CN114846149B 用于不依赖于模板的核酸合成的方法和试剂盒 （陈呈尧）

2022.06.23PCT/US2020/0663362020.12.21WO2021/133713EN2021.07.01US2019264248A1,2019.08.29US2019078065A1,2019.03.14用于不依赖于模板的核酸合成的方法和试有至少一个B家族DNA聚合酶的保守催化聚合酶酶和至少一种属于二价阳离子的金属辅因子存以及至少一种金属辅因子，且根据所述方法使2polymerase.Biochemistry.20113在所述核酸聚合酶及至少一种属于二价阳离子的金属辅因子存其中所述核酸聚合酶进一步具有3'至5'核酸外切酶结构域，并聚合酶、激烈火球菌(Pyrococusfurious)(Pfu)的B家族DNA聚合酶、深海嗜热古生菌(Thermococcussp.)(9°N)的B家族DNA聚合酶、戈氏嗜热古生菌(Thermococcus5.根据权利要求1所述的方法，其中所述起始子在10℃至90℃范围内的温度下暴露于6.根据权利要求1所述的方法，其中所述起始子在不小2+2+2+8.根据权利要求1所述的方法，其中所述B家族DNA聚合酶的3'至5'核酸外切酶结构域其中所述核酸聚合酶进一步具有3'至5'核酸外切酶结构域，并4聚合酶、激烈火球菌(Pyrococusfurious)(Pfu)的B家族DNA聚合酶、深海嗜热古生菌(Thermococcussp.)(9°N)的B家族DNA聚合酶、戈氏嗜热古生菌(Thermococcus生菌(9°N)的B家族DNA聚合酶、戈氏嗜热古生菌(Tgo)的B家族DNA聚合酶和滨海热球菌15.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述B家族DNA聚合酶的16.根据权利要求12所述的试剂盒，其中所述核苷酸单体具有选自由以下组成的组的5[0002]本件申请案主张在2019年12月23日提交的美国临时申请号16/7[0004]在过去的几十年间，已经开发了免除DNA模板的DNA从头合成(DenovoDNA胺的化学DNA合成的主要缺点之一是在上述反应步骤中无法避免有害化学物质[0005]由于对环境保护的需求不断提升，适用于DNA合成的绿色科技已引起研究人员的[0006]就不依赖于模板的酶促DNA合成(template-independentenzymaticDNAsynthesis)而言，已经发现末端脱氧核苷酸转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)是可将所有四种脱氧核苷三磷酸(deoxynucleosidetriphosphates,dNTP)附加至DNA链的3'末端的不依赖于模板的DNA聚合酶(template-independentDNADNA合成(TdT-basedDNAsynthesis)仅需两个反应步骤，即从正在合成中的单链DNA链延伸的3'端通过TdT进行单一核苷酸添加以及继而移除3'-保护基。尽管TdT及其同源物已应用于许多DNA合成平台，但基于TdT的不依赖于模板的酶促DNA合成由于令人不满意的产物[0008]所述方法包括提供起始子(initiator)，其具有位于3'末端的未受保护的核苷碱基和3'羟基；提供核酸聚合酶，其具有至少一个B家族DNA聚合酶(family-BDNA6[0010]本发明的其他特征和优点在以下参照附图的实施方案的[0012]图2是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在不同反应温度下使用KOD1exo-[0013]图3是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在不同反应温度下使用Ventexo-[0014]图4是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在不同反应温度下使用Pfuexo-[0015]图5是变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶的图像，其显示在只有Mg2+或与Mn2+组合的存在exo-催化聚合酶结构域和3'至5'核酸外切酶结构域，且可以在细菌(bacteria)、古细菌意指蛋白质的氨基酸序列的结构部分或区域，其具有所述蛋白质的催化DNA/RNA聚合酶活(proofreadingactivity))、用于在复制期间切除(excision)冈崎引物(Okazaki7核生物的B家族DNA聚合酶(例如Polα、Polδ和Polε,以及Polζ)、古细菌的B家族DNA聚合酶(top)”链。所述模板链也可称为“有义(sense)”链，而所述非模板链则被称为“反义acids,XNA)或肽核酸(peptidenucl8同结构和/或功能的蛋白质中相同的氨基酸残基的结构域。