CN114423873B Rna测序方法 （阿尔缇玛基因组学公司）

2022.03.09PCT/US2020/0415522020.07.10WO2021/007495EN2021.01.14US10273528B1,2019.04.30US2017314067A1,2017.11.02本文描述了用于确定来自mRNA分子的目的物区域之前延伸至跨多个多核苷酸的条形码区2将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，其含有源自mRNA分子的poly-A区域的多个连续且相同的碱基的均聚物区域和包含与来自所使用与均聚物区域中存在的碱基互补的相同碱基的核苷酸在所述均聚物区域内延伸在没有检测核苷酸掺入引物的情况下重复延伸一次或多次以延伸所述引物通过所述2.根据权利要求1所述的方法，其中用于在所述均聚物区域内延伸所述引物的所述核3.根据权利要求1所述的方法，其中用于确定所述靶区域序列的所述标记核苷酸包含4.根据权利要求1所述的方法，其中用于在所述均聚物区域内延伸所述引物的所述核5.根据权利要求1所述的方法，其中用于在所述均聚物区域内延伸所述引物的所述核6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶区域的序列使用未标记核苷酸和所述标记8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的所述均聚物区域中的9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的所述均聚物区域包含来自相同多核苷酸的靶区域相关的序列。述mRNA分子的3'-非翻译区或5'-317.根据权利要求16所述的方法，其中所述靶区域的序列使用标记核苷酸和未标记核18.根据权利要求17所述的方法，其中用于在所述均聚物区域内延伸所述引物的标记核苷酸相对于总核苷酸的比例高于用于确定靶区域的序列的标记核苷酸相对于总核苷酸4[0002]本申请要求2019年7月10日提交的美国临时申请号62/872,558的优先权，为了所[0005]信使RNA(mRNA)测序可以提供有关实时基因表达、不同组织中的基因表达谱以及[0006]直接mRNA测序具有挑战性，靶向的mRNA分子通常使用逆转录酶逆转录成互补DNA[0007]某些高效测序方法利用非-终止核苷酸对核酸分子进行测序。这些测序方法可称[0009]在一些实施方案中，确定来自mRNA分子的目的区域的序列的方法包括(a)将源自含多个连续且相同的碱基的均聚物区域以及包含与来自mRNA分子的目的区域相关的序列中存在的相同碱基的互补碱基的标记核苷酸确定条形码区域的序列；(c)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的核苷酸在均聚物区域内延伸引物；和(d)使用标记核苷酸确定靶区5含多个连续且相同的碱基的均聚物区域以及包含与来自mRNA分子的目的区域相关的序列的靶区域；(b)使用标记核苷酸和未标记核苷酸以标记核苷酸相对总核苷酸的第一比例确定条形码区域的序列；(c)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的标记核苷酸以标记核苷物区域内停止；(d)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的未标记核苷酸将引物延伸至均含多个连续且相同的碱基的均聚物区域以及包含与来自mRNA分子的目的区域相关的序列物在延伸至均聚物区域之前延伸至跨多个多核苷酸的条形码区域的末端；(c)使用未标记6含与多核苷酸的均聚物区域中的碱基互补的多个连续且相同的碱基；(d)使用标记核苷酸含多个连续且相同的碱基的均聚物区域和包含与来自mRNA分子的目的区域相关的序列的于确定步骤(d)中条形码区域的序列的标记核苷酸包含非终止标记核苷酸。在一些实施方7包括使用标记核苷酸确定条形码区域的序列。[0016]在任何上述方法的一些实施方案中，多核苷酸的均聚物区域包含至少8个连续且联确定的与来自相同靶核酸分子的mRNA编码区相关的序[0020]在任何上述方法的一些实施方案中，mRNA分子的目的区域包含mRNA分子的编码[0021]在任何上述方法的一些实施方案中，mRNA分子的目的区域包含mRNA分子的3'-非[0025]图2B以图形形式显示了用于确定来自mRNA分子的目的区[0027]图3B以图形形式显示了用于确定来自mRNA分子的目的区中配置的多核苷酸的流动循环和不同条形码区域使得引物在延伸至均聚物区域之前延伸8[0029]图4B以图形形式显示了用于确定来自mRNA分子的目的区其中多个多核苷酸具有不同的条形码区域的序列但具有相同的流动长度(flowlength)。