，延长样本的稳定时间窗口——通常情况下，使用普通EDTA管需在4小时内完成血浆分离，而保存管可延长至24小时甚至更长。3.2血浆分离的标准操作血浆分离是预检过程中最关键也最容易出错的环节。标准规定必须采用“两次离心法”：-第一次离心（低速离心）：通常在1,600-2,000g，10分钟，用于去除血细胞（红细胞、白细胞、血小板）。此步骤需注意避免吸到中间的棕黄层（BuffyCoat），以防止白细胞及其含有的基因组DNA混入。-第二次离心（高速离心）：在第一次离心分离出的血浆基础上，进行高速离心（一般在16,000g以上，5-10分钟）。该步骤旨在去除残留的细胞碎片、微泡和血小板。高速离心后的上清液，即为“去血小板血浆”，被公认为最适合cfDNA分析的血浆基质。3.3时限、温度与稳定期-处理时限：对于常规EDTA管，从采血到血浆分离完成，标准建议不超过4小时。这一要求源于关于体外细胞稳定性的研究：在室温下放置超过4小时，白细胞开始出现明显凋亡并释放大量gDNA，将污染约20%的cfDNA样本。-储存温度：分离后的血浆应转移至聚丙烯冻存管中，并储存于-20℃或-80℃（推荐长期储存）。标准特别强调，应避免反复冻融——每次冻融循环都会导致cfDNA片段进一步断裂且可能引起片段丢失。通常建议将血浆分装为单次使用规格。3.4质量控制指标标准虽然没有直接规定cfDNA的绝对浓度阈值，但明确了关键的“泄露DNA”指标：即基因组DNA（gDNA）的污染程度。通常通过电泳图谱或实时定量PCR来判断是否存在高分子量DNA（对应gDNA）的污染。例如，若电泳显示有明显大于10kb的条带，则提示存在大量的gDNA污染，该样本可能不适用于某些高灵敏度的下游应用。3.5风险评估与记录标准要求实验室必须对预检过程进行风险评估，并制定书面标准操作程序（SOP）。记录应包括：标本接收时间、离心开始时间、离心机型号和转速、离心后血浆颜色（是否溶血）、储存温度等。这种“全链条可追溯性”是避免因操作失误掩盖真实检测问题的基础。4.主要参与单位：国际标准化组织与标准制定ISO20186-3:2019标准由国际标准化组织（ISO）下属的“临床实验室测试和体外诊断系统技术委员会”（ISO/TC212）制定。4.1国际标准化组织（ISO）简介ISO成立于1947年，是全球最大的非政府标准化专门机构，总部位于瑞士日内瓦。其宗旨是在世界范围内促进标准化工作的发展，以利于国际物资交流和互助，并扩大在知识、科学、技术和经济方面的合作。ISO发布的标准涵盖几乎所有技术领域，从传统制造业到新兴的生物技术。ISO标准并非强制性的法规，但因其代表国际共识，被各国政府和行业广泛采纳，成为国际贸易和技术互认的基础。4.2ISO/TC212技术委员会作为该标准制定的核心力量，ISO/TC212专注于“临床实验室测试和体外诊断系统”领域的标准化。该委员会的工作范围包括：-实验室质量管理与能力验证；-参考系统与溯源；-体外诊断试剂与仪器性能评估；-样本前处理与预检过程（本标准的直接归属领域）。技术委员会的成员来自全球各国的国家标准化机构（如中国的SAC、美国的ANSI、德国的DIN等），他们汇集了临床化学家、病理学家、分子生物学家、体外诊断产业界代表以及监管机构的专家。正是这些专家基于临床实验室的最佳实践和循证证据，确立了本标准的各项技术要求。4.3标准的全球适用性ISO20186-3:2019的一个显著特点是其“国际共识”属性。它避免了地域性或特定厂家操作方式的偏见，提供了一个可以全球通用的基准框架。该标准的成功制定和实施，也反映了国际标准化合作在精准医疗领域所发挥的日益重要的引领作用。5.结论：现状评估与未来展望5.1标准实施现状与影响自2019年发布以来，ISO20186-3已逐步成为全球液体活检实验室进行cfDNA分析前质量控制的核心参考文献。许多第三方独立实验室和临床机构都已将其转化升级为SOP的一部分。该标准的实施产生了以下积极影响：-提升结果的可靠性：统一离心速度、时间及储存方式，使不同研究的结果更具可比性。-促进多中心研究：当不同医院或国家的研究中心遵循同一标准时，数据整合变得更为顺畅，加速了生物标志物从发现到验证的转化进程。-推动监管互认：为药品监督管理部门（如FDA、NMPA）评审以cfDNA为基础的伴随诊断试剂时提供了关于样本处理一致性的技术依据。5.2当前挑战与修订需求尽管该标准是目前最权威的指南，但在实际应用中仍面临挑战：-技术更新：自动化的微流控平台和“直采-直检”集成设备的出现，对传统意义上的“预检”流程提出了新挑战（例如是否还需要分步离心）。-cfDNA新应用：随着对cfDNA片段组学、甲基化单倍型分析等前沿技术研究的深入，对质量控制的要求已超出当前标准的基本范围。例如，某些新应用需要额外评估cfDNA的片段长度分布特征。-教育培训：标准中的专业术语和要求可能让部分基层医疗机构护士或采血人员理解不够深入，导致实际执行与标准产生偏差。5.3未来发展展望展望未来，ISO/TC212极有可能在未来数年内启动对该标准的修订工作。修订方向预计将包括：1.兼容新兴技术：引入对“即时检测”或不完全离心法等新方案的评价准则。2.细化质量指标：针对cfDNA甲基化、片段组学等敏感应用，建立更为精细化的基线质量控制要求（如cfD