靶向STING小分子抑制剂的探索与生物活性评价：从发现到应用

靶向STING小分子抑制剂的探索与生物活性评价：从发现到应用一、引言1.1STING的生物学功能与研究意义在机体的免疫系统中，STING（StimulatorofInterferonGenes）作为一种关键的信号转导分子，犹如精密仪器中的核心部件，发挥着不可或缺的作用，对维持机体免疫平衡和抵御各类疾病侵袭至关重要。它主要定位于内质网，是连接先天性免疫和适应性免疫的关键节点，能够精准地感知细胞内异常的DNA，进而激活一系列免疫反应，在免疫调节网络中占据着核心地位。当机体受到病毒、细菌等病原体入侵，或细胞内出现DNA损伤、线粒体DNA泄露等异常情况时，STING会迅速做出响应。其上游的环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）能够识别这些异常的双链DNA，并催化产生第二信使环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cGAMP）。cGAMP作为一种信号传递者，会与STING特异性结合，促使STING发生构象变化，从内质网转移至高尔基体。在高尔基体上，STING招募并激活下游的TANK结合激酶1（TBK1），TBK1进一步磷酸化干扰素调节因子3（IRF3），使其进入细胞核，诱导Ⅰ型干扰素（IFN）和促炎性细胞因子的表达。这些细胞因子就像免疫系统的“警报信号”，能够激活免疫细胞，如自然杀伤细胞、巨噬细胞和T细胞等，增强机体的免疫防御能力，共同抵御病原体的入侵。除了在抗感染免疫中发挥关键作用外，STING在肿瘤免疫领域也备受关注。肿瘤细胞的快速增殖和代谢异常往往会导致大量的DNA释放到细胞质中，这些异常DNA可激活cGAS-STING信号通路，引发机体的抗肿瘤免疫反应。STING激动剂能够增强这种免疫反应，促使免疫细胞识别和杀伤肿瘤细胞，因此被视为一种极具潜力的肿瘤免疫治疗靶点。多项研究表明，在多种肿瘤模型中，激活STING信号通路可以显著抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期。例如，在黑色素瘤模型中，使用STING激动剂治疗后，肿瘤组织中浸润的T细胞数量明显增加，肿瘤生长受到明显抑制。然而，如同硬币的两面，STING信号通路的异常激活也与多种疾病的发生发展密切相关。在自身免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等，由于机体免疫系统的紊乱，STING信号通路被过度激活，导致大量炎性细胞因子的释放，引发炎症反应，对自身组织和器官造成损伤。在神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病等，异常激活的STING信号通路参与了神经炎症的发生发展，加速了神经元的损伤和死亡。越来越多的研究发现，STING信号通路的异常激活还与代谢紊乱疾病，如肥胖、糖尿病等相关。鉴于STING在免疫反应中的重要作用以及其异常激活与多种疾病的关联，开发靶向STING的小分子抑制剂具有重大的理论意义和潜在的临床应用价值。通过精准地抑制STING信号通路，可以为治疗自身免疫性疾病、神经退行性疾病、代谢紊乱疾病等提供新的治疗策略。在自身免疫性疾病的治疗中，小分子抑制剂可以抑制过度激活的STING信号通路，减少炎性细胞因子的释放，从而缓解炎症反应，减轻组织损伤。在神经退行性疾病的治疗中，小分子抑制剂有望通过抑制STING信号通路，减轻神经炎症，延缓神经元的损伤和死亡。随着对STING生物学功能的深入研究以及药物研发技术的不断进步，相信在不久的将来，靶向STING的小分子抑制剂将为这些疾病的治疗带来新的希望，为患者提供更加有效的治疗手段。1.2靶向STING小分子抑制剂的研究现状近年来，随着对STING信号通路在疾病发生发展中作用机制的深入研究，靶向STING的小分子抑制剂成为了药物研发领域的热点之一，众多科研团队和制药公司投入大量资源进行探索，取得了一系列令人瞩目的研究成果。从抑制剂类型来看，目前主要包括共价抑制剂和非共价抑制剂两大类别。共价抑制剂能够与STING蛋白中的特定氨基酸残基形成共价键，从而稳定地结合并抑制STING的活性。其中，以C-176、C-178和H-151为代表的共价抑制剂备受关注。研究表明，C-176和C-178可以与STING蛋白中的Cys91发生共价结合，阻断STING活化所诱导的棕榈酰化，进而阻断其在高尔基体组装成多聚体复合物，有效抑制下游信号通路传导。在细胞实验中，它们能够显著抑制由STING介导的β干扰素（IFNβ）生成，抑制小鼠骨髓源巨噬细胞中STING的响应，以及抑制下游激酶TBK1的磷酸化。在多器官炎症的Trex1-/-基因缺陷鼠模型中，C-176能够显著降低血清中炎症因子IFN的浓度，降低炎症相关基因mRNA的表达水平，改善组织中的炎症现象，展现出良好的体内抗炎效果。然而，C-176和C178只对小鼠STING有良好活性，对人STING的活性较差。为解决这一问题，研究人员进行了结构优化，保留了与Cys91的共价结合位点，获得了化合物H-151。H-151不仅作用机制与C-176和C178类似，还能够有效地抑制人STING蛋白，可抑制I型IFN反应，降低TBK1磷酸化和抑制人STING棕榈酰化，为治疗人类相关疾病提供了更具潜力的候选药物。非共价抑制剂则通过与STING蛋白的活性位点或别构位点非共价相互作用，来抑制STING的功能。例如，小分子SN-011及其同一骨架的小分子衍生物是一类强效的靶向STING信号通路的非共价抑制剂。机制研究证实，SN-011能特异性结合在STING蛋白与其内源性配体分子2’3’-cGAMP结合的口袋内，与环状二核苷酸（CDN）竞争STING二聚体的结合口袋，从而阻断CDN结合和STING激活。在过表达STING相关突变体的细胞内，SN-011能显著抑制下游过度激活的免疫和炎症细胞因子。在Aicardi-Goutièressyndrome的小鼠疾病模型（Trex1-/-）中，SN-011能显著改善小鼠多组织器官的免疫损伤，且延长疾病小鼠的生存时间，显示出在治疗STING相关自身免疫性疾病方面的潜力。除了上述直接靶向STING蛋白的小分子抑制剂外，还有一些间接作用于STING信号通路的抑制剂被开发出来。清华大学药学院张从刚课题组发现肝X受体（LXR）脂代谢通路的激动剂（T0901317等）能够诱导一种酶SMPDL3A的表达，该酶能够特异性地降解cGAS-STING信号通路的第二信使2’3’-cGAMP，从而特异性地抑制cGAS-STING天然免疫通路的激活。这是首次发现能够靶向cGAMP降解的小分子抑制剂，为特异性地抑制cGAS-STINGDNA免疫异常激活提供了新的思路。在细胞实验和动物模型中，T0901317及其他LXR脂代谢通路的激动剂均表现出对cGAS-STING信号通路的抑制作用，为治疗神经炎症、衰老以及自身免疫性疾病等提供了新的策略。在应用成果方面，靶向STING小分子抑制剂在多种疾病模型中展现出治疗潜力。在自身免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等，STING信号通路的过度激活是导致炎症反应的重要因素之一。相关抑制剂能够抑制STING信号通路，减少炎性细胞因子的释放，从而缓解炎症症状，为这些疾病的治疗提供了新的治疗靶点和策略。在神经退行性疾病领域，如阿尔茨海默病、帕金森病等，异常激活的STING信号通路参与了神经炎症的发生发展，加速神经元的损伤和死亡。