T-CI 582-2024 基于卤虫无节幼体的纳米塑料水生毒性测定方法

团体标准T/CI582—2024基于卤虫无节幼体的纳米塑料水生毒性测定方法DeterminationofaquatictoxicityofnanoplasticsbasedonArtemiaspp.2024-12-24发布2024-12-24实施中国国际科技促进会发布ⅠT/CI582—2024前言 Ⅲ 12规范性引用文件 13术语和定义 14试验材料 24.1测试生物体 24.2化学品 25试验设备 36纳米塑料分散体的制备与表征 36.1分散体的准备 36.2分散体的表征 46.3原液悬浮液中分散体的稳定性 46.4人工海水中分散体的稳定性 46.5毒性试验暴露介质的制备 47试验操作 47.1试验概述 47.2卤虫卵囊的孵化 57.3纳米塑料对卤虫无节幼体的毒性测试 68数据分析 79试验报告 79.1试验程序 79.2报告中应包含的信息 710结果有效性 8参考文献 9ⅢT/CI582—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由浙江树人学院提出。本文件由中国国际科技促进会归口。本文件起草单位：浙江树人学院、浙江省水利河口研究院（浙江省海洋规划设计研究院）、自然资源部第二海洋研究所、浙江省海洋监测预报中心、浙江省农业科学院、杭州统标检测科技有限公司。1T/CI582—2024基于卤虫无节幼体的纳米塑料水生毒性测定方法本文件规定了卤虫无节幼体的水生毒性试验及纳米塑料的术语和定义、试验概述、试验方法、数据处理与分析等的基本要求。本文件适用于测定纳米塑料水生毒性而进行的卤虫无节幼体的急性毒性和慢性毒性的试验，其他类型的纳米材料可参照使用。本文件不适用于水溶性的纳米材料。本文件没有考虑供试物在试验期间可能发生的降解。如有必要，可在试验开始和结束时对试验体系中供试物浓度进行分析。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T37129纳米技术纳米材料风险评估GB/T37156纳米技术材料规范纳米物体特性指南3术语和定义GB/T37129、GB/T37156界定的以及下列术语和定义适用于本文件。孵化过程hatchingprocess在适当的环境条件下，将卤虫卵囊（原肠胚）转化为幼体的过程。试验容器testvessel容器适用于卤虫（Artemiaspp.）的培养。注1：试验容器和所有与试验溶液接触的设备，完全由玻璃或其他化学惰性材料制成。注2：试验容器包括烧瓶或烧杯等。幼体nauplius新孵化的卤虫（Artemiaspp.）幼体。注：卤虫（Artemiaspp.）的幼体（Nauplius）在初次孵化时的长度小于0.4mm。卵囊oocyst处于休眠状态的卤虫（Artemiaspp.）卵。注：卵囊能长期储存，并按需孵化。2T/CI582—2024测试所用的纳米塑料nano-plastic经过制造的纳米材料，以分散体的形式，用于接受生物学或化学测试或评估。[来源：GB/T37129—2018，3.1]纳米物体nano-object具有一个、两个或三个纳米级外部尺寸的离散材料块。注：如果尺寸差异显著（通常超过三倍则可能更倾向于使用诸如“纳米纤维”或“纳米片”等术语，而不是“纳米颗粒”。对照control通过设置特定组别，为实验结果提供可比较的基准，以排除无关变量干扰、验证实验处理有效性。阳性对照positivecontrol经过充分研究的材料或物质，当使用特定的测试方法对其进行评估时，能证明测试系统适合于在测试系统中产生可重复、适当的阳性响应。