CN114737258B 一种高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法和试剂盒以及测序方法 （重庆医科大学国际体外诊断研究院）

院US2021317522A1,2021analysis.LabChip.2024,第第24一种高通量单细胞全长转录组测序文库的本发明公开了一种高通量单细胞全长转录同时对10～107个单细胞全长转录组的高通量测2将n个所述水凝胶微球分为x份，x为正整数且＜n，对每一份水凝胶一份水凝胶微球的随机引物上标记有不同的特异性标签，随后将x份水凝胶微球合并成一采用具有链取代活性的聚合酶将所有水凝胶微球中二链cDN每次进行所述标记新的特异性标签的步骤包括：将x份水凝胶微球混合后重新分成y在水凝胶微球中随机引物的标签上标记不同的特异标签以形成多级特异标签的步骤所述在水凝胶微球中随机引物的标签上标记不同的特异标签以形成多级特异标签的所述随机引物的作用浓度为能够使延伸获得的二链cDNA片段的长度在二代测序的读长范在采用所述随机引物对全长cDNA进行延伸时，所述构建方法还包括在延伸体系中添加dNTPs和ddNTPs的作用浓度为能够用于使二链cDNA片段的长度在38.根据权利要求1~7任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其8任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法构建高通量单细胞全长转录录组扩增的相连两条二链cDNA片段之间具有一部分的重叠序列，利用所述重叠序列将所述组合物包括：用于实施如权利要求1~8任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法或如权利要求9~11任一项所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法的试利要求1~8任一项所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法或如权利要求9~11任一项所述的高通量单细胞全长转录组的测序方4[0002]单细胞转录组测序(scRNA-seq)技术是全球生命科学领域新的焦点，也是生物医胞分析计划(SingleCellAnalysisProgram)、人类细胞图谱计划(TheHumanCellAtlas)、人血细胞分子图谱计划(AtlasofBloodCells)、人类生物分子图谱计划(The面，迄今为止大多数的单细胞高通量转录组平台是基于二代测序平台，例如采用SMART-[0005]全长转录组(Full-lengthtranscriptome)现有是基于PacBio和Nanopore三代测仍然较高，以10XGenomics的Chromium系统为例，单个细胞的制备成本大约为0.155[0009]本发明的目的在于提供一种高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法和试录组测序文库的构建方法或如前述实施例所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法的述实施例所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法的[0016]本发明采用了在结合液滴微流控技术、组合编码技术以创造性地采用特定标签的方法实现了同时对10～107个单细胞全长转录组的高通量测序分6[0032]本发明实施例提供了一种高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其包且＜n，对每一份水凝胶微球采用随机引物对将全长cDNA延伸为二链cDNA片段，形成全长造性地采用特定标签方法实现了10～107个单细胞全长转录组的测序分析，解决了大规模7形成多级特异标签的步骤包括：在水凝胶微球中添加连接酶以及含有标签序列的连接探通过这些标签序列来排除由于DNA聚合酶和扩增以及测序过程中所引入的错误。其原理如8[0042]所述随机引物或随机引物上标记的标签上还连接有用于与后续打标的连接探针[0043]将二链cDNA片段长度控制于二代测序长度范围内的方法除限定随机引物的作用[0044]优选地，dNTPs和ddNTPs的作用浓度为能够用于使二链cDNA片段的长度在二代测[0045]优选地，所述dNTPs和的作用浓度为0.05～0.5mM中的任意数值，具体可以为效地使得二链cDNA片段的长度限于二代测序获得的二链cDNA片段的长度在二代测序1056和107中的任意一项或任意两项之间的范围。采用本发明提供的构建方法能够同时如前述任意实施例所述的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法构建高通量单细的瓶颈问题。而本发明提供的测序方法能够高通量地检测多个单细胞的全长转录组信息，[0052]本发明实施例还提供了组合物在制备用于高通量单细胞全长转录组测序的试剂序文库的构建的试剂和方法或如前述任意实施例所述的高通量单细胞全长转录组的测序9如前述任意实施例所述的高通量单细胞全长转录组的测序方法的基(acrydite)修饰的mRNA捕获探针(Oligo-T30：acrydite-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTBC)随机引物(Round1_XX)将全长cDNA延伸成二链cDNA短片段，形成一链全长cDNA与二链伸反应及第一段条形码标签的添加示意图见图7，含ddNTPs的延伸反应及第一段条形码标AGGCCAGAGCATTCGA⃞CGIGNNNNNN-3'(加粗的15nt与2ndbarcodelinker(连接序列)部分杂交，这部分96孔都相同；下划线8nt部分为1stExtension[0067]每个反应孔的延伸反应溶液的配方如下所示后平均分成96份(y)，分别与96种带有DNA条形码的特异性标签(2ndBC)的连接探针[0069]DNA条形码的特异性标签(2ndBC)的连接探针(Round2_XX)的组成：5'-CATCGGCGTACGACTAACSIGATCCACGTGCTTGAG-3'(加粗15nt与3rdbarcodelinker部分杂交，这部分96孔都相同；下划线8nt部分为2ndLigation---96份，分别与96种带有DNA条形码的特异性标签(3rdBC)的连接探针(3rdLigationXX)的组成：5'CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNAGGGTGGCCGATGTTTCG-3加粗的22nt为PCR引物序列，这部分96---[0081]此时即可得到带有近百万(963)种独立条形码标签的水凝胶微球，当微球数目少于十万个时可保证每个细胞带上唯一的细胞标签，最多可实现对10000个单细胞全长转录