研究表明，使用靶向STING小分子抑制剂可以抑制神经炎症，减轻神经元的损伤，为神经退行性疾病的治疗带来了新的希望。在肿瘤治疗方面，虽然STING激动剂在增强抗肿瘤免疫方面具有潜力，但在某些情况下，抑制STING信号通路也可能有助于肿瘤的治疗。例如，在一些肿瘤微环境中，STING信号通路的异常激活可能会促进肿瘤的生长和转移，此时使用小分子抑制剂抑制STING信号通路，有可能抑制肿瘤的发展。在弥漫大B细胞淋巴瘤中，化疗药物诱导的DNA损伤触发eccDNAs的生成，导致STING信号以非cGAS依赖的方式激活，抑制STING与顺铂具有协同抗肿瘤作用，为肿瘤的联合治疗提供了新的思路。1.3研究目的与内容概述本研究聚焦于靶向STING小分子抑制剂领域，旨在发现新型的、具有高效抑制活性的小分子抑制剂，并对其生物活性进行全面、深入的评价，为相关疾病的治疗提供新的药物研发思路和潜在的治疗手段。本研究首先进行基于结构的虚拟筛选。借助计算机辅助药物设计技术，依据STING蛋白的三维结构，从大规模的化合物数据库中筛选出与STING活性位点或别构位点具有潜在高亲和力的小分子化合物。通过分子对接等方法，模拟小分子与STING蛋白的相互作用模式，初步预测化合物的结合能力和抑制活性，挑选出若干个具有潜在活性的小分子作为后续实验的研究对象。在前期虚拟筛选的基础上，对挑选出的小分子化合物进行合成与优化。依据有机合成化学原理和方法，运用各种合成路线和反应条件，制备目标小分子化合物。并对化合物的结构进行表征，确证其化学结构的正确性。针对合成得到的小分子化合物，通过多种细胞模型和分子生物学技术，系统地评价其对STING信号通路的抑制活性。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞培养上清中Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子的分泌水平，以评估小分子对STING下游信号通路的抑制效果。运用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术检测STING蛋白及其下游关键信号分子的磷酸化水平，进一步探究小分子的作用机制。在细胞水平活性评价的基础上，建立合适的动物模型，深入评价小分子抑制剂的体内生物活性和安全性。选用免疫缺陷小鼠或免疫健全小鼠，构建与STING信号通路异常激活相关的疾病模型，如自身免疫性疾病模型、神经炎症模型等。通过体内实验，观察小分子抑制剂对疾病症状的改善情况，检测相关炎症指标和免疫细胞活性的变化，评估其体内治疗效果。在实验过程中，密切监测动物的体重、饮食、行为等生理指标，以及血常规、肝肾功能等生化指标，以评价小分子抑制剂的安全性和潜在的毒副作用。本研究的创新点在于，采用基于结构的虚拟筛选与实验验证相结合的策略，能够高效、精准地发现新型的靶向STING小分子抑制剂，为药物研发提供了新的思路和方法。通过对小分子抑制剂生物活性的全面评价，不仅关注其对STING信号通路的抑制效果，还深入研究其体内安全性和毒副作用，为后续的临床前研究和药物开发奠定了坚实的基础。本研究有望为治疗STING信号通路异常激活相关的多种疾病提供新的治疗靶点和潜在的药物候选物，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。二、靶向STING小分子抑制剂的发现方法2.1高通量筛选技术2.1.1原理与流程高通量筛选（High-ThroughputScreening，HTS）技术是一种利用自动化设备和先进的检测技术，在短时间内对大量样本进行快速、高效、灵敏筛选的方法。它能够在一次实验中同时检测成千上万种化合物或生物分子，大大提高了筛选效率，加速了药物研发进程。高通量筛选技术的基本原理是基于分子水平和细胞水平的实验方法，将大量的化合物或生物样本与特定的靶点（如蛋白质、核酸、细胞等）进行相互作用，通过高灵敏度的检测手段，快速、准确地检测出样本对靶点的活性或作用。在筛选过程中，利用自动化设备将样本和靶点按照特定的排列方式放置在微孔板中，实现大规模并行实验。通过微流控芯片、微孔板等技术，能够同时处理多个样本，使得筛选速度大幅提高。借助先进的检测手段，如荧光成像、质谱、化学发光等，可以快速、准确地检测出微量目标物质，提高检测灵敏度。高通量筛选技术的流程主要包括以下几个关键步骤。首先是化合物库的构建，这是高通量筛选的基础。化合物库可以包含天然产物提取物、合成化合物、组合化学库等多种来源的化合物。这些化合物需要经过纯化、鉴定和存储，以确保其质量和稳定性。化合物的来源广泛，天然产物提取物蕴含着丰富的生物活性成分，是药物研发的重要资源；合成化合物可以通过有机合成化学方法精确控制结构，满足不同的筛选需求；组合化学库则能够快速生成大量结构多样化的化合物。接着是筛选模型的建立，根据研究目的和靶点的特性，选择合适的分子水平或细胞水平的筛选模型。在靶向STING小分子抑制剂的筛选中，可以构建基于STING蛋白与配体相互作用的分子水平模型，或者基于STING信号通路激活的细胞水平模型。对于分子水平模型，可以利用STING蛋白的晶体结构，通过分子对接等方法筛选与STING活性位点或别构位点结合的化合物；对于细胞水平模型，可以使用表达STING的细胞系，通过检测细胞内信号分子的变化或细胞因子的分泌来筛选抑制STING信号通路的化合物。然后是自动化筛选过程，利用自动化操作系统将化合物库中的化合物逐一加入到筛选模型中，并按照预设的实验条件进行反应。自动化操作系统能够精确控制加样量、反应时间、温度等参数，减少人为误差，提高实验的准确性和重复性。在这一过程中，自动化设备会根据实验需求，完成样品分配、反应、检测等一系列操作，实现高通量、高分辨率的实验流程。最后是数据的采集和分析，通过高灵敏的检测仪器采集实验数据，并利用计算机软件对数据进行处理和分析。数据采集过程需要确保检测仪器的准确性和稳定性，以获取可靠的数据。数据分析则需要运用统计学方法和生物信息学工具，从海量的数据中筛选出具有潜在活性的化合物，并进一步分析其结构与活性之间的关系。通过对数据的深入挖掘，可以发现潜在的药物先导化合物，为后续的药物研发提供线索。2.1.2应用案例分析在靶向STING小分子抑制剂的发现中，高通量筛选技术发挥了重要作用，众多研究通过该技术成功发现了具有潜在活性的抑制剂。以C-176和C-178这两种共价抑制剂的发现为例，研究人员运用高通量筛选技术，在细胞水平上对大量化合物进行了筛选。他们构建了基于STING介导的β干扰素（IFNβ）生成的细胞筛选模型，将众多化合物加入到表达STING的细胞系中，通过检测细胞培养上清中IFNβ的分泌水平，评估化合物对STING信号通路的抑制活性。在这个过程中，高通量筛选技术的自动化和高效性得以充分体现，能够在短时间内对大量化合物进行测试，大大提高了筛选效率。经过大规模筛选，研究人员发现了化合物C-176和C-178能够显著抑制由STING介导的IFNβ生成，抑制小鼠骨髓源巨噬细胞中STING的响应，以及抑制下游激酶TBK1的磷酸化。进一步的研究通过STING氨基酸突变实验、生物质谱技术和分子探针实验，证实了化合物C-178与STING蛋白中的Cys91发生共价结合。化合物发生共价结合之后，Cys91不再会接受十六烷酰化，从而阻断棕榈酰化诱导的STING聚集，进而阻断其在高尔基体组装成多聚体复合物，有效抑制下游信号通路传导。再如，北京大学雷晓光教授团队与首都医科大学附属北京儿童医院毛华伟教授团队合作发现的天然产物Anhydrotuberosin（ATS）。研究团队利用高通量筛选技术，构建了一套可实现高通量测试的双荧光素酶筛选体系。