马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立及其初步应用

马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法的建立及其初步应用摘要马流感是由马流感病毒（Equineinfluenzavirus，EIV）引起马属动物的一种急性呼吸性传染病，具有国际传播性、高度传染性、发病频率高、发病率不稳定和死亡率低等特点。同时我国又有着丰富的马驴产业，因此马流感防控工作任重而道远，建立一种快速、可靠、适于基层使用的EIV诊断方法对于马流感防治十分必要。本研究成功建立了马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法，并对其性能进行评估及初步应用，为马流感的诊断与防控提供有力工具。关键词马流感病毒；抗原捕捉ELISA；检测方法；初步应用一、引言马流感严重威胁马属动物健康及马产业发展。快速准确诊断是防控马流感的关键环节。酶联免疫吸附试验（ELISA）具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，在多种疾病诊断中广泛应用。本研究旨在建立针对马流感病毒的抗原捕捉ELISA检测方法，并对其进行初步应用探索。二、材料与方法2.1材料2.1.1病毒与细胞实验室保存的EIVA／马／新疆／07（H3N8）（简称XJ株），SP2/0细胞等。2.1.2主要试剂各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒、PCR试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗兔IgG、邻苯二胺（OPD）底物、小牛血清、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂等。2.1.3主要仪器PCR扩增仪、高速冷冻离心机、酶标仪、恒温培养箱、超净工作台等。2.2方法2.2.1马流感病毒NP基因的克隆与原核表达以XJ株病毒RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出NP基因，将其克隆至pMD-18T载体。测序鉴定正确后，经双酶切将NP基因亚克隆至原核表达载体pET-30a，构建重组质粒pET30a-NP并转化Rosetta（DE3）。对重组菌进行诱导表达，优化表达条件，采用镍柱对表达的重组蛋白NP进行纯化。通过SDS-PAGE和Westernblot鉴定纯化蛋白。2.2.2单克隆抗体的制备与鉴定将纯化的NP蛋白作为免疫原，腹腔接种4周龄BALB／c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与SP2／0融合。用蔗糖密度梯度纯化的XJ株为筛选抗原，建立间接ELISA方法，筛选出针对NP单克隆抗体的杂交瘤细胞。对获得的单克隆抗体进行亚类鉴定、Westernblot、间接免疫荧光和间接ELISA鉴定，确定其特异性。2.2.3多克隆抗体的制备用蔗糖密度梯度纯化的XJ株和纯化NP分别接种家兔，制备针对EIVXJ株的多克隆抗体（抗EIV多抗）和抗NP多克隆抗体（抗NP多抗）。2.2.4抗原捕捉ELISA方法的建立与优化选取单克隆抗体2G11分别与抗EIV多抗和抗NP多抗建立四种抗原捕捉ELISA方法：抗原捕捉ELISA1：以抗EIV多抗为捕获抗体，2G11为检测抗体。抗原捕捉ELISA2：以2G11为捕获抗体，抗EIV多抗为检测抗体。抗原捕捉ELISA3：以2G11为捕获抗体，抗NP多抗为检测抗体。抗原捕捉ELISA4：以抗NP多抗为捕获抗体，2G11为检测抗体。对四种方法的反应条件，如包被抗体浓度、抗原孵育时间、酶标抗体浓度、显色时间等进行优化。2.2.5抗原捕捉ELISA方法的特异性和敏感性试验将优化的四种抗原捕捉ELISA方法分别与马疱疹病毒1／4型、马乙型脑炎病毒和马动脉炎病毒进行交叉反应试验，检测其特异性。