CN114728213B 用于具有顺序pH调整的单通道自由流电泳的方法 （普诺森公司）

2022.05.19PCT/US2020/0550712020.10.09WO2021/072262EN2021.04.15US6328869B1,2001.12.11用于具有顺序pH调整的单通道自由流电泳本文所述的实施例涉及单通道自由流电泳pH值和根据感兴趣的分析物的对应等电点分离感兴趣的分析物而从样品分离和收集感兴趣的道和阴极电解液通道施加垂直于样品流动方向2经由与中心通道平行的阳极电解液通道和阴极电解液通道施加不平行于所述样品的根据第一分析物的等电点和电解质缓冲液的第一pH值，将第一分析物与所述样品分在一个出口处收集从样品分离的含有第一分析物的样品第一级分第二pH值的第二等电点的第二分析物的至少一部分进入阳极电解液通道或阴极电解液通在所述出口处收集含有从样品分离的第二分析物的样品第二级2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在使所述样品流动通过所述中心通道之3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含使电解质缓冲液从储器并且通过所述阳4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含施加跨越所述阳极电解液通道和所述阴解质缓冲液经由两个回路流动通过所述阳极电解液通道和所述阴极电8.根据权利要求1所述的方法，其中含有第一分析物的样9.根据权利要求1所述的方法，其中含有第一分析物的样品3[0002]本申请要求2019年10月9日提交的标题为“用于具有顺序pH调整的单通道自由流性溶质的等电点(pI)以pH梯度分离它们的电泳技术。合成载体两性电解质是小的两性分消散焦耳热并将对流混合保持在最低限度，制备级IEF装置通常落后于它们的分析型对应[0007]本文所述的一些实施例涉及用于收集和分离含有生物材料或分析物如蛋白质的样品电泳分级。阳极电解液通道和阴极电解液通道可以平行于中心通道并在其相对侧设置。阳极电解液通道和阴极电解液通道可以配置为填充有电解液并分别连接到阳极和阴4缓冲液和/或电解质缓冲液的pH的pI的分析物可以沿电场方向(垂直于流体动力学流的方制样品和/或电解质缓冲液的pH来纯化感兴趣的特定的主体可以限定配置为耦接到阴极的阴极电解液通道和配置为耦接到阳极的阳极电解液电解质缓冲液可以含有一种或多种聚合物，例如甲基纤维素(例如，按重量计0.1％至为使电解质缓冲液在返回储器之前自储器首先通过阳极电解液通道然后通过阴极电解液电解质缓冲液可以具有0.1至14的pH值，使得具有在该范围内的相应pI值的分析物可以被[0014]在一些实施例中，流体动力学屏障的孔可具有25nm至800nm的中值特征长度(例5有电解质缓冲液的阳极电解液通道和阴极电解液通道施加。中心通道可以电耦接和/或离子耦接，但通过流体动力屏障与阳极电解液通道和阴极电解液通道中的至少一个流体隔离。可根据感兴趣的分析物的等电点和电解质缓冲液和/或样品缓冲液的pH值将感兴趣的循环，使得电解质缓冲液在返回储器之前可以流动通过阳极电解液通道和阴极电解液通缓冲液可以在两个单独的回路中流动通过阳极电解液通道和阴极电解[0018]在一些实施例中，电解质缓冲液和/或样品的pH值可以例如通过计量泵或阀顺序[0019]图1A和1B说明根据实施例的单通道自由流电泳装置的组装。图1A示出组装的装[0020]图2A和2B示出根据实施例的用于单通道自由流电泳装置的电解质缓冲液的再循系基于MES-BisTris。通过改变MES和BisTris的比率调整缓冲液pH。