将IFN-β的启动子元件克隆到萤火虫荧光素酶的上游，同时利用海肾荧光素酶作为内参，从近7000个单体化合物中进行筛选。最终鉴定到来源于葛根的天然产物ATS具有强效的STING抑制活性。之后在蛋白水平证实ATS和STING具有直接的相互作用，并能够在HeLa、THP-1及SAVI病人来源的PBMC等多种细胞中显著性抑制STING激活后的下游信号。通过协同分子对接、关键氨基酸突变及ATS衍生的集成研究手段，初步解析了ATS和STING蛋白的结合模式。在小鼠体内，ATS具有良好的药代动力学参数，并在与STING过度激活相关的Trex1敲除的自身免疫炎症疾病小鼠、葡聚糖硫酸钠诱导的炎症性肠病小鼠模型中，证实ATS能够通过抑制STING缓解自身免疫疾病。这些成功案例充分展示了高通量筛选技术在靶向STING小分子抑制剂发现中的强大优势和重要价值。它能够快速从海量的化合物中筛选出具有潜在活性的分子，为后续的药物研发提供了重要的先导化合物。高通量筛选技术的应用，不仅加快了药物研发的速度，还降低了研发成本，提高了研发的成功率。随着技术的不断发展和完善，高通量筛选技术将在靶向STING小分子抑制剂的研究中发挥更加重要的作用，为相关疾病的治疗带来更多的希望。2.2基于结构的药物设计2.2.1STING蛋白结构解析STING蛋白是一种多结构域的跨膜蛋白，在免疫信号传导中发挥着核心作用，其独特的结构特征是理解其功能以及开发靶向小分子抑制剂的关键基础。STING蛋白主要由跨膜的N末端结构域（N-TerminalDomain，NTD）和球状的C末端结构域（C-TerminalDomain，CTD）构成。N末端结构域包含四个跨膜区域（TransmembraneRegion1-4，TM1-4），这些区域如同锚定装置，将STING牢固地锚定于内质网膜或其他细胞器膜上。在STING二聚体中，TM1-4呈现出结构域交换结构，一个亚基的TM1与另一个亚基的TM2、TM3和TM4组合在一起，八个跨膜区巧妙地排列成两层，其中两个亚基的TM2和TM4形成中央层，被外围的TM1和TM3包围。这种独特的结构不仅赋予了STING在膜上的稳定性，还对其在细胞内的定位和运输起着重要的调控作用。CTD则暴露在细胞质中，是STING发挥功能的关键区域，包含配体与蛋白结合的区域（Ligand-BindingDomain，LBD）和C尾端结构域（C-TerminalTail，CTT）。LBD包括4个α螺旋（LBDα1-α4）和5个β折叠片层（LBDβ1-β5），是与配体结合的核心部位。连接TM4和LBDα1的连接子由一个连接螺旋和一个连接环组成，在二聚体中，两个连接子形成右旋交叉，使同一STING分子的TM和LBD分布在二聚体的对侧。TM2和TM3之间的连接桥、连接螺旋和LBD共同形成胞质和跨膜结构域之间的表面沟槽，TM1之前的N末端段位于这个沟槽中，这种域间相互作用是STING蛋白结构的一种保守特征，对维持蛋白质的稳定性和功能完整性至关重要。CTT与STING的胞质部分紧密结合，其中包含结合TANK结合激酶1（TANKBindingKinase1，TBK1）的基序（TBK1-BindingMotif，TBM）和结合干扰素调节因子3（InterferonRegulatoryFactor3，IRF3）的基序，在STING信号传导过程中，CTT通过与TBK1和IRF3的相互作用，激活下游信号通路，诱导Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子的表达。当STING被激活时，其结构会发生显著的动态变化。以cGAS合成的2',3'-环磷酸鸟苷-腺苷（2',3'-cyclicGMP-AMP，2',3'-cGAMP）与STING的结合过程为例，2',3'-cGAMP结合到STING的LBD后，会诱导LBD向配体结合口袋内旋，使其构象从“V形”转变为“U形”。在结合口袋上方，四个β折叠片层反向平行形成“盖子”结构，STING由“开放”构象转变为“闭合”构象。这种构象变化进一步引发了包括连接子、LBD和CTT在内的STING胞质部分相对于TM旋转180°，使连接子的右旋交叉被解开，同一STING亚基的LBD回到TM同侧，形成肩并肩的STING二聚体。2',3'-cGAMP与LBD的结合还导致LBDα2和LBDα3向下倾斜，使得STING二聚体间连接LBDα2和LBDα3的环（LBDα2-α3loop）相互远离，不再冲突。与此同时，2',3'-cGAMP的结合会触发CTT的释放，暴露STING聚合界面，使得STING以二聚体为单位平行排布式地组装成聚合体。STING聚合体的形成是激活下游信号通路的关键步骤，它能够招募下游的TBK1和IRF3，进而启动干扰素免疫应答。STING蛋白的结构与功能之间存在着紧密的联系。N末端的跨膜结构域确保了STING在细胞内膜系统上的正确定位，为其接收和传递信号提供了空间基础。C末端的LBD负责识别和结合配体，其结构的动态变化是STING激活的起始事件。而CTT则通过与下游信号分子的相互作用，将STING的激活信号传递给下游信号通路，引发免疫反应。深入了解STING蛋白的结构特点及其与功能的关系，为基于结构的药物设计提供了坚实的理论基础，有助于我们开发出更加高效、特异性的靶向STING小分子抑制剂。2.2.2分子对接与虚拟筛选分子对接和虚拟筛选是基于结构的药物设计中至关重要的技术手段，它们借助计算机模拟技术，能够在庞大的化合物库中高效地筛选出与STING蛋白具有潜在高亲和力的小分子化合物，为靶向STING小分子抑制剂的发现提供了重要的研究策略。分子对接的核心原理是通过模拟小分子（如药物分子）与蛋白质靶点（在本研究中为STING蛋白）的结合方式，预测小分子在蛋白质活性位点或别构位点的结合位点和结合模式。其基本假设是小分子与蛋白质之间的相互作用是通过能量匹配和空间匹配实现的。在分子对接过程中，首先需要对受体蛋白（STING蛋白）和小分子配体进行预处理。对于STING蛋白，要去除水分子、辅助结晶分子等非关键成分，进行结构松弛和质子化等操作，以使其结构处于更接近生理状态。对于小分子配体，需去除盐离子、生成同分异构/立体异构体并进行质子化等处理。接着，在受体分子上指定配体结合位点，这个位点通常是根据STING蛋白的结构和功能研究确定的，如与内源性配体2',3'-cGAMP结合的活性口袋。然后，利用分子对接软件（如AutoDock、FlexX、GOLD等），采用特定的算法（如模拟退火算法、遗传算法等）来搜索小分子在结合位点的最佳结合姿势。这些算法通过不断调整小分子的位置、取向和构象，计算小分子与受体蛋白之间的相互作用能，包括范德华相互作用能、静电作用能和氢键相互作用能等，以寻找能量最低、结合最稳定的结合模式。在计算相互作用能时，不同的分子对接软件采用不同的打分函数来评价小分子与受体蛋白的结合能力。打分函数是一种基于经验或理论的数学模型，它综合考虑了小分子与受体蛋白之间的各种相互作用因素，将其转化为一个数值，即打分值。打分值越高，表示小分子与受体蛋白的结合能力越强。然而，需要注意的是，现有的打分函数大多存在一定的局限性，其计算结果并不能完全准确地反映小分子与受体蛋白的真实结合亲和力。因此，分子对接的结果通常只是作为初步筛选的依据，还需要结合其他实验和分析方法进行进一步的验证和优化。虚拟筛选则是利用分子对接技术，从大规模的化合物库中筛选出可能与STING蛋白具有良好结合能力的小分子化合物的过程。化合物库可以来源于多种途径，包括免费的数据库（如Zinc、PubChem、ChEMBL、DrugBank、ChemDB等）和商业数据库（如陶术、百灵威等）。