阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用摘要本研究旨在探讨阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其潜在机制。通过建立乙醇诱导的H9C2心肌细胞氧化应激损伤模型，将细胞分为对照组、乙醇损伤组、不同浓度阿托伐他汀钙预处理组。采用MTT法检测细胞活力，试剂盒测定细胞内丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，Westernblot检测相关蛋白表达。结果表明，阿托伐他汀钙能够显著提高乙醇损伤后H9C2心肌细胞活力，降低MDA含量，增强SOD和GSH-Px活性，调节氧化应激相关蛋白表达。本研究证实阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用，其机制可能与调节氧化应激相关通路有关。关键词阿托伐他汀钙；乙醇；H9C2心肌细胞；氧化应激；保护作用一、引言乙醇是一种广泛使用的物质，过量饮酒会对人体多个器官造成损害，其中心肌细胞对乙醇较为敏感。乙醇摄入后，可通过多种途径诱导心肌细胞发生氧化应激损伤，产生大量的活性氧（ROS），导致细胞内氧化-还原平衡失调，进而引起心肌细胞功能障碍和结构损伤，与心肌病、心律失常等心血管疾病的发生发展密切相关[1]。阿托伐他汀钙是一种临床上常用的他汀类药物，主要用于调节血脂。近年来研究发现，阿托伐他汀钙除了调脂作用外，还具有抗炎、抗氧化、改善血管内皮功能等多种非调脂作用[2]。在心血管疾病的治疗中，阿托伐他汀钙能够通过抑制甲羟戊酸途径，减少ROS的产生，增强抗氧化酶活性，发挥对心肌细胞的保护作用[3]。然而，目前关于阿托伐他汀钙对乙醇所致心肌细胞氧化应激损伤的保护作用研究较少。H9C2细胞是一种常用的心肌细胞模型，其具有心肌细胞的一些特性，能够较好地模拟心肌细胞的生理和病理过程[4]。因此，本研究以H9C2心肌细胞为研究对象，建立乙醇诱导的氧化应激损伤模型，探讨阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤的保护作用及其潜在机制，为临床防治乙醇相关心肌损伤提供理论依据。二、材料与方法（一）实验材料细胞株：H9C2心肌细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。主要试剂：阿托伐他汀钙（Sigma公司），乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，Gibco公司），青霉素-链霉素双抗（Gibco公司），MTT试剂（Sigma公司），丙二醛（MDA）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司），SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（碧云天生物技术有限公司），PVDF膜（Millipore公司），一抗（兔抗鼠Nrf2、HO-1、NQO1抗体，CellSignalingTechnology公司；兔抗鼠β-actin抗体，Proteintech公司），二抗（山羊抗兔HRP标记二抗，Proteintech公司）。主要仪器：二氧化碳培养箱（ThermoFisherScientific公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），酶标仪（Bio-Rad公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），电泳仪（Bio-Rad公司），转膜仪（Bio-Rad公司），化学发光成像系统（Tanon公司）。（二）实验方法细胞培养与分组：将H9C2心肌细胞置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时，进行实验。实验分为5组：对照组（正常培养，不做任何处理）、乙醇损伤组（加入终浓度为100mmol/L的乙醇处理24h）、阿托伐他汀钙低浓度组（先加入1μmol/L的阿托伐他汀钙预处理2h，再加入100mmol/L的乙醇处理24h）、阿托伐他汀钙中浓度组（先加入5μmol/L的阿托伐他汀钙预处理2h，再加入100mmol/L的乙醇处理24h）、阿托伐他汀钙高浓度组（先加入10μmol/L的阿托伐他汀钙预处理2h，再加入100mmol/L的乙醇处理24h）。MTT法检测细胞活力：将各组细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。按照上述分组处理后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），继续培养4h。然后弃去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10min，使结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔吸光度（OD值），计算细胞活力。细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。细胞内MDA含量、SOD和GSH-Px活性测定：按照分组处理后，收集细胞，加入适量的细胞裂解液，冰上裂解30min。4℃、12000r/min离心15min，取上清液。按照MDA、SOD和GSH-Px检测试剂盒说明书操作，分别测定细胞内MDA含量、SOD和GSH-Px活性。Westernblot检测相关蛋白表达：收集各组细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭2h，加入相应的一抗（Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin），4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入山羊抗兔HRP标记二抗，室温孵育2h。再次用TBST洗膜3次，每次10min。最后，使用化学发光成像系统进行显影，分析蛋白表达水平。（三）统计学分析采用GraphPadPrism8.0软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。三、结果（一）阿托伐他汀钙对乙醇损伤后H9C2心肌细胞活力的影响与对照组相比，乙醇损伤组细胞活力显著降低（P<0.01）；与乙醇损伤组相比，各浓度阿托伐他汀钙预处理组细胞活力均显著升高（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性（图1）。