[0030]图5A显示了用于使用两个引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的示例性方[0031]图5B以图形形式显示了使用两个引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的示[0032]图5C显示了使用两个引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的另一个示例性[0033]图5D以图形形式显示了使用两个引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的示[0034]图6A显示了使用可切割引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的示例性方法[0035]图6B以图形形式显示了使用可切割引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的[0038]图8显示三个示例性序列的测序流矩阵和信号轨迹，所述示例性序列包含条形码避免对均聚物区域的全部或大部分(例如，poly-A区域或其补体，poly-T区域)进行测序。[0041]测序的多核苷酸可以包含条形码区域，其可以包含例如样品条形码和/或唯一分子标识符(UMI)。均聚物区域可以位于mRNA分子的条形码区域和目的区域之间的多核苷酸(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所9物区域中存在的相同碱基的互补碱基的标记核苷酸确定条形码区域的序列；(c)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的核苷酸在均聚物区域内延伸引物；和(d)使用标记核苷酸确(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所的序列的靶区域；(b)使用标记核苷酸和未标记核苷酸以标记核苷酸相对总核苷酸的第一比例确定条形码区域的序列；(c)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的标记核苷酸以标延伸在均聚物区域内停止；(d)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的未标记核苷酸将引(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所用标记核苷酸确定条形码区域的序列，其中配置所述预定循环和多核苷酸的条形码区域，使得引物在延伸至均聚物区域之前延伸至跨多个多核苷酸的条形码区域的末端；(c)使用未标记核苷酸在均聚物区域内延伸引物；和(d)使用标记核苷酸确定靶区域的序列。任选(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与第一引物杂交以形成第一多个杂交模板述均聚物区域包含与所述多核苷酸的均聚物区域中的碱基互补的多个连续且相同的碱基；(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板；所(a)将多个源自mRNA的多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，其中所含有多个连续且相同的碱基的均聚物区域和包含与来自mRNA分子的目的区域相关的序列[0053]“非-终止核苷酸”是可以使用聚合酶或转录酶连接到多核苷酸的3'端的核酸部背景下提供的。对所描述的实施例的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，要符合与本文所述的原理和特征一致的最广[0060]本文所述方法中使用的多核苷酸可包含均聚物区域和靶区域。在一些实施方案体中的poly-A区域。在一些实施方案中，多核苷酸的均聚物区域的长度为约5个碱基或更包含靶区域104和靠近靶区域102的3'端的poly-A均聚物区域106。靶区域可以包含3'-UTR102杂交的附着的捕获探针116的表面114以从样品中去除未捕获的多核苷酸或其他材料。核苷酸与测序引物杂交以产生用于测序的杂交模板。本文所述的方法可以包括使用流式测序(flowsequencing)方法对多核苷酸进行测序，该方法也可以称为“自然合成测序”或入本文。尽管参考流式测序方法提供了以下描述，但应理解其他测序方法可用于对全部或其中封闭基团通常在连接连续核苷酸之前被去除。如果模板链中不存在互补碱基，则引物延伸停止，直到引入与模板链中的下一个碱基互补的核苷酸。可以标记至少一部分核苷酸以便可以检测掺入。尽管在某些实施方案中可以同时引入两种或三种不同类型的核苷酸，最常见的是一次仅引入一种核苷酸类型(即，离散添加)。这种方法可以与使用可逆终止子的测序方法形成对比，其中引物延伸在每个单个碱基的延伸之后停止，然后终止子被反转以允许掺入下一个后续碱基。