在进行虚拟筛选时，将化合物库中的小分子逐一与STING蛋白进行分子对接，根据对接打分值对小分子进行排序，筛选出打分值较高的小分子作为潜在的活性化合物。由于虚拟筛选能够在短时间内对大量小分子进行筛选，大大提高了筛选效率，减少了实验成本和时间。但由于打分函数的不精确性，虚拟筛选可能会产生一定数量的假阳性和假阴性结果。为了提高筛选的准确性和可靠性，通常会采取一些后续的处理步骤。可以对筛选出的小分子进行MM/GBSA（MolecularMechanics/GeneralizedBornSurfaceArea）计算，进一步精确计算小分子与STING蛋白的结合自由能，以更准确地评估小分子与受体蛋白的结合亲和力。还可以进行去重处理和聚类分析，去除结构相似的小分子，保留具有代表性的化合物，以减少后续实验的工作量。最终，结合经验判断和文献调研，挑选出具有合理结合姿势和丰富相互作用的小分子进行实验验证。分子对接与虚拟筛选技术在靶向STING小分子抑制剂的发现中具有重要的应用价值。通过这一技术，能够从海量的化合物中快速筛选出具有潜在活性的小分子，为后续的实验研究提供了重要的先导化合物，加速了靶向STING小分子抑制剂的研发进程。2.2.3案例研究以H-151等小分子抑制剂的发现为案例，深入探讨基于结构设计的小分子抑制剂的研究过程，能够更直观地展示基于结构的药物设计策略在靶向STING小分子抑制剂研发中的应用和成效。H-151是一种备受关注的靶向STING的共价小分子抑制剂，其发现过程充分体现了基于结构设计的精妙之处。前期研究发现，化合物C-176和C-178能够与STING蛋白中的Cys91发生共价结合，阻断STING活化所诱导的棕榈酰化，进而阻断其在高尔基体组装成多聚体复合物，有效抑制下游信号通路传导。在细胞实验中，C-176和C-178能够显著抑制由STING介导的β干扰素（IFNβ）生成，抑制小鼠骨髓源巨噬细胞中STING的响应，以及抑制下游激酶TBK1的磷酸化。在多器官炎症的Trex1-/-基因缺陷鼠模型中，C-176能够显著降低血清中炎症因子IFN的浓度，降低炎症相关基因mRNA的表达水平，改善组织中的炎症现象，展现出良好的体内抗炎效果。然而，C-176和C178只对小鼠STING有良好活性，对人STING的活性较差。为了解决这一问题，研究人员基于STING蛋白的结构进行了深入分析。他们发现STING蛋白中棕榈酸修饰的半胱氨酸是保守氨基酸残基，并且对于人STING的功能同样重要。于是，研究人员保留了与Cys91的共价结合位点，通过对C-176和C-178的结构进行优化，获得了化合物H-151。H-151的作用机制与C-176和C178类似，它能够与STING蛋白中的Cys91发生共价结合，阻断棕榈酰化诱导的STING聚集。在抑制I型IFN反应、降低TBK1磷酸化和抑制人STING棕榈酰化等方面，H-151表现出了对人STING蛋白的有效抑制作用。这一案例表明，基于对STING蛋白结构的深入理解，通过合理的结构优化，可以成功地改善小分子抑制剂的活性和特异性，为治疗人类相关疾病提供更具潜力的候选药物。再如，在研究小分子与STING蛋白的结合模式时，分子对接技术发挥了关键作用。以某一虚拟筛选得到的小分子为例，通过分子对接模拟发现，该小分子能够与STING蛋白的活性口袋紧密结合。具体来说，小分子中的某些官能团与STING蛋白活性口袋内的氨基酸残基形成了丰富的相互作用。其中，小分子的一个羟基与STING蛋白中的一个精氨酸残基形成了氢键相互作用，这种氢键作用增强了小分子与STING蛋白的结合稳定性。小分子的一个芳香环与STING蛋白活性口袋内的一个苯丙氨酸残基发生了π-π堆积相互作用，进一步巩固了两者之间的结合。这些相互作用模式的揭示，为后续对该小分子的结构优化提供了重要的依据。研究人员可以根据这些相互作用信息，有针对性地对小分子的结构进行修饰，以增强其与STING蛋白的结合亲和力和抑制活性。通过增加一个与STING蛋白其他氨基酸残基形成氢键的基团，或者调整芳香环的位置和取向，以更好地与STING蛋白活性口袋内的氨基酸残基相互作用。这些案例充分展示了基于结构的药物设计在靶向STING小分子抑制剂发现中的重要性和有效性。通过对STING蛋白结构的深入解析，结合分子对接和虚拟筛选技术，能够发现具有潜在活性的小分子，并通过结构优化进一步提高其性能。这种策略为靶向STING小分子抑制剂的研发提供了一种高效、精准的方法，有助于推动相关疾病治疗药物的开发。2.3天然产物来源的抑制剂2.3.1天然产物筛选策略从天然产物中筛选靶向STING小分子抑制剂，是一种极具潜力的研究策略，为药物研发提供了丰富的资源和多样化的结构骨架。天然产物来源广泛，包括植物提取物、微生物代谢产物等，它们蕴含着复杂多样的化学结构和生物活性，为发现新型抑制剂提供了广阔的空间。植物提取物是天然产物的重要来源之一，其筛选策略通常包括以下几个关键步骤。首先是植物的选择，依据传统药用知识、植物化学分类学以及相关文献报道，挑选具有潜在免疫调节活性的植物种类。许多传统中药在调节免疫系统方面有着悠久的应用历史，通过对这些中药的研究，有可能发现靶向STING的活性成分。接着是提取物的制备，采用合适的提取方法，如溶剂提取法（包括水提法、醇提法等）、超临界流体萃取法等，将植物中的化学成分提取出来。这些提取物通常是复杂的混合物，包含多种化学成分，需要进一步进行分离和纯化。分离技术可以采用柱色谱（如硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等）、高效液相色谱（HPLC）等方法，将提取物中的化学成分逐一分离出来。纯化后的化合物可以通过核磁共振（NMR）、质谱（MS）等技术进行结构鉴定，确定其化学结构。然后是活性筛选，将分离得到的化合物作用于STING相关的细胞模型或分子模型，通过检测STING信号通路的关键指标，如细胞因子的分泌、信号分子的磷酸化水平等，筛选出具有抑制STING活性的化合物。在细胞模型中，可以使用表达STING的细胞系，如HEK293T-STING细胞，将化合物加入细胞培养液中，培养一定时间后，收集细胞培养上清，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子的分泌水平，如IFN-β、TNF-α等；收集细胞裂解液，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测STING蛋白及其下游关键信号分子的磷酸化水平，如TBK1、IRF3等。对于活性较好的化合物，还需要进一步进行构效关系研究，通过对化合物结构的修饰和改造，探究结构与活性之间的关系，为优化化合物的活性和选择性提供依据。微生物代谢产物同样是筛选靶向STING小分子抑制剂的重要资源，其筛选流程也有独特之处。首先是微生物的分离和培养，从土壤、海洋、动植物体表等环境中采集样品，通过特定的培养基和培养条件，分离出不同种类的微生物，包括细菌、真菌、放线菌等。不同的微生物具有不同的代谢途径和产物，因此需要广泛采集样品，以获取丰富的微生物资源。在培养过程中，需要优化培养条件，如温度、pH值、营养成分等，以促进微生物的生长和代谢产物的合成。接着是代谢产物的提取和分离，微生物代谢产物通常分为胞内产物和胞外产物，对于胞内产物，需要破碎微生物细胞，采用合适的溶剂提取；对于胞外产物，可以直接从培养液中提取。提取后的产物同样需要进行分离和纯化，常用的方法包括溶剂萃取、色谱分离等。然后是活性筛选，与植物提取物的筛选类似，将分离得到的微生物代谢产物作用于STING相关的模型，检测其对STING信号通路的抑制活性。