用不同稀释度的马流感病毒抗原进行检测，确定四种方法的敏感性，并与血凝试验结果进行比较。2.2.6临床样品检测采用喷雾法对无EIV抗体的幼驹进行攻毒试验。攻毒后连续10d采集鼻拭子，同时进行病毒分离、多重RT-PCR和上述四种抗原捕捉ELISA检测。对比不同检测方法的结果，评估抗原捕捉ELISA方法在临床检测中的适用性。三、结果3.1马流感病毒NP基因的克隆与原核表达成功扩增出NP基因并构建重组质粒pET30a-NP。在优化条件下，重组蛋白NP以可溶性形式高效表达，分子质量约64ku。经镍柱纯化后，SDS-PAGE和Westernblot结果表明，纯化的重组蛋白NP能与马流感阳性血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。3.2单克隆抗体的制备与鉴定成功获得三株能够稳定分泌NP单克隆抗体的杂交瘤细胞株（2G11、3E10和4A1）。亚类鉴定表明，2G11为IgG1亚类，3E10和4A1为IgG2a亚类。Westernblot、间接免疫荧光和间接ELISA结果表明，三株单克隆抗体均能特异性识别重组蛋白NP，与天然EIV结合，而与His标签蛋白和马日本脑炎病毒、马疱疹病毒1／4型及马动脉炎病毒均不发生反应，具有良好的特异性。3.3多克隆抗体的制备成功制备了抗EIV多抗和抗NP多抗，经ELISA检测，抗体效价均达到1:12800以上。3.4抗原捕捉ELISA方法的建立与优化确定了四种抗原捕捉ELISA方法的最佳反应条件。例如，抗原捕捉ELISA4的最佳反应条件为：抗NP多抗包被浓度为10μg/mL，4℃包被过夜；抗原孵育时间为1h，37℃；2G11检测抗体浓度为10μg/mL，37℃孵育1h；HRP标记的羊抗鼠IgG工作浓度为1:5000，37℃孵育1h；OPD底物显色15min。3.5抗原捕捉ELISA方法的特异性和敏感性试验四种抗原捕捉ELISA方法与马疱疹病毒1／4型、马乙型脑炎病毒和马动脉炎病毒均不发生交叉反应，具有较高的特异性。四种方法均与H7N7亚型EIV有交叉反应，且敏感性明显高于血凝试验结果。其中，抗原捕捉ELISA4对禽源性A／马／吉林／89（H3N8）（简称JL株）、欧洲系A／马／青海／94（H3N8）（简称QH株）和A／马／迈阿密／63（H3N8）（简称Miami株）都具有很高的敏感性，其最低检测限可达10pg/mL。3.6临床样品检测抗原捕捉ELISA4与病毒分离和多重RT-PCR符合性最好，可检测到攻毒后第3-7d的病毒粒子。在实际临床样品检测中，抗原捕捉ELISA4检测出的阳性样品数与病毒分离结果基本一致，且检测时间更短，操作更简便。四、讨论本研究成功建立了四种马流感病毒抗原捕捉ELISA检测方法，通过对方法的特异性、敏感性和临床样品检测评估，发现抗原捕捉ELISA4表现最为优异。该方法不仅具有较高的特异性，与其他相关病毒无交叉反应，而且敏感性显著高于传统血凝试验，能够检测到极低浓度的马流感病毒抗原。在临床样品检测中，抗原捕捉ELISA4与病毒分离和多重RT-PCR结果具有良好的符合性，能够快速、准确地检测出马流感病毒，适用于马流感的临床诊断。与其他马流感检测方法相比，本研究建立的抗原捕捉ELISA方法具有明显优势。例如，病毒分离培养虽然是金标准，但操作繁琐、耗时较长，对实验条件要求高；PCR方法虽然敏感性高，但对仪器设备和操作人员要求较高，且易出现假阳性。而抗原捕捉ELISA方法操作简便、快速，不需要特殊的仪器设备，适合基层实验室开展马流感的诊断工作。然而，本研究也存在一定的局限性。例如，在建立抗原捕捉ELISA方法时，虽然对多种反应条件进行了优化，但可能仍存在进一步优化的空间。此外，本研究仅对部分马流感病毒毒株进行了检测，对于其他亚型或变异株的检测效果还需进一步验证。在未来的研究中，可以进一步优化抗原捕捉ELISA方法的反应条件，提高其检测性能。同时，扩大检测病毒的范围，验证该方法对不