注：在卤虫毒性测试中，使用重铬酸钾（K2Cr2O7）作为阳性对照的处理，见ISO10993-12。阴性对照negativesolution不含待测样品的试验介质。注：见ISO10993-12。毒性相关参数toxicity-relatedparameters衡量卤虫水生毒性的量化指标。半数有效浓度EC50符合测试标准的浓度，在该浓度下对50%的生物体产生影响。4试验材料4.1测试生物体可以使用不同种类的卤虫（Artemiaspp.但卤虫（A.salina）是首选的测试物种。卤虫卵囊的商业来源很多。卤虫幼体（新生卤虫）应通过在实验室孵化率≥90%的卵囊来生产。4.2化学品4.2.1人工海水。4.2.5氢氧化钠溶液（400g/LNaOH）。4.2.6实验用水应符合GB6682中三级水的规格。4.2.7实验所用化学试剂均为分析纯（纯度达到99.9%以上）。3T/CI582—20245试验设备5.1孵化容器适用于卤虫（Artemiaspp.）卵囊的孵化，以便于收获。注1：孵化容器的锥形容器部分为透明或半透明，以确保良好的光线透射。注2：孵化容器包括如图1所示的玻璃等材质的锥形容器或“V”形底部容器。注3：孵化容器底部持续通气，以保持卵囊悬浮并提供足够的氧气供卵囊孵化。注4：孵化容器采用玻璃材质。图1卤虫孵化容器及孵化室底部通气示意图5.2适当的温度控制设备。5.3显微镜。5.6空气泵。5.7移液管。5.8实验室天平。5.9实验室水净化系统。5.10实验室烘箱。5.11实验室高压灭菌器。5.12超声波系统。5.13热板搅拌器。5.14溶氧量计。5.15温度计。5.16pH计。5.18多参数光度计。5.19光源。5.20用于控制光照条件和测量光强度的装置（照度计）。5.21用于测定总有机碳的设备。5.22用于测定化学需氧量（COD）的设备。6纳米塑料分散体的制备与表征6.1分散体的准备4T/CI582—2024spp.)评估纳米塑料的毒性之前，应将纳米塑料在人工海水中充分分散。纳米塑料分散体的制备过程通过标准操作程序，用20‰人工海水配制成相应浓度，并用适量小苏打（NaHCO3）调节pH至8.5左右。纳米塑料在人工海水悬浮液中的分散可以通过搅拌、超声处理或通过功能化基团以及使用生物相容性分散剂试剂来实现。通过搅拌、超声波或官能团以及使用生物相容性分散剂试剂，可以实现原液悬浮液中MNP的分散。超声处理应以不产生其他新材料的方式进行，并应评估超声处理的效果。应避免使用会对卤虫产生有害影响的化学品。当使用此类载体时，空白对照应暴露于与测试纳米塑料悬浮液中使用相同浓度的载体中。6.2分散体的表征ISO20998⁃1。6.3原液悬浮液中分散体的稳定性纳米塑料分散体的大小分布及其在一段时间内的稳定性应得到表征。原液悬浮液中纳米粒子的尺寸分布、稳定性及浓度应在相关间隔内进行评估。6.4人工海水中分散体的稳定性在实验过程中（6h、24h和48h应验证人工海水中分散体的稳定性以及纳米塑料的实际浓度。由于海水可能会对测试纳米材料的物理化学性质产生影响，因此建议对测试纳米塑料进行进一步的表征，并评估聚集/团聚的程度（或粒径分布的变化）。6.5毒性试验暴露介质的制备所有的暴露介质都是从纳米塑料原料悬浮液（例如1000mg/L）中新鲜制备的。应将适当体积的原料悬浮液直接添加到灭菌的人工海水中，以在暴露介质中达到相关浓度的纳米塑料。尽管卤虫在孵化和生长过程中不需要无菌条件，但仍应尽量减少单细胞藻类和细菌污染的发生。无菌过滤是在不改变人工海水化学成分的情况下对人工海水进行消毒的最佳方法，因此建议使用0.2μm过滤器来获得无菌人工海水。