对于具有活性的代谢产物，还需要进行深入的研究，确定其作用机制、作用靶点以及与STING蛋白的相互作用方式。可以采用分子生物学技术，如基因敲除、RNA干扰等，研究代谢产物对STING信号通路中关键基因和蛋白的影响；采用生物物理技术，如表面等离子共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）等，研究代谢产物与STING蛋白的结合亲和力和结合模式。2.3.2成功案例剖析北京大学雷晓光教授团队与首都医科大学附属北京儿童医院毛华伟教授团队合作发现的天然产物Anhydrotuberosin（ATS），是从天然产物中筛选靶向STING小分子抑制剂的一个成功案例。研究团队利用高通量筛选技术，构建了一套可实现高通量测试的双荧光素酶筛选体系。将IFN-β的启动子元件克隆到萤火虫荧光素酶的上游，同时利用海肾荧光素酶作为内参，从近7000个单体化合物中进行筛选。最终鉴定到来源于葛根的天然产物ATS具有强效的STING抑制活性。之后在蛋白水平证实ATS和STING具有直接的相互作用，并能够在HeLa、THP-1及SAVI病人来源的PBMC等多种细胞中显著性抑制STING激活后的下游信号。通过协同分子对接、关键氨基酸突变及ATS衍生的集成研究手段，初步解析了ATS和STING蛋白的结合模式。在小鼠体内，ATS具有良好的药代动力学参数，并在与STING过度激活相关的Trex1敲除的自身免疫炎症疾病小鼠、葡聚糖硫酸钠诱导的炎症性肠病小鼠模型中，证实ATS能够通过抑制STING缓解自身免疫疾病。ATS的作用机制主要是通过与STING蛋白直接结合，阻断STING信号通路的激活。分子对接研究表明，ATS能够特异性地结合到STING蛋白的配体结合口袋内，与内源性配体2',3'-cGAMP竞争结合位点，从而阻止STING的激活。关键氨基酸突变实验进一步证实了ATS与STING蛋白结合位点的重要性，当突变STING蛋白中与ATS结合的关键氨基酸时，ATS对STING信号通路的抑制作用显著减弱。在细胞实验中，ATS能够显著抑制STING激活后下游信号分子的磷酸化，如TBK1和IRF3的磷酸化水平明显降低，从而减少了IFN-β和其他促炎性细胞因子的分泌。在动物模型中，ATS能够有效改善STING过度激活导致的自身免疫炎症症状，降低炎症相关基因的表达水平，减轻组织损伤。ATS的发现不仅为治疗STING相关的自身免疫性疾病提供了新的潜在药物候选物，也为从天然产物中筛选靶向STING小分子抑制剂提供了成功的范例。它展示了高通量筛选技术在天然产物研究中的强大作用，以及多学科交叉研究在解析天然产物作用机制方面的重要性。通过对ATS的深入研究，我们可以进一步优化其结构，提高其活性和选择性，为开发更有效的STING抑制剂奠定基础。三、靶向STING小分子抑制剂的作用机制3.1对STING信号通路的阻断作用3.1.1STING信号通路概述cGAS-STING信号通路在机体的免疫防御和疾病发生发展过程中扮演着核心角色，犹如免疫系统中的关键枢纽，精准地调控着免疫应答的启动与强度。当细胞受到病原体入侵、DNA损伤或线粒体DNA泄漏等刺激时，细胞质中的环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）作为敏锐的“DNA感受器”，能够迅速识别这些异常的双链DNA。cGAS属于结构上保守的cGAS/DncV样核苷酸转移酶（CD-NTase）超家族，其催化结构域包括NTase核心和Mab21结构域，采用双叶状结构，两个叶状结构之间的深槽边缘是催化位点。cGAS通过其带正电的表面以序列无关的方式与dsDNA相互作用，这种结合会引发cGAS的显著结构切换，使其催化口重新排列，进而启动以三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸鸟苷（GTP）为前体的催化反应。在这一过程中，ATP首先移动到GTP的2′-OH位置，生成线性异二核苷酸磷酸pppG（2′–5′）pA，接着cGAS将GTP转移到腺苷酸磷酸的3′-OH，最终生成第二信使环磷酸鸟苷-磷酸腺苷（cGAMP）。cGAMP的生成是cGAS-STING信号通路激活的关键步骤，它作为一种强效的信号分子，能够将DNA异常的信息传递给下游的STING蛋白。干扰素基因刺激因子（STING）是该信号通路的核心适配蛋白，定位于内质网，是一种多结构域的跨膜蛋白。STING由一个包含四个跨膜螺旋（TM1-4）的N末端部分锚定在ER膜上，其C末端结构（CTD）包括一个配体结合结构域（LBD）和一个C末端尾巴（CTT），两者都面向细胞质。在无配体状态下，STING以二聚体形式存在，通过组织八个跨膜螺旋和两个CTD采用领域交换的架构。当cGAMP结合到STING的LBD时，会诱导STING发生显著的构象变化。LBD向配体结合口袋内旋，使其构象从“V形”转变为“U形”，在结合口袋上方，四个β折叠片层反向平行形成“盖子”结构，STING由“开放”构象转变为“闭合”构象。这种构象变化进一步引发了包括连接子、LBD和CTT在内的STING胞质部分相对于TM旋转180°，使连接子的右旋交叉被解开，同一STING亚基的LBD回到TM同侧，形成肩并肩的STING二聚体。cGAMP的结合还会触发CTT的释放，暴露STING聚合界面，使得STING以二聚体为单位平行排布式地组装成聚合体。STING聚合体形成后，会招募TANK结合激酶1（TBK1）。TBK1与STING的CTT结合，并磷酸化STING本身和转录因子干扰素调节因子3（IRF3）。磷酸化的IRF3发生二聚化，并进入细胞核，与特定的DNA序列结合，启动Ⅰ型干扰素（IFN）基因的转录。新表达的Ⅰ型干扰素通过与异二聚体受体IFNAR1/2结合，以自分泌和旁分泌方式发挥作用，激活Janus激酶1（JAK1）和酪氨酸激酶2（TYK2），导致信号转导子和转录激活子1（STAT1）和STAT2的磷酸化。STAT1/2异二聚体与IRF9结合，随后易位至细胞核，触发IFN刺激基因（ISG）的转录。STING还能募集IκB激酶（IKK），其磷酸化核因子-κB（NF-κB）抑制剂IκBα，导致NF-κB易位至细胞核，随后表达促炎细胞因子（如IL-6、TNF等）。通过这一系列复杂而有序的信号传导过程，cGAS-STING信号通路能够迅速激活机体的免疫反应，抵御病原体的入侵，同时也在肿瘤免疫监视、自身免疫性疾病等多种生理病理过程中发挥着关键作用。3.1.2抑制剂的阻断机制靶向STING小分子抑制剂通过多种机制阻断STING信号通路，为治疗相关疾病提供了重要的干预手段。以C-176、C-178、H-151等共价抑制剂为例，它们展现出独特的作用机制。C-176和C-178能够与STING蛋白中的Cys91发生共价结合，这一结合事件如同在信号传导链条上设置了障碍，阻断了STING活化所诱导的棕榈酰化。在正常情况下，STING的Cys91位点会发生棕榈酰化修饰，这对于STING在高尔基体组装成多聚体复合物至关重要。棕榈酰化修饰能够促进STING的聚集和信号体的组装，从而激活下游信号通路。而C-176和C-178与Cys91共价结合后，Cys91不再接受十六烷酰化，使得棕榈酰化诱导的STING聚集被阻断。STING无法在高尔基体组装成多聚体复合物，下游信号通路的传导也因此被有效抑制。在细胞实验中，C-176和C-178能够显著抑制由STING介导的β干扰素（IFNβ）生成，抑制小鼠骨髓源巨噬细胞中STING的响应，以及抑制下游激酶TBK1的磷酸化。