同的核苷酸顺序和不同碱基类型的数量(即对称循环)或不同的核苷酸顺序和/或不同数量以是A-T-G-C并且第二循环的顺序可以是A-T-C。本领域技术人员可以容易地想到替代顺[0071]聚合酶可用于通过以模板依赖性方式在引物末端掺入一个或多个核苷酸来延伸标记(例如荧光标记)或放射性标记，并且可以使用检测器来检测由标记发射或改变的信[0079]可用于根据本文描述的方法的用于测序和/或分析测序数据的其他方法描述于美国专利申请号16/864,971；美国专利申请号16/864,981；国际PCT申请号PCT/US2020/互补的核苷酸(例如非-终止核苷酸)来延伸引物以在均聚物区域内延伸引物。用于在均聚引物的核苷酸包含未标记核苷酸和标记核苷酸(例如未标记的非-终止核苷酸和标记的非-终止核苷酸)，其中用于在多核苷酸的均聚物区域内延伸引物的标记核苷酸相对于总核苷酸的比例小于用于在多核苷酸的条形码区域和/或多核苷酸的靶区域内延伸引物的标记核源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所述多核苷酸包含条形码区域中存在的相同碱基的互补碱基的标记核苷酸确定条形码区域的序列；(c)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的核苷酸在均聚物区域内延伸引物；和(d)使用标记核苷酸确定靶区域的序列。(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所的序列的靶区域，其中条形码区域省去了均聚物区域中存在的相同碱基；(b)使用标记的[0086]一旦形成杂交模板，例如使用流式测序方法就可以将引物延伸通过条形码区核苷酸互补)在与新掺入的碱基位置相对的位置存在于模板多核苷酸链中，则会发生引物如通过使用未标记核苷酸或不检测标记(例如，荧光)不检测核苷酸掺入的存在或不存在。核苷酸的较小比例包含(与用于确定条形码区域的序列的部分相比)或在引物延伸通过均中条形码区域省去了均聚物区域中存在的相同碱基。图2B以图形形式示出了示例性方法。[0091]在图2A和图2B的步骤204中，使用缺乏均聚物区域中存在的相同碱基的互补碱基[0092]在图2A和图2B的步骤206中，使用与均聚物区域中存在的碱基互补的核苷酸在均一些实施方案中，未检测到在均聚物区域内的引物延伸期间的核苷酸掺入的存在或不存续且相同的碱基的均聚物区域，以及包含与来自mRNA分子的目的区域相关的序列的靶区域；(b)使用标记核苷酸和未标记核苷酸以标记核苷酸相对总核苷酸的第一比例确定条形码区域的序列；(c)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的标记核苷酸以标记核苷酸相对区域内停止；(d)使用与均聚物区域中存在的碱基互补的未标记核苷酸将引物延伸至均聚(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所域中存在的碱基互补的标记的非-终止核苷酸以标记的非-终止核苷酸相对总的非-终止核相对总核苷酸的比例低于用于在均聚物区域内延伸引物的标记核苷酸相对总核苷酸的比标记与核苷酸之间的接头的结构)以及在引物延伸期间使用的标记核苷酸相对总核苷酸的苷酸的比例通常大于在确定序列(例如条形码区域和/或靶区域的序列)时使用的标记核苷酸相比为约0.01％至约100例如约0.01％至约0.025％、约0.025％至约0.05％、约后用于在均聚物区域内继续引物延伸的标记核苷酸的比例应该低于在停止引物延伸时使物区域内停止。为了在停止后重新开始引物延伸，可以去除未掺入的核苷酸和聚合酶(例[0104]可以使用未标记核苷酸(或小部分的标记核苷酸)将引物延伸至均聚物区域的末去除未掺入的核苷酸。然后检测掺入的标记核苷酸的存在或不存在以确定该位置的序列。域的序列。在均聚物区域内的引物延伸期间核苷酸掺入的存在[0107]在图3A和图3B的步骤306中，使用与均聚物区域中存在的碱基互补的标记核苷酸[0111]配置多核苷酸的流动循环和不同条形码区域使得引物在延伸至均聚物区域之前域的流动长度是将引物从该区域的起点延伸至该区域的末端所需的循环数。以这种方式，(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所用标记核苷酸确定条形码区域的序列，其中配置所述预定循环和多核苷酸的条形码区域，使得引物在延伸至均聚物区域之前延伸至跨多个多核苷酸的条形码区域的末端；(c)使用(a)将源自mRNA的多个多核苷酸与引物杂交以形成多个杂交模板，所用标记的非-终止核苷酸确定条形码区域的序列，其中配置所述多核苷酸的预定循环和条形码区域，使得引物在延伸至均聚物区域之前延伸至跨多个多核苷酸的条形码区域的末核苷酸确定靶区域的序列。