7试验操作7.1试验概述7.1.1材料准备用淡氯溶液彻底清洗孵化器和培养容器，冲洗，并自然风干。避免使用肥皂，因为它会留下轻微残留物，在孵化过程中通气时会产生泡沫，并使卵囊留在水面上。尽管材料没有必要完全无菌，但仍应尽量减少单细胞藻类和细菌污染的发生。7.1.2人工海水配制用于孵化和所有毒性测试的稀释水应为盐度为20‰的标准人工海水（将20g人工海盐溶解于8.0±0.5，氧含量应至少达到90%的饱和度。如有必要，应使用浓盐酸或适量小苏打（NaHCO3）调节pH。在使用盐水之前，应通过0.1μm过滤器进行过滤。5T/CI582—20247.1.3卤虫卵囊的储存密封的卤虫卵囊可在室温下保存数年，但一旦打开，应在两个月内使用完毕。每次使用后，应封闭并储存在冰箱中。如果同一封闭体积中的卤虫卵囊在两个月内无法用完，则剩余部分应放置在紧密封闭的容器中冷冻，直到需要时再取出。7.2卤虫卵囊的孵化7.2.1卤虫卵囊的消毒7.2.1.2以每升50g卤虫卵囊的密度浸泡30min。7.2.1.3在125μm的筛网上用蒸馏水彻底冲洗卤虫卵囊3次。7.2.1.4卤虫卵囊已准备好进行孵化。7.2.2卤虫卵囊的孵化7.2.2.1使用透明或半透明（最好是无色）孵化容器。7.2.2.2通过开放式通气管道将空气向下供应至容器锥形部分的顶端（见图1）。7.2.2.3向容器中加入1000mL人工海水。7.2.2.4将温度调节在27℃~29℃之间。7.2.2.5通过加入适量的浓盐酸或适量小苏打（NaHCO3将pH调节在8左右。7.2.2.6在水面上施加至少1000lx的照明。7.2.2.7以2g/L的密度孵化已消毒的卤虫卵囊。7.2.2.8孵化24h后，获得卤虫的无节幼体。注：孵化时间随孵化温度和所用卤虫（Artemiaspp.）的地理品系而异。7.2.3卤虫无节幼体的收集7.2.3.1卤虫卵于人工海水中孵化20h，孵化温度为27℃±0.5℃,光照强度1000lx，保持适量充气。关闭通气5min~10min，已孵化出无节幼体的囊壳会浮起并可以从表面移除，而无节幼体和未孵化的卤虫卵囊会集中在底部。7.2.3.2由于无节幼体具有正趋光性，可以通过遮蔽孵化容器上部并将光源聚焦在底部透明锥形部分来提高其浓度。7.2.3.3根据卤虫的生物学特性，卤虫卵囊产出后24h以内进行收集，此时为Ⅱ龄的卤虫无节幼体。7.2.3.4选择生态条件最佳的Ⅱ龄卤虫无节幼体（不易下沉，可以自由运动于各个液层，活力较强的幼体通过使用细网筛（<150μm）在过滤器上虹吸收集浓缩的无节幼体，细网筛应始终浸没在水中，以防止对无节幼体造成物理损伤。7.2.3.5用人工海水彻底冲洗收集的无节幼体，以去除可能的污染物和孵化代谢产物，如甘油等。7.2.3.6每次新孵化都要准备新鲜的人工海水。7.2.4孵化率的计算7.2.4.1孵化率是指在标准孵化条件下，从100个健康卤虫卵囊中能够产生的无节幼体的数量。中，并通过加入几滴Lugol溶液（含有2g碘化7.2.4.3使用立体显微镜，计数每个子样本中孵化的无节幼体的数量，并计算平均数量（N）。同时，计6T/CI582—2024算每个样本中处于伞形阶段的胚胎数量，并计算平均值（U）。7.2.4.4通过向每个小瓶中加入一滴氢氧化钠溶液和五滴3%~6%次氯酸钠溶液，将未孵化的卤虫卵囊脱壳并溶解空的卤虫卵壳。7.2.4.5使用立体显微镜，对每个子样本中未孵化（橙色）的胚胎进行计数，并计算平均数（E）。N+U+E）计算六个重复的平均值。7.3纳米塑料对卤虫无节幼体的毒性测试7.3.1试验组和对照组7.3.1.1测试容器内填充适当体积的人工海水和测试样品的悬浮液。然后将卤虫无节幼体放入测试容器中。