在多器官炎症的Trex1-/-基因缺陷鼠模型中，C-176能够显著降低血清中炎症因子IFN的浓度，降低炎症相关基因mRNA的表达水平，改善组织中的炎症现象，充分展示了其对STING信号通路的抑制效果。化合物H-151同样作用于STING蛋白的Cys91位点，其作用机制与C-176和C178类似。鉴于STING蛋白中棕榈酸修饰的半胱氨酸是保守氨基酸残基，并且对于人STING的功能同样重要，研究人员在对C-176和C-178进行结构优化时，保留了与Cys91的共价结合位点，从而获得了化合物H-151。H-151能够有效地抑制人STING蛋白，它可以抑制I型IFN反应，降低TBK1磷酸化和抑制人STING棕榈酰化。在相关细胞实验中，H-151表现出对人STING信号通路的显著抑制作用，为治疗人类相关疾病提供了更具潜力的候选药物。小分子SN-011及其同一骨架的小分子衍生物作为非共价抑制剂，其阻断机制与共价抑制剂有所不同。SN-011能特异性结合在STING蛋白与其内源性配体分子2’3’-cGAMP结合的口袋内，与环状二核苷酸（CDN）竞争STING二聚体的结合口袋。这种竞争结合的方式就像在STING的“信号入口”设置了竞争分子，使得内源性配体无法正常结合STING，从而阻断CDN结合和STING激活。在过表达STING相关突变体的细胞内，SN-011能显著抑制下游过度激活的免疫和炎症细胞因子。在Aicardi-Goutièressyndrome的小鼠疾病模型（Trex1-/-）中，SN-011能显著改善小鼠多组织器官的免疫损伤，且延长疾病小鼠的生存时间，显示出其在治疗STING相关自身免疫性疾病方面的潜力。3.2与STING蛋白的相互作用方式3.2.1共价结合机制共价结合是靶向STING小分子抑制剂发挥作用的重要机制之一，以C-176、C-178和H-151为代表的共价抑制剂，通过与STING蛋白中的特定氨基酸残基形成共价键，实现对STING信号通路的有效抑制。C-176和C-178在抑制STING信号通路中展现出独特的共价结合机制。研究表明，这两种化合物能够与STING蛋白中的Cys91发生共价结合。在正常生理状态下，STING的激活涉及一系列复杂的分子事件，其中棕榈酰化修饰起着关键作用。STING的Cys91位点会发生棕榈酰化，这一修饰过程对于STING在高尔基体组装成多聚体复合物至关重要。棕榈酰化修饰能够促进STING的聚集，使其形成具有活性的多聚体结构，进而招募下游信号分子，激活STING信号通路。当C-176和C-178与Cys91共价结合后，如同在STING的激活链条上设置了障碍，Cys91无法再接受十六烷酰化修饰。这种修饰的缺失导致棕榈酰化诱导的STING聚集被阻断，STING无法在高尔基体组装成多聚体复合物。下游信号通路的传导也因此被有效抑制。在细胞实验中，C-176和C-178能够显著抑制由STING介导的β干扰素（IFNβ）生成。IFNβ作为STING信号通路激活后的重要细胞因子，其生成量的显著减少表明STING信号通路受到了强烈抑制。这两种化合物还能抑制小鼠骨髓源巨噬细胞中STING的响应，以及抑制下游激酶TBK1的磷酸化。TBK1的磷酸化是STING信号通路传导的关键步骤之一，其磷酸化水平的降低进一步证实了C-176和C-178对STING信号通路的抑制作用。在多器官炎症的Trex1-/-基因缺陷鼠模型中，C-176能够显著降低血清中炎症因子IFN的浓度。血清中IFN浓度的降低表明炎症反应得到了有效控制，C-176能够减轻炎症相关基因mRNA的表达水平，改善组织中的炎症现象。这一系列实验结果充分展示了C-176和C-178通过与Cys91共价结合，阻断STING活化所诱导的棕榈酰化，进而抑制下游信号通路传导的作用机制。化合物H-151同样基于共价结合机制发挥作用。鉴于STING蛋白中棕榈酸修饰的半胱氨酸是保守氨基酸残基，并且对于人STING的功能同样重要。研究人员在对C-176和C-178进行结构优化时，保留了与Cys91的共价结合位点，从而获得了化合物H-151。H-151的作用机制与C-176和C178类似，它能够与STING蛋白中的Cys91发生共价结合，阻断棕榈酰化诱导的STING聚集。在抑制I型IFN反应、降低TBK1磷酸化和抑制人STING棕榈酰化等方面，H-151表现出了对人STING蛋白的有效抑制作用。在相关细胞实验中，H-151能够显著抑制人STING激活后下游信号分子的磷酸化，减少I型IFN的分泌，从而有效抑制人STING信号通路。这使得H-151成为治疗人类相关疾病的更具潜力的候选药物。共价结合机制使得这些小分子抑制剂能够与STING蛋白形成稳定的相互作用，从而高效地抑制STING信号通路的激活。这种作用方式为治疗STING信号通路异常激活相关的疾病提供了重要的干预策略。然而，共价结合也可能带来一些潜在的问题，如可能影响STING蛋白的正常生理功能，或者导致药物的不可逆结合，从而引发一些不良反应。因此，在开发基于共价结合机制的小分子抑制剂时，需要充分考虑这些因素，通过合理的结构设计和优化，提高抑制剂的选择性和安全性。3.2.2非共价结合模式除了共价结合机制，小分子抑制剂还可以通过非共价结合模式与STING蛋白相互作用，从而抑制STING信号通路的激活。小分子SN-011及其同一骨架的小分子衍生物就是这类非共价抑制剂的典型代表，它们通过与STING蛋白的特定区域非共价结合，展现出独特的抑制作用。SN-011能特异性结合在STING蛋白与其内源性配体分子2’3’-cGAMP结合的口袋内。2’3’-cGAMP作为STING的内源性配体，在STING信号通路的激活中起着关键作用。当2’3’-cGAMP结合到STING的配体结合口袋时，会诱导STING发生构象变化，进而激活STING信号通路。而SN-011的出现，如同在这个关键的结合位点设置了“竞争者”，它与环状二核苷酸（CDN）竞争STING二聚体的结合口袋。这种竞争结合的方式使得内源性配体2’3’-cGAMP无法正常结合到STING上，从而阻断了CDN结合和STING激活。在过表达STING相关突变体的细胞内，SN-011能显著抑制下游过度激活的免疫和炎症细胞因子。这表明SN-011能够有效地抑制异常激活的STING信号通路，减少炎症反应。在Aicardi-Goutièressyndrome的小鼠疾病模型（Trex1-/-）中，SN-011能显著改善小鼠多组织器官的免疫损伤。通过抑制STING信号通路，SN-011降低了炎症相关基因的表达水平，减轻了组织炎症，进而延长了疾病小鼠的生存时间。从分子层面来看，SN-011与STING蛋白的非共价结合主要依赖于多种弱相互作用。包括氢键、范德华力、π-π堆积等。这些弱相互作用虽然单个作用强度较弱，但它们的协同作用使得SN-011能够稳定地结合在STING蛋白的配体结合口袋内。小分子中的某些官能团可能与STING蛋白口袋内的氨基酸残基形成氢键，增加了结合的稳定性。小分子的芳香环结构可能与STING蛋白中的芳香族氨基酸残基发生π-π堆积，进一步巩固了两者之间的结合。与共价结合的小分子抑制剂相比，非共价结合的小分子抑制剂具有一些独特的优势。非共价结合是可逆的，这意味着抑制剂与STING蛋白的结合可以根据细胞内的生理状态和药物浓度进行动态调节。这种可逆性使得抑制剂在发挥抑制作用的，能够减少对STING蛋白正常生理功能的长期影响，降低潜在的不良反应风险。非共价结合的小分子抑制剂在药物研发过程中更容易进行结构优化和修饰。通过改变小分子的结构，可以灵活地调整其与STING蛋白的结合亲和力和选择性，从而提高药物的疗效和安全性。非共价结合模式为靶向STING小分子抑制剂的开发提供了另一种重要的策略。