图3A示出缓冲液pH为[0023]图5示出碱性蛋白质赫赛汀的分[0024]图6是根据实施例的根据一种或多种感兴趣的蛋白和分析物混合物的等电点将它6[0026]虽然本文中已示出和描述本公开的各种实施例，但本领在一些情况下，样品可以是单个细胞(或单个细胞内容物)或多个细胞(或多个细胞内容[0032]本公开的仪器和方法大体上涉及根据样品中含有的感兴趣的分析物的等电点7常含有分析物混合物)进入中心通道，并且出口130允许在装置的相对侧处收集样品级分。[0037]多孔膜160设置在主体150与底盖170之间，并且底盖170与主体150一起限定中心自多孔膜160的中空空间或开口限定中心通道的长度[0038]多孔膜160被配置为通过样品(当其流动通过中心通道时)和电解质缓冲液(当其任何其它合适材料制成。多孔膜160通常被配置为允许离子和/或分析物迁移进入/穿过多8体隔离”是指相对于中心通道将体积流速降低至少95％、至少99％、至少99.9％或至少学障碍可以被配置为将样品电和/或离子耦接到电解质缓冲液，同时防止或阻碍流体动力在中心通道与阳极缓冲液通道和阴极缓冲液通道中的至性材料制成的薄膜可以施加到底盖170以防止蛋白质吸附到底盖170，并提供电隔离(如果在底盖170与多孔膜160之间。在一些实施例中，由绝缘材料制成的薄膜可以定位在s主体在一些实施例中，组装装置的底盖170可以放置在通过冷冻冷却剂的再循环来调节温度的[0042]阴极缓冲液通道被配置为耦接到阴极，并且阳极缓冲液通道被配置为耦接到阳9[0045]在一些实施例中，如本文所述的装置或设备可以仅包含一个入口120和仅一个出多个入口和/或出口可用于例如增加吞吐量。如本文所述的装置或设备的另一个优点是减[0046]多孔膜160可以防止或基本上阻碍流体动力学流，同时允许离子和分析物的电动[0049]在一些实施例中，多孔膜160的孔径范围可为约25nm至约800nm、约30nm至约极电解质缓冲液罐744。阳极电解质缓冲液罐742和阴极电解质缓冲液罐744可以充当平行电极，使得电压可以施加到阳极电解质缓冲液罐742和阴极电解质缓冲液罐744内的缓冲将中心通道电和/或离子耦接到缓冲液罐742，并且另一个将中心通道电和/或离子耦接到置为由流动通过中心通道的样品在一侧上润湿，并且由缓冲液(例如，来自缓冲液罐742、744)在另一侧上润湿。多孔膜760可以被配置为使得缓冲离子和/或蛋白质可以迁移进入/[0052]图2A示出根据实施例的用于单通道自由流电泳装置的单回路电解质缓冲液再循中的至少一个流体连接到含有电解质缓冲液的储器290。图2A和2B示出的示意图可以使用耦接到底板)的温度可以向下调节到5℃至15℃,包括其间的所有范围和子范围。温度稳定质缓冲液可以用蠕动泵或另一合适的泵280通过装置的缓冲液通道再循环。电解质缓冲液将电解质缓冲液从缓冲液储器290沿一个缓冲液通道向下输送并通过另一缓冲液通道运[0054]在其他情况下，电解质缓冲液可以使用两个流体回路通过两个缓冲液通道再循含有甲基纤维素。在一些实施例中，储器可以含有电解质缓冲液，其具有0.01％至1％、况下维持在恒定pH。为了减缓电渗流并且允许更有效地控制分级过程，可以将浓度为[0059]本公开提供了通过使用单通道自由流电泳根据分析物的pI值将感兴趣的分析物中心通道的流动速率和/或电场的强度可以控制离开中心通道的出口的分级样品的纯度。物，使得具有不同于一种或多种缓冲液的pH值的pI值的分析物被选择性地拒绝进入/穿过[0061]在650处，可以通过在630调整电解质缓冲液和/或样品缓冲液的pH来收集多种感流通过流体动力学障碍以将不需要的pI片段(即，不具有感兴趣的pI值的片段)推出通道，电聚焦系统或技术)测量。在一些实施例中，可以通过调整MES与BisTris的比率来改变pH为5.65和5.72的两个片段均不可检测，而pI值为5.9的片段的相对量从3.5％增加到约富集到68.3而pI值为8.63的第一峰不能再被检测到。在pH9.4，8.95的pI片段为