斯里兰卡木薯花叶病毒检测技术规程

Q/LB.□XXXXX-XXXXIII）。引物序列根据SLCMV基因组序列设计一对用于特异性扩增的引物。上游引物SL12：5´-CACGGTTTCCGGTGTATGCT-3´下游引物SL13：5´-CCTGGCGTTTCTTGAGGGTAT-3´PCR产物大小约1.0kb。检测DNA提取样品制备称取样品0.1g和两个钢珠，一起放入2.0mL离心管，液氮中急冻后，用高通量样品研磨仪20HZ，研磨60S，直至粉末状。样品解冻前，倒掉钢珠，放入600微升提前预热65℃的CTAB提取缓冲液，剧烈震荡至充分混匀。65℃继续温浴30-60min（期间每隔10min，颠倒混匀两次），12000g离心15min，取上清。加入氯仿600μL，翻转混匀3min，12000g离心10min，取上清；重复加入氯仿600μL，翻转混匀3min，12000g离心10min，取上清；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，4℃静置30min，12000g离心2min，弃上清；加入1mL70%的乙醇洗涤沉淀2次，12000g离心2min，弃上清；DNA沉淀干燥后，用40μL～80μLddH2O溶解，经1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000分光光度计检测浓度检测后分装，-20℃保存备用。烟粉虱DNA提取样本制备单头烟粉虱的提取：吸取25~30μL裂解液于封口膜上，均匀地分成两滴；将1头烟粉虱置于其中一滴裂解液中，用0.2mLPCR管底部研磨虫体，研磨充分后把匀浆液吸入1.5mL离心管中；再用另一滴裂解液冲洗封口膜研磨处，将清洗液吸入1.5mL离心管与匀浆混合；将1.5mL离心管置于65℃水浴锅中水浴1h，接着沸水浴10min，使蛋白酶K失活，短暂离心后即可用于PCR反应，DNA样本置于-20℃保存备用。PCR扩增反应体系以样品DNA，阴性和阳性对照DNA，ddH₂O空白对照模板，按照Extaq酶试剂盒产品说明进行PCR扩增。在PCR反应管中依次加入10×TaqBuffer2.5μL、dNTPs2μL、SL12/SL13（10μmol/L）各1μL、ddH2O17.3μL、TaqDNAPolymerase0.2μL、DNA1μL，补足超纯水至25μL。PCR扩增反应程序94℃预热4min；进行35次扩增循环（94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min）；72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存备用。扩增产物的电泳检测用1×TAE缓冲液，配制成1%的琼脂糖凝胶，按0.05%比例加入GoldenView核酸染料，制板凝固后，加入Mark和PCR产物，进行电泳。电泳结束后在凝胶成像分析系统中观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍照并做记录。结果判定PCR产物凝胶电泳图谱见图B.1。M：DNAMarker；1：阳性对照；2-3：阳性样品；4：阴性对照；5：空白对照；6：阴性样品B.1PCR检测产物电泳图谱如图B.1，阳性对照和检测样品中同时出现目的扩增条带，大小为1.0kb左右，而阴性对照、ddH₂O空白对照均不出现该条带，该样品判为SLCMV阳性；如果阳性对照出现目的扩增条带，大小为1.0kb左右，而阴性对照、ddH₂O空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为SLCMV阴性；如果ddH₂O空白、阴性对照出现目的条带，或阳性对照未出现目的条带，应更换相关试剂后重新进行PCR检测。

（规范性）

巢氏PCR检测方法引物第一轮引物序列：SL12/SL13（见B.1.7）第二轮引物序列：CP1F：5´-AACTTCGACAGCCCATACAG-3´CP1R：5´-AGGATATAAACGGACTTAACGC-3´巢氏PCR检测DNA提取操作方法见B.2.1巢氏PCR扩增反应体系第一轮PCR反应体系和程序（见B.2.3和B.2.4）第二轮PCR反应体系：以第一轮PCR产物为样品DNA，阴性和阳性对照DNA、ddH₂O空白对照等参照B2，按照Extaq酶试剂盒产品说明进行PCR扩增。在PCR反应管中依次加入10×TaqBuffer2.5μL、dNTPs2μL、CP1F/1R（10μmol/L）各1μL、ddH2O17.3μL、TaqDNAPolymerase0.2μL、DNA1μL，补足超纯水至25μL。PCR扩增反应程序94℃预热4min；进行35次扩增循环（94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s）；72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存备用。扩增产物的电泳检测操作方法见A.2.4。结果判定巢氏PCR产物凝胶电泳图谱见图C.1。M：DNAMarker；1：阳性对照；2：阴性对照；3：空白对照；4：阴性样品；5-7：阴性样品C.1巢氏PCR检测产物电泳图谱如图C.1，阳性对照和检测样品中同时出现目的扩增条带，大小约0.3Kb，而阴性对照、ddH₂O空白对照均不出现该条带，该样品判为SLCMV阳性；如果阳性对照出现目的扩增条带，大小约0.3Kb，而阴性对照、ddH₂O空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为SLCMV阴性；如果ddH₂O空白、阴性对照出现目的条带，或阳性对照未出现目的条带，应更换相关试剂后重新进行PCR检测。

（规范性）

实时荧光PCR检测方法试剂和仪器实时荧光定量PCR（探针法）试剂盒，实时荧光定量PCR仪。引物和探针引物序列：SLCMV-QF6395´-AGCAAGAGGCTGGCAAGTATGA-3´SLCMV-QR6995´-ACACGCCATGTACAGCATCAA-3´探针序列：SLCMVProbe-6615´-AATCATACCGAGAATGC-3´修饰5`6-FAM，3`MGB实时荧光PCR检测DNA提取DNA制备提取见B.2.1。实时荧光PCR反应体系以样品DNA，阴性和阳性对照DNA，ddH₂O空白对照模板，按照实时荧光定量PCR（探针法）试剂盒产品说明进行TaqManqPCR扩增。在20μL的反应体系中加入：2×SuperRealPreMix(Probe)10μL，引物SLCMV-QF639/OR699（10μmol/L）各0.6μL，荧光探针（10μmol/L）0.4μL，50×ROXReferenceDye30.2μL，RNase-FreeddH2O6.2μL，DNA模板2μL。实时荧光PCR反应程序95℃预变性15min，然后95℃3s、60℃退火/延伸30s，共40个循环。实时荧光PCR结果判定实时荧光PCR产物凝胶电泳图谱见图D.1。1~2：阳性样品；3，4：阴性样品；5：空白对照。D.1巢氏PCR检测产物电泳图谱如果阳性对照Ct值<35，且出现典型的扩增曲线，阴性对照和空白对照的Ct值≥40，且无扩增曲线：——待测样品Ct值≤35时，且出现典型的扩增曲线，则判定为阳性；——待测样品35<Ct值<40时，应重新进行检测；若重新测试35<Ct值<40，且出现典型的扩增曲线，则判定为阳性；若重新测试的Ct值=40，则判定为阴性。

（规范性）

斯里兰卡木薯花叶病毒分子检测报告表斯里兰卡木薯花叶病毒分子检测报告表见E.1植物名称品种