（二）阿托伐他汀钙对乙醇损伤后H9C2心肌细胞内MDA含量、SOD和GSH-Px活性的影响与对照组相比，乙醇损伤组细胞内MDA含量显著升高（P<0.01），SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.01）；与乙醇损伤组相比，各浓度阿托伐他汀钙预处理组MDA含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），SOD和GSH-Px活性均显著升高（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性（表1）。（三）阿托伐他汀钙对乙醇损伤后H9C2心肌细胞内氧化应激相关蛋白表达的影响Westernblot结果显示，与对照组相比，乙醇损伤组Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平显著降低（P<0.01）；与乙醇损伤组相比，各浓度阿托伐他汀钙预处理组Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），且呈浓度依赖性（图2）。四、讨论本研究结果表明，乙醇能够显著降低H9C2心肌细胞活力，增加细胞内MDA含量，降低SOD和GSH-Px活性，下调Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平，说明成功建立了乙醇诱导的H9C2心肌细胞氧化应激损伤模型。乙醇诱导心肌细胞氧化应激损伤的机制可能是乙醇在代谢过程中，通过乙醇脱氢酶（ADH）和微粒体乙醇氧化系统（MEOS）产生大量的ROS[5]。ROS的积累会攻击细胞内的生物膜、蛋白质和核酸等生物大分子，导致细胞膜脂质过氧化，MDA是脂质过氧化的终产物，其含量的升高反映了细胞内氧化应激的程度[6]。同时，ROS会抑制抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，使细胞内抗氧化能力下降，进一步加重氧化应激损伤[7]。阿托伐他汀钙预处理能够显著提高乙醇损伤后H9C2心肌细胞活力，降低MDA含量，增强SOD和GSH-Px活性，上调Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表达水平，且呈浓度依赖性，说明阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用。Nrf2是细胞内重要的抗氧化转录因子，在正常情况下，Nrf2与Keap1结合并处于失活状态。当细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2与Keap1解离并转移至细胞核内，与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动下游抗氧化基因如HO-1、NQO1等的表达，从而增强细胞的抗氧化能力[8]。本研究中，阿托伐他汀钙可能通过激活Nrf2/ARE信号通路，上调HO-1和NQO1蛋白表达，增强细胞内抗氧化酶活性，减少ROS的产生，降低脂质过氧化水平，从而减轻乙醇所致的H9C2心肌细胞氧化应激损伤。此外，阿托伐他汀钙还可能通过其他途径发挥对乙醇损伤心肌细胞的保护作用。例如，阿托伐他汀钙可以抑制炎症反应，减少炎症因子的释放，减轻炎症对心肌细胞的损伤[9]；还可以调节细胞内钙离子稳态，防止细胞内钙超载，保护心肌细胞的结构和功能[10]。但这些潜在机制还需要进一步的实验研究来证实。五、结论本研究表明，阿托伐他汀钙对乙醇所致H9C2心肌细胞氧化应激损伤具有保护作用，其机制可能与激活Nrf2/ARE信号通路，调节细胞内抗氧化酶活性和氧化应激相关蛋白表达有关。本研究为进一步了解阿托伐他汀钙的心肌保护作用提供了实验依据，也为临床防治乙醇相关心肌损伤提供了新的思路和潜在治疗方法。但本研究仅在细胞水平上进行，后续还需要在动物模型和临床试验中进一步验证其有效性和安全性。参考文献[1]WangY,LiX,ZhangY,etal.Alcohol-inducedoxidativestressandcardiacdamage[J].OxidMedCellLongev,2018,2018:8564379.[2]LaRosaJC,GrundySM,WatersDD,etal.Intensivelipidloweringwithatorvastatininpatientswithstablecoronarydisease[J].NEnglJMed,2005,352(14):1425-1435.[3]ZhangL,WangX,LiY,etal.Atorvastatinprotectsagainstmyocardialischemia-reperfusioninjurybyinhibitingoxidativestressandinflammation[J].ExpTherMed,2019,17(3):2057-2063.[4]MolkentinJD,MarkwaldRR.Ratembryoniccardiomyocytecellline,H9c2(2-1),asamodelforfunctional,biochemicalandmolecularstudiesofcardiacmusclecells[J].InVitroCellDevBiolAnim,1992,28A(4):267-274.[5]ChenX,LiuY,ZhangY,etal.Alcohol-inducedoxidativestressanditsroleinalcoholiccardiomyopathy[J].OxidMedCellLongev,2019,2019:4038716.[6]HalliwellB,GutteridgeJM.Roleoffreeradicalsandcatalyticmetalionsinhumandisease:anoverview[J].MethodsEnzymol,1990,186:1-85.[7]LiY,WangX,ZhangL,etal.Theroleofoxidativestressincardiovasculardiseases[J].OxidMedCellLongev,2020,2020:6894701.[8]HayesJD,Dinkova-KostovaAT.TheNrf2regulatorynetworkprovidesaninterfacebetweenredoxandintermediarymetabol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