保守氨基酸残基的区域对于蛋是选自由以下组成的组中的B家族DNA聚合酶：细菌的B家族DNA聚合酶、真核生物的B家族述B家族DNA聚合酶选自由以下组成的组：极端嗜热古生菌KOD1(ThermococcuskodakaraensisKOD1)的B家族DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococusfurious,Pfu)的B家族制剂来抑制所述B家族DNA聚合酶的3'至一些实施方案中，所述核酸聚合酶最初被设计为仅具有前述原始的保守催化聚合酶结构5-脱氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤或溴-5-脱氧尿苷，以及任何其他允许杂交的经修饰的碱9Ni2+2+3'-O-阻断部分的核苷酸单体也称为3'-阻断的可逆性终止子或3'-O-修饰的可逆性终止基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-7-去氮ATP、5-[(S)-1-基-丙氧基]甲基-dCTP、1-[(5-甲氧基-2-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-7-去氮-硝基苯基)-2,2-二甲基-丙氧基]甲基-料-终止子、IlluminaMiSeq的可逆性染料-终止子、IlluminaHiSeq的可逆性染料-终止子、IlluminaGenomeAnalyzerIIX的可逆性染料-终止子、LaserGen的闪电终止子止子以及对于保护与去保护可应用的条件(即用于添加和消除所述可移除的阻断部分的条件)可以在例如Gardneretal.(2012),NucleicAcidsResearch,40(15)：7404-7415、[0055]实施例1.使用极端嗜热古生菌KOD1(ThermococcuskodakaraensisKOD1)的B家苷酸序列，以及具有未经保护的羟基的3'端和标记有荧光素亚磷酰胺(fluorescein[0057]KOD1exo-DNA聚合酶如下制备。编码极端嗜热古生菌KOD1的B家族DNA聚合酶(没有内含肽但具有正常的3'至5'核酸外切酶结构域)的基因构建体由GenomicsBioSci&Tech用Q5定点突变试剂盒(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)对上述基因构建体上所对应的核苷酸残基进行定点突变(site-directedmutagenesis)。将所得到的突变基因构建体于BL21(DE3)细胞中进行表达，而所表达的蛋白质使用AktaPureFPLC系统(GEHealthcareLifeSciences,Marlborough,MA,USA)并依次通过HisTrapQ和Heparin柱进[0058]将10μL的核酸合成反应混合物在下列温度中的一者下进行历时2分钟的预培育：Mg2+许进行5分钟。通过添加以10μL的2X淬灭溶液(含有95％去离子甲酰胺和25mM乙二胺四乙素-聚丙烯酰胺凝胶分析所述合成反应产物。通过AmershamTyphoonImager(GEHealthcareLifeSciences,Marlborough,MA,USA)观察凝胶双的所述合成[0061]如图2所示，KOD1exo-DNA聚合酶能在所测试的各个温度下进行不依赖于模板的核[0062]实施例2.使用滨海热球菌(Thermococcuslitoralis)(Vent)的B家[0063]不依赖于模板的核酸合成以及所述反应产物的分析大体上根据实施例1中所述的外切酶结构域，因而被称为Ventexo-DNA聚合酶)。Ventexo-DNA聚合酶以与用于制备KOD1exo-DNA聚合酶相同的操作程序(参见实施例1)制备，但使用编码极端嗜热古生菌KOD1的B家族DNA聚合酶(没有内含肽但具有正常的3'至5'核酸外切酶结构域)的基因构建体。Ventexo-DNA聚合酶具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。[0065]如图3所示，Ventexo-DNA聚合酶能在所测试的各个温度下进行不依赖于模板的核[0066]实施例3.使用激烈火球菌(Pyrococusfurious,Pfu)的B家族DNA聚合酶进行不依[0067]不依赖于模板的核酸合成以及所述反应产物得到分析大体上根据实施例1中所述的操作程序进行，但使用Pfu的B家族DNA聚合酶(其具有无活性的3'至5'核酸外切酶结构的操作程序(参见实施例1)制备，但使用编码Pfu的B家族DNA聚合酶(没有内含肽但具有正常的3'至5'核酸外切酶结构域)的基因构建体。Pfuexo-DNA聚合酶具有SEQIDNO:4的氨基酸序列。[0070]实施例4.通过B家族DNA聚合酶与单一类型的二价阳离子或不同的二价阳离子组[0071]为了评估不同类型的二价阳离子是否会影响B家族DNA聚合酶的不依赖于模板的[0072]不依赖于模板的核酸合成以及所述反应产物的分析大体上根据实施例1中所述的所述)和Pfuexo-DNA聚合酶(实施例3中所述)中的各者；将各个合成反应混合物在70℃下进不同类型的二价阳离子的组合可以增强使用B家族DNA聚合酶进行不依赖于模板的核酸合[0075]本说明书中被引述的所有专利和文献通过引用以其整体并入本文。若有所冲突所描述的实施方案，而意欲涵盖被包括在最广泛的解释的精神与范畴中的各种不同的配