北京培训中心两虫全流程2

北京培训中心两虫全流程文档ppt第1页，共38页。两虫检测全流程染色镜检（StainingandMicroscopy）.免疫磁分离（IMS）.过滤.淘洗.离心.第2页，共38页。样品预处理——过滤加标实验（QC）10L

采样量第3页，共38页。样品预处理——过滤第4页，共38页。样品预处理——过滤

滤芯结构过滤时水流流向淘洗时水流流向79层多孔网状泡沫层，两种规格交互叠放，由790mm压缩至30mm，螺栓固定。滤芯两个过滤层：外层区域为初滤器，内层滤核为选择性滤器（此结构在提高污水样品过滤速度的同时，保证有效地捕获隐孢子虫卵）。淘洗时，目标微生物以反流的形式更方便地进行有效淘洗。可处理高浊度原水。

取样流速可达4L/min。第5页，共38页。样品预处理——过滤

实验室过滤第6页，共38页。样品预处理——过滤

现场过滤第7页，共38页。样品预处理——过滤

现场过滤——两虫移动取样箱第8页，共38页。样品预处理——过滤

滤器

滤芯

采样管

水表

保温袋

自封袋

现场过滤——两虫移动取样箱第9页，共38页。样品预处理——过滤根据客户需要合理设计的取样箱。解决现场采样问题，并使得现场采样操作简便。

解决部分无两虫检测设备的送样问题。

现场过滤——两虫移动取样箱第10页，共38页。样品预处理——过滤

现场过滤第11页，共38页。样品预处理——过滤

现场过滤第12页，共38页。样品预处理——淘洗Filta-MaxXpress两虫快速法淘洗设备稳定的高回收率（大于70%）。淘洗时间90s，目前全球淘洗速度最快的设备。一键操作，操作简单。

不同样品的结果一致性高，性能稳定。第13页，共38页。样品预处理——离心离心机应放在牢固的工作台或地板上，尽量减少晃动。离心管连同适配器一起配平，保证误差在0.5g以内，尽量减少摆动。离心机设定2000g离心力，工作时间15分钟。离心机应选用无刹车系统的（自然停止大约需7分钟）。

第14页，共38页。免疫磁分离基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，在外磁场中，复合物被吸附而滞留在磁场中，使其与其他物质分离。

定义第15页，共38页。免疫磁分离第16页，共38页。免疫磁分离第17页，共38页。免疫磁分离

试剂盒第18页，共38页。免疫磁分离样品量：0.5-0.8ml沉淀混匀时间：1-2小时依次取下L型试管90°旋转2分钟弃上清1XbufferA冲洗磁珠180°旋转1分钟弃上清后酸化分离

实验流程第19页，共38页。免疫磁分离

沉淀物体积对于沉淀量小于0.5mL的样品，直接再悬浮成10mL.对于沉淀量大于0.5mL的样品，按照上述公式，即每0.5mL沉淀悬浮成10mL。比如，2mL沉淀应该悬浮成40mL，具体免疫磁分离过程可以取其中一分部进行。根据经验，20L原水的沉淀量一般1-2mL；100L处理水的沉淀量一般小于0.5mL。第20页，共38页。免疫磁分离

结果计算如出厂水检测出3个隐孢子虫，带入共计进行计算：Y=（3×10mL)/(10mL×100L)=0.03个/L如原水沉淀量2mL，悬浮成40mL，免疫磁分离取了其中10mL，检出3个隐孢子虫，带入并计算：Y=（3×40mL)/(10mL×20L)=0.6个/L第21页，共38页。染色镜检

染色试剂盒单克隆荧光抗体染色试剂复染液封固剂DAPI染色试剂阳参1倍洗脱缓冲液第22页，共38页。染色镜检

异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)分子量为389.4，最大吸收光波长为490~495nm，最大发射光波长为525~530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC是在荧光素的基础上通过化学反应增加硫氰酸基团得到的，硫氰酸基团可以和生物活性物质，例如蛋白质上的伯胺基团反应形成硫脲键，从而实现对生物活性物质的荧光标记。能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的黄绿色荧光。通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。储存条件：4℃避光保存。第23页，共38页。染色镜检4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用与荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。第24页，共38页。染色镜检4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4‘,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)浓度2mg/mL，用时需要5000倍稀释，现用现配。第25页，共38页。染色镜检

镜检第26页，共38页。染色镜检

两虫孢囊与卵囊特征——贾第虫孢囊外形：卵形或椭圆形直径：11-14um第27页，共38页。染色镜检

两虫孢囊与卵囊特征——隐孢子虫卵囊外形：类似球直径：4-6um第28页，共38页。染色镜检

两虫孢囊与卵囊特征苹果绿外壳：充要条件大小和形状第29页，共38页。染色镜检FITC染色DAPI染色DIC观察第30页，共38页。染色镜检第31页，共38页。染色镜检第32页，共38页。染色镜检第33页，共38页。如何提高回收率

采用商售PBS淘洗液试剂品牌货号PBSSigmaP4417-50TABNaOHFluka38215-1EA-RHClFluka35335-1LTween20SigmaP7949-100ML第34页，共38页。如何提高回收率

采用商售HCL和NaOH试剂，或标配所需酸碱第35页，共38页。如何提高回收率