每个试验浓度和对照组应使用至少50个卤虫无节幼体，每组3次~5次重复。7.3.1.2除处理系列外，设置阳性对照及空白对照组。7.3.2试验浓度7.3.2.1可进行范围测定测试，以确定最终测试的浓度范围。为此，无节幼体暴露于一系列间隔较大的测试纳米塑料浓度中。每个测试浓度下至少应暴露50个无节幼体。7.3.2.2至少应使用五种测试浓度。它们应按几何级数排列。如果测试的系列少于5个，且分离因子不超过2，则应提供理由。如果导致100%的不动性，则使用这些浓度。测试的最高浓度和最低浓度应使得矫正死亡率在0%~100%之间。7.3.3暴露条件7.3.3.1水温应在27℃~29℃的范围内，每个单独测试中的水温变化应不超过±1℃。建议使用16h光照和8h黑暗周期的循环。完全的黑暗也是可以接受的，特别是对于光敏感的纳米塑料。7.3.3.2在急性毒性测试期间（24h由于卤虫的无节幼体在刚孵出的24h内营养来源于自身的卵黄，为保证试验的均一同质性，不建议给卤虫无节幼体喂食；在长期毒性测试期间（14d每天两次（间隔12h）投喂小球藻（Chlorella，密度为105cells/mL)，每3天换一次添加同样测试剂量的纳米塑料的水。取96孔细胞培养板，空白对照组、阳性对照组和每个浓度的样品组各设3个~5个平行孔；空白对照组加200μL人工海水，样品组加200m所需浓度的样品液，阳性对照组加标准浓度的试液；每个测试样品按需要设置3个~5个终浓度（如1000μg/mL，100μg/mL，10μg/mL在每孔分别加入优选得到的50个同步生长的卤虫，制成测试培养板。7.3.5持续时间7.3.5.1在急性毒性测试，试验持续时间为24h。7.3.5.2在慢性毒性测试，试验持续时间为14d。7.3.6活性观察在测试开始后的24h或14d，检查每个测试容器中的无节幼体是否不动或死亡。除了不动性外，还应报告任何异常行为或外观。7.3.7分析测量7.3.7.1至少在试验开始和结束时，在对照和最高试验纳米塑料浓度下测量溶解氧和pH。在任何一次7T/CI582—2024测试中，pH的变化通常不应超过1.5个单位。温度通常在控制容器或环境空气中测量，并应在测试期间连续记录，或至少在测试开始和结束时记录。7.3.7.2在试验开始和结束时，应至少在含有最高和最低试验浓度的容器中测量试验纳米塑料的总浓度。结果应以测量的浓度为基础。7.3.7.3在试验开始和结束时，应至少在含有最高和最低试验浓度的试验容器中验证分散体的稳定性和纳米塑料的尺寸分布。8数据分析8.1数据应以表格形式进行汇总，并显示每个处理组和对照组在每个观察点的无节幼体不动或死亡情况。应列出使用的无节幼体数量和百分比，以及每个浓度的校正死亡率。数据通过适当的统计方法（例如概率分析等）进行分析，以计算曲线的斜率和95%置信限（p=0.95）下的EC50值。8.2如果标准方法不适用于计算EC50值，则可以使用校正死亡率为0%的最高浓度产生，和校正死亡率为100%的最低浓度的几何平均值作为EC50值的近似值。9试验报告9.1试验程序测试报告应符合所使用的测试程序要求。9.2报告中应包含的信息9.2.1测试纳米材料测试纳米塑料的完整物理化学特性（例如形状、纯度、尺寸等，根据ISO/TR13014标准a）使用扫描电子显微镜（SEM）测试的纳米塑料的微观形态；b）测试纳米塑料的物质信息（制造商代码、目录或配方编号、批号或生产日期、商品名等c）所使用的所有设备和仪器（制造商型号或目录编号、序列号或生产日期、品牌名等d）待测纳米塑料在原料悬浮液和天然海水中的分散特性和稳定性。9.2.2试验物种试验物种如下：a）测试的卤虫（