这种结合方式不仅丰富了我们对STING信号通路抑制机制的理解，也为治疗STING相关的自身免疫性疾病和炎症性疾病提供了更多的选择。在未来的研究中，进一步深入研究非共价结合的小分子抑制剂与STING蛋白的相互作用机制，以及开发更加高效、特异性的非共价抑制剂，将具有重要的理论意义和临床应用价值。3.3对相关疾病模型的作用机制验证3.3.1自身免疫疾病模型在自身免疫疾病领域，SAVI（婴儿期发作的STING相关血管病）和Aicardi-Goutières综合征小鼠模型为验证靶向STING小分子抑制剂的作用机制提供了重要的研究平台。SAVI是一种由于STING基因功能获得性突变导致的罕见自身免疫性疾病，患者体内STING信号通路异常激活，引发严重的炎症反应。在SAVI小鼠模型中，通过给予靶向STING小分子抑制剂进行干预，能够观察到一系列显著的变化。抑制剂能够特异性地与STING蛋白结合，阻断其异常激活的信号传导。在细胞水平上，STING激活后下游信号分子的磷酸化水平明显降低，如TBK1和IRF3的磷酸化受到抑制。这表明抑制剂有效地阻断了STING信号通路的传导，减少了炎症相关细胞因子的产生。在组织水平上，小鼠体内的炎症症状得到明显改善，血管病变减轻，组织损伤修复。通过对小鼠血清中炎症因子的检测发现，IFN-β、TNF-α等炎症因子的浓度显著下降，说明抑制剂能够抑制炎症反应，缓解SAVI小鼠的病情。Aicardi-Goutières综合征同样是一种与STING信号通路异常激活相关的自身免疫性疾病，主要由核酸酶缺陷导致细胞内DNA积累，从而过度激活cGAS-STING信号通路。在Aicardi-Goutières综合征小鼠模型（如Trex1-/-小鼠）中，小分子抑制剂展现出独特的治疗效果。以小分子SN-011为例，它能特异性结合在STING蛋白与其内源性配体分子2’3’-cGAMP结合的口袋内，与环状二核苷酸（CDN）竞争STING二聚体的结合口袋，从而阻断CDN结合和STING激活。在该小鼠模型中，给予SN-011处理后，小鼠多组织器官的免疫损伤得到显著改善。通过对小鼠组织切片的分析发现，炎症细胞浸润减少，组织炎症程度降低。对小鼠生存时间的观察显示，SN-011能够延长疾病小鼠的生存时间，表明其对Aicardi-Goutières综合征具有潜在的治疗作用。这些研究结果表明，靶向STING小分子抑制剂在自身免疫疾病模型中能够通过阻断STING信号通路，有效地抑制炎症反应，减轻组织损伤，为治疗自身免疫性疾病提供了重要的理论依据和潜在的治疗策略。在未来的研究中，可以进一步优化抑制剂的结构和性能，提高其治疗效果和安全性，为自身免疫性疾病患者带来更多的希望。3.3.2神经退行性疾病模型在神经退行性疾病领域，阿尔茨海默病（AD）小鼠模型为深入探究小分子抑制剂对cGAS-STING通路及疾病进程的影响提供了重要的研究工具。AD是一种常见的神经退行性疾病，其主要病理特征包括大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）的沉积、神经原纤维缠结的形成以及神经元的进行性死亡。近年来的研究表明，cGAS-STING信号通路的异常激活在AD的发病机制中扮演着重要角色。在AD小鼠模型中，随着疾病的进展，大脑中会出现线粒体功能障碍，导致线粒体DNA（mtDNA）泄漏到细胞质中。这些泄漏的mtDNA被cGAS识别，从而激活cGAS-STING信号通路。激活后的STING招募TBK1，使IRF3磷酸化并进入细胞核，诱导Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子的表达。这些炎症因子的释放引发神经炎症，进一步损伤神经元，加速AD的病程。当给予靶向STING小分子抑制剂处理AD小鼠时，能够观察到明显的治疗效果。以小分子抑制剂H-151为例，它可以与STING蛋白中的Cys91发生共价结合，阻断棕榈酰化诱导的STING聚集，从而抑制STING信号通路的激活。在AD小鼠模型中，给予H-151处理后，大脑中cGAS-STING通路的激活被显著抑制。通过蛋白质免疫印迹（Westernblot）检测发现，STING蛋白的磷酸化水平降低，TBK1和IRF3的磷酸化也受到抑制，表明STING信号通路的传导被有效阻断。炎症相关细胞因子如IFN-β、TNF-α的表达水平明显下降，神经炎症得到缓解。从行为学角度观察，AD小鼠的认知功能得到改善。在Morris水迷宫实验中，接受H-151处理的AD小鼠在寻找平台的潜伏期明显缩短，穿越平台的次数增加，表明其空间学习和记忆能力得到提升。在新物体识别实验中，处理组小鼠对新物体的探索时间显著增加，说明其认知能力有所恢复。在大脑病理变化方面，H-151处理后的AD小鼠大脑中Aβ的沉积减少。通过免疫组织化学染色和ThioflavinS染色观察发现，Aβ斑块的数量和面积均有所降低。这可能是因为抑制STING信号通路后，减轻了神经炎症，减少了炎症因子对Aβ代谢的影响，从而降低了Aβ的沉积。神经元的损伤也得到一定程度的缓解，神经元的存活率增加，树突和轴突的损伤减轻。靶向STING小分子抑制剂在AD小鼠模型中能够通过抑制cGAS-STING通路，减轻神经炎症，改善认知功能，减少Aβ沉积，为治疗阿尔茨海默病提供了新的治疗策略和潜在的药物研发方向。在未来的研究中，可以进一步深入探究小分子抑制剂的作用机制，优化其结构和性能，提高其治疗效果和安全性，为AD患者带来新的希望。四、靶向STING小分子抑制剂的生物活性评价方法4.1细胞水平的活性评价4.1.1细胞模型的选择在靶向STING小分子抑制剂的生物活性评价中，细胞模型的选择至关重要，不同的细胞模型具有各自的特点和优势，能够从不同角度为研究提供关键信息。小鼠骨髓源巨噬细胞（BoneMarrow-DerivedMacrophages，BMDMs）是一种常用的原代细胞模型。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，在先天性免疫和适应性免疫中发挥着关键作用。BMDMs可以从小鼠骨髓中分离培养获得，其具有高度的免疫活性，能够表达丰富的模式识别受体，包括STING。在受到病原体感染或其他刺激时，BMDMs中的STING能够被激活，进而启动免疫反应。与其他细胞系相比，BMDMs保留了巨噬细胞的天然特性，更能真实地反映STING在体内的生理功能和信号传导过程。在研究小分子抑制剂对STING信号通路的影响时，使用BMDMs可以观察到抑制剂对巨噬细胞免疫功能的直接作用，如对细胞因子分泌、吞噬作用等的影响。在检测小分子抑制剂对STING介导的IFNβ生成的抑制作用时，BMDMs能够产生较为明显的IFNβ反应，便于检测和分析。但BMDMs的获取过程相对复杂，需要进行小鼠骨髓的分离和培养，且细胞的纯度和活性受多种因素影响，培养条件要求较高。过表达STING突变体的细胞系也是常用的细胞模型之一。例如，通过基因工程技术将STING的突变体转染到HEK293T细胞中，构建过表达STING突变体的HEK293T细胞系。STING的某些突变体能够导致STING信号通路的异常激活，如在婴儿期发作的STING相关血管病（SAVI）中，STING基因的功能获得性突变会使STING持续激活，引发严重的炎症反应。使用过表达这些突变体的细胞系，可以模拟疾病状态下STING信号通路的异常激活，研究小分子抑制剂对异常激活的STING信号通路的抑制作用。这种细胞模型的优势在于能够特异性地研究STING突变体相关的信号通路，且细胞系易于培养和操作，实验重复性好。