[0116]一旦形成杂交模板，例如使用流式测序方法就可以将引物延伸通过条形码区在条形码区域的测序期间，通过将杂交模板与核苷酸(包含标记核苷酸，在一些实施方案[0117]由于引物的延伸在条形码区域的末端和在将引物延伸至引物延伸可以使用较用于在条形码区域内和/或靶区域内延伸引物的比例不同比例的标记物区域内停止。为了在停止后重新开始引物延伸，可以去除未掺入的核苷酸和聚合酶(例依懒性方式将标记核苷酸掺入引物的3'端，从而将引物从均聚物区域的末端延伸至靶区域、条形码区域和靶区域的多核苷酸与引物杂交以形成杂交模板，所述靶区包含与目的形码区域，使得引物在延伸至均聚物区域之前延伸至跨多个多核苷酸的条形码区域的末酸的较小比例包含(与用于确定条形码区域的序列的部分相比)或在引物延伸通过均聚物poly-A序列，则第二引物可以包含5'-(poly-T)-V-3'序列，其中V是除T之外的域的3'端杂交。均聚物区域和5'锚可以通过接头例如PEG亚磷酰胺接头或脱碱基脱氧核糖[0131]第一引物可以在靠近条形码区域3'端的位置与包含条形码区域和靶区域的多核第一引物在条形码区域内延伸以确定条形码区域的序聚物区域包含与多核苷酸的均聚物区域中的碱基互补的多个连续且相同的碱基；和(d)使述均聚物区域包含与多核苷酸的均聚物区域中的碱基互补的多个连续且相同的碱基；和[0135]图5A显示了用于使用两个引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的示例性方到确定条形码区域的序列。[0137]在图5A和图5B的步骤506中，多核苷酸与包含均聚物区域的第二引物杂交从而形成第二杂交模板，所述均聚物区域具有与多核苷酸的均聚物区域中存在的碱基互补的碱域中存在的碱基互补的未标记和/或标记核苷酸与第二杂交模板接触并掺入第二引物的末使得引物的3'端在杂交时位于多核苷酸的均聚物[0139]图5C显示了使用两个引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的另一个示例性[0145]例如使用流式测序方法，可以延伸第二引物区段以对多核苷酸的靶区域进行测引物可以包含poly-A区域，或者如果包含靶区域的多核苷酸的均聚物区域是poly-A区域，则第二引物可以包含poly-T区域。这允许第二引物有效地与多核苷酸的均聚物区域杂交。切割可以被控制。在一些实施方案中，可切割接头包含含有尿嘧啶(U)碱基的多核苷酸序列。[0154]图6A显示了用于使用可切割引物确定来自mRNA分子的目的区域的序列的示例性种或三种不同的核苷酸类型。聚合酶以模板依赖性方式可用于将核苷酸掺入引物的3'端，区域的测序期间，通过将第二杂交模板与核苷酸(包含标记核苷酸和任选地，未标记核苷[0165]在步骤702中，将具有均聚物区域和靶区域的多核苷酸与引物杂交以形成杂交模[0167]在图7A和图7B的步骤704中，使用与均聚物区域中存在的碱基互补的核苷酸在均[0169]在图7A和图7B的步骤708中，通过重复步骤704和706重新开始均聚物区域内的引物延伸。与均聚物区域中存在的碱基互补的核苷酸用于在均聚物区域内进一步延伸引物。用于在引物延伸已停止后在均聚物区域内继续延伸引物的总核苷酸的小于约5％、小于约去除未掺入的核苷酸，并且新鲜的核苷酸可用于在停顿后重新启动聚合酶或抢先停顿种或三种不同的核苷酸类型。可以使用聚合酶以模板依懒性方式将核苷酸掺入引物的3'种替代方案。获珠通过分离和洗涤捕获珠来分离液体裂解物中的mRNA分子。使用捕获探针DNA寡聚体和[0176]通过将衔接子序列连接到cDNA多核苷酸的5'和3'端以生成测序文库来制备cDNA[0178]一旦测序引物延伸通过条形码区域，将含有100％未标记三磷酸胸苷的第四溶液[0179]除了含有胸腺嘧啶核苷酸(约2.5％荧光标记和约97.5％未标记)的第五溶液之获珠通过分离和洗涤捕获珠来分离液体裂解物中的mRNA分子。使用捕获探针DNA寡聚体和[0182]通过将衔接子序列连接到cDNA多核苷酸的5'和3'端以生成测序文库来制备cDNA文库以用于测序。将测序文库应用于测序阵列表面，该表面含有附着于表面的DNA寡核苷例如非-终止核苷酸的第一溶液，并且使用洗涤缓冲液洗涤测序表面以去除未掺入的核苷获珠通过分离和洗涤捕获珠来分离液体裂解物中的mRNA分子。使用捕获探针DNA寡聚体和[0192]通过将衔接子序列连接到cDNA多核苷酸的5'和3'端以生成测序文库来制备cDNA文库以用于测序。将测序文库应用于测序阵列表面，该表面含有附着于表面的DNA寡核苷苷酸和约97.5％的未标记核苷酸。使用荧光检测器检测跨菌落的碱基掺入的存在或不存域并到达均聚物区域的起点处，将含有100％未标记三磷酸胸苷的第五溶液施加到测序表捕获珠通过分离和洗涤捕获珠来分离液体裂解物中的mRNA分子。使用捕获探针DNA寡聚体[0198]通过将衔接子序列连接到cDNA多核苷酸的5'和3'端以生成测序文库来制备cDNA文库以用于测序。将测序文库应用于测序阵列表面，该表面含有附着于表面的DNA寡核苷T)即非-终止核苷酸的第一溶液，并且使用洗涤缓冲液洗涤测序表面以去