通过调整转染的STING突变体的类型和表达水平，可以灵活地控制STING信号通路的激活程度，便于研究抑制剂的剂量效应关系。但该细胞系是经过人工改造的，与体内真实的细胞环境存在一定差异，可能会影响研究结果的外推性。除了上述两种细胞模型，还有其他一些细胞模型也在靶向STING小分子抑制剂的研究中得到应用。THP-1细胞是一种人单核细胞白血病细胞系，在体外可以通过诱导分化为巨噬细胞样细胞。THP-1细胞表达STING，且在受到刺激时能够激活STING信号通路，产生细胞因子。它具有来源方便、易于培养和传代的优点，适合进行大规模的细胞实验。RAW264.7细胞是一种小鼠巨噬细胞系，同样能够表达STING并对刺激产生免疫反应。该细胞系生长迅速，实验操作相对简单，常用于初步筛选和验证小分子抑制剂的活性。在实际研究中，通常会根据研究目的和需求选择合适的细胞模型。对于研究小分子抑制剂对STING信号通路的基本作用机制，多种细胞模型可以相互验证，提高研究结果的可靠性。在研究抑制剂对STING激活后下游细胞因子分泌的影响时，可以同时使用BMDMs、THP-1细胞和RAW264.7细胞进行实验，对比不同细胞模型的结果，以全面了解抑制剂的作用效果。对于研究特定疾病相关的STING信号通路异常激活，如SAVI等，过表达STING突变体的细胞系则是更为合适的选择。4.1.2检测指标与方法在细胞水平对靶向STING小分子抑制剂的生物活性进行评价时，需要选择一系列关键的检测指标，并运用相应的实验方法进行准确测定，这些指标和方法能够全面、深入地反映小分子抑制剂对STING信号通路的影响。IFNβ生成的检测是评估小分子抑制剂活性的重要指标之一。IFNβ是STING信号通路激活后的关键效应分子，其生成量的变化能够直接反映STING信号通路的激活或抑制状态。常用的检测方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。ELISA是基于抗原抗体特异性结合的原理，将IFNβ抗体包被在酶标板上，加入细胞培养上清样品后，其中的IFNβ会与抗体结合。再加入酶标记的二抗，形成抗体-抗原-酶标二抗复合物。加入底物后，酶催化底物发生显色反应，通过酶标仪检测吸光度值，根据标准曲线即可计算出样品中IFNβ的浓度。ELISA具有特异性强、灵敏度高、操作简便、可同时检测多个样品等优点，能够准确地定量检测细胞培养上清中的IFNβ含量。在研究小分子抑制剂对STING信号通路的抑制作用时，将小分子抑制剂加入表达STING的细胞系中，刺激细胞激活STING信号通路，培养一定时间后收集细胞培养上清，采用ELISA检测IFNβ的生成量。若小分子抑制剂能够有效抑制STING信号通路，那么细胞培养上清中IFNβ的浓度会显著降低。TBK1磷酸化水平的检测对于探究小分子抑制剂的作用机制具有重要意义。TBK1是STING信号通路中的关键激酶，在STING激活后，TBK1会被招募并磷酸化，进而激活下游的IRF3等转录因子。蛋白质免疫印迹（Westernblot）是检测TBK1磷酸化水平的常用方法。首先，收集细胞裂解液，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液，以保证蛋白质的完整性和磷酸化状态。通过SDS凝胶电泳将细胞裂解液中的蛋白质按照分子量大小进行分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相膜（如PVDF膜或NC膜）上。用封闭液封闭膜上的非特异性结合位点，再加入特异性识别磷酸化TBK1的一抗，孵育后洗去未结合的一抗。加入带有标记（如HRP标记）的二抗，二抗与一抗结合后，通过化学发光底物显色，使用化学发光成像系统检测条带的强度。条带的强度与磷酸化TBK1的含量成正比，通过与对照组比较，可以直观地观察到小分子抑制剂对TBK1磷酸化水平的影响。若小分子抑制剂能够阻断STING信号通路，那么TBK1的磷酸化水平会明显降低。炎性细胞因子产生的检测也是评价小分子抑制剂生物活性的重要方面。除了IFNβ外，STING信号通路激活后还会诱导多种炎性细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等。这些炎性细胞因子在炎症反应中发挥着重要作用，其产生量的变化能够反映小分子抑制剂对炎症反应的抑制效果。检测炎性细胞因子的方法除了ELISA外，还可以使用流式细胞术（FCM）。FCM是一种能够对单细胞或其他生物粒子进行多参数、快速分析的技术。对于炎性细胞因子的检测，首先需要对细胞进行刺激，使其产生炎性细胞因子。然后使用细胞固定液和破膜剂处理细胞，使细胞内的炎性细胞因子暴露。加入荧光标记的特异性抗体，抗体与细胞内的炎性细胞因子结合。通过流式细胞仪检测细胞的荧光强度，根据荧光强度可以定量分析细胞内炎性细胞因子的含量。FCM的优点是可以同时检测多种炎性细胞因子，并且能够对单个细胞内的细胞因子进行分析，提供细胞群体中不同细胞亚群产生细胞因子的信息。在研究小分子抑制剂对炎性细胞因子产生的影响时，使用FCM可以更全面地了解抑制剂对不同细胞亚群炎症反应的抑制作用。4.2动物水平的活性评价4.2.1动物模型的构建在动物水平评价靶向STING小分子抑制剂的生物活性时，构建合适的动物模型是关键步骤，不同的动物模型能够模拟不同疾病状态下STING信号通路的异常激活，为研究抑制剂的体内疗效提供重要的实验基础。Trex1-/-基因缺陷鼠是一种常用的用于研究STING相关自身免疫性疾病的动物模型。Trex1基因编码一种核酸外切酶，能够降解细胞内的DNA，维持细胞内DNA的稳态。当Trex1基因缺失时，细胞内的DNA无法被正常降解，导致DNA积累，进而激活cGAS-STING信号通路，引发自身免疫炎症反应。构建Trex1-/-基因缺陷鼠通常采用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9技术。通过设计针对Trex1基因的sgRNA，将其与Cas9蛋白一起导入小鼠胚胎干细胞中，在细胞内切割Trex1基因的特定序列，引发DNA双链断裂。细胞自身的修复机制在修复断裂DNA时，会引入随机的插入或缺失突变，导致Trex1基因功能丧失。将经过基因编辑的胚胎干细胞注射到小鼠囊胚中，再将囊胚移植到代孕母鼠的子宫内，经过妊娠和分娩，即可获得Trex1-/-基因缺陷鼠。这种基因缺陷鼠表现出多器官的免疫损伤，血清中炎症因子水平升高，与人类自身免疫性疾病的症状相似。创伤性脑损伤小鼠模型则为研究靶向STING小分子抑制剂在神经炎症相关疾病中的作用提供了重要工具。创伤性脑损伤（TraumaticBrainInjury，TBI）是由于外部机械力作用导致的大脑损伤，其病理生理过程复杂，可导致脑外伤幸存者出现短暂或永久性的躯体功能障碍、认知障碍以及心理障碍。构建创伤性脑损伤小鼠模型通常采用重量落体法。具体步骤如下，选择健康的成年小鼠，常用的品系有C57BL/6或Balb/C等，根据实验需求选择性别和年龄，实验前需随机分组，包括对照组（未经处理）、假手术组（仅进行手术操作但不造成实际损伤）和多个损伤程度的实验组。使用适当的麻醉剂（如戊巴比妥、异氟醚等）对小鼠进行全身麻醉，确保在整个手术过程中动物处于无痛状态。在进行手术区域（通常是头顶）剃毛并进行严格的皮肤消毒，以减少术后感染风险。在特定位置进行开颅，暴露大脑。在已暴露的大脑表面放置一个金属砧或直接撞击，通过一定高度掉落的重物产生冲击。麻醉小鼠，备皮消毒后，头皮矢状切开，露出颅骨，在右侧头盖骨bregma和lambda之间矢状缝合线外侧2mm处钻一个直径3.5mm的开口，假手术组即可完成手术。