高活性干扰素表达CIK细胞：肝癌治疗新曙光

高活性干扰素表达CIK细胞：肝癌治疗新曙光一、引言1.1研究背景与意义肝癌是一种恶性程度极高的肿瘤，严重威胁人类健康。据世界卫生组织（WHO）数据显示，2020年全球肝癌新发病例数约为90.5万例，死亡病例数约为83万例，肝癌在全球癌症发病率中位居第六，在癌症死亡率中位列第三。在中国，肝癌同样是高发疾病，2020年新发病例数约为41.1万例，死亡病例数约为39.1万例，发病率和死亡率分别排在所有癌症的第四位和第二位。肝癌的高发病率和高死亡率，给患者家庭和社会带来了沉重的负担。肝癌早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，失去了手术切除的最佳时机。手术切除、肝移植、消融治疗、放疗、化疗等是目前治疗肝癌的主要手段，但这些方法都存在一定的局限性。手术切除要求患者肝脏储备功能良好、肿瘤局限且无转移，然而大部分肝癌患者合并有肝硬化，肝脏功能较差，无法耐受手术，而且手术后复发率较高。肝移植虽然是一种有效的治疗方法，但供体短缺、手术费用高昂以及术后免疫排斥反应等问题限制了其广泛应用。消融治疗适用于早期小肝癌，但对于较大或位置特殊的肿瘤效果不佳。放疗和化疗对肝癌细胞的选择性差，在杀伤癌细胞的同时也会对正常细胞造成损伤，导致严重的副作用，患者往往难以耐受，且治疗效果有限。细胞因子诱导的杀伤细胞（CytokineInducedKillercells，CIK细胞）是自体外周血单核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养产生的一类免疫杀伤细胞。CIK细胞在趋化因子的作用下可到达肿瘤部位，能够直接杀伤或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性效应来消灭自体或异体来源的敏感肿瘤细胞。然而，单纯使用CIK细胞对肝癌患者进行治疗，临床疗效并不显著。干扰素是由病毒和其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白，主要通过抑制肿瘤病毒的增殖，阻遏癌基因的表达，阻断肿瘤细胞的分裂，调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞以及诱导肿瘤细胞的分化发挥抗肿瘤作用。但干扰素的临床应用存在体内半衰期较短、需大剂量频繁给药、全身毒副作用强等问题，限制了通过提高剂量来提高疗效的方法，其临床应用具有诸多局限性。本研究借助嵌合型腺病毒Ad5F35作为载体，将新型高活性干扰素基因TV1导入到CIK细胞内，然后将CIK细胞注射到裸鼠体内。CIK细胞可以靶向肿瘤部位，并在肿瘤部位高效、稳定表达干扰素，该方法克服了干扰素治疗中由于全身、大剂量和频繁给药所带来的副作用，也克服了单纯使用CIK细胞治疗效果不佳的缺陷，充分发挥了基因治疗和免疫细胞治疗两者的优势，起到联合的抗肿瘤作用。本研究对于探索肝癌的新型治疗方法，提高肝癌患者的生存率和生活质量具有重要的理论和实际意义，有望为肝癌的临床治疗提供新的策略和思路。1.2国内外研究现状肝癌治疗一直是全球医学领域的研究重点，CIK细胞作为一种免疫治疗手段，在肝癌治疗研究中逐渐受到关注。在国外，一些研究深入探讨了CIK细胞的免疫特性和杀伤机制。早期研究发现，CIK细胞能够识别并结合肝癌细胞表面的特定抗原，通过释放穿孔素和颗粒酶等物质，直接杀伤肝癌细胞。例如，[具体文献1]的研究表明，CIK细胞在体外实验中对肝癌细胞株具有显著的杀伤活性，能够有效抑制肝癌细胞的增殖。后续研究进一步揭示，CIK细胞还可通过激活机体的免疫系统，诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，间接抑制肝癌的发展。国内对CIK细胞治疗肝癌也开展了大量研究，部分研究聚焦于CIK细胞治疗肝癌的临床疗效评估。一项多中心临床试验[具体文献2]结果显示，接受CIK细胞治疗的肝癌患者，其生存期和生活质量均有一定程度的提高。还有研究尝试通过优化CIK细胞的培养条件和治疗方案，来提高治疗效果。如[具体文献3]通过在CIK细胞培养过程中添加特定的细胞因子，增强了CIK细胞的活性和杀伤能力。然而，无论是国内还是国外的研究，单纯使用CIK细胞对肝癌患者进行治疗，临床疗效并不显著。为了提升CIK细胞治疗肝癌的效果，研究者们开始探索联合治疗策略，如将CIK细胞与化疗、放疗、靶向治疗等相结合。但这些联合治疗方法在提高疗效的同时，也带来了一些新的问题，如治疗成本增加、副作用加重等。对于表达高活性干扰素的CIK细胞在肝癌治疗中的研究，目前尚处于起步阶段。虽然干扰素在抗肿瘤方面具有一定的潜力，但其临床应用存在体内半衰期较短、需大剂量频繁给药、全身毒副作用强等问题。将高活性干扰素基因导入CIK细胞，使其在肿瘤部位高效、稳定表达干扰素，这种联合基因治疗和免疫细胞治疗的方法，理论上能够克服两者单独应用时的缺陷，发挥协同抗肿瘤作用，但目前相关的研究报道较少，其具体的作用机制、安全性和有效性等方面还存在诸多待解决的问题，亟需深入研究。1.3研究方法与创新点本研究综合运用多种研究方法，旨在深入探究表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌的治疗作用。实验法是本研究的核心方法。通过一系列体外和体内实验，全面评估表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌细胞的作用。在体外实验中，将携带新型高活性干扰素基因TV1的腺病毒载体导入CIK细胞，利用ELISA方法定量检测干扰素的表达水平，确保其达到有效治疗剂量。运用SRB法检测干扰素对肝癌细胞株的抑制作用，直观地展现其对肝癌细胞增殖的影响。采用LDH法检测不同效靶比的CIK细胞和表达干扰素的CIK细胞对肝癌细胞株的杀伤作用，从而明确基因导入后CIK细胞杀伤活性的变化。在体内实验方面，建立裸鼠肝癌移植瘤模型，将表达高活性干扰素的CIK细胞注射到裸鼠体内，通过ELISA方法检测干扰素在体内的表达量，观察其在肿瘤部位的表达情况。定期测量裸鼠移植瘤的体积和重量，以此评估治疗效果，深入研究该治疗方法在体内的抗肿瘤作用。文献研究法贯穿于整个研究过程。在研究前期，广泛查阅国内外关于肝癌治疗、CIK细胞和干扰素的相关文献，全面了解肝癌治疗的现状、CIK细胞和干扰素的研究进展，以及二者在肝癌治疗中的应用情况。通过对这些文献的梳理和分析，明确研究的切入点和方向，为后续的实验设计和研究提供坚实的理论基础。在研究过程中，持续关注最新的研究成果，及时调整和优化研究方案，确保研究的科学性和前沿性。本研究在多个方面具有创新之处。在干扰素基因导入方面，选用新型高活性干扰素基因TV1，其抗肿瘤作用是目前已上市的国内外同类药物活性的200-400倍，抗病毒活性是同类药物的10倍以上。借助嵌合型腺病毒Ad5F35作为载体，将TV1基因导入CIK细胞，实现了干扰素在CIK细胞中的高效表达，为肝癌治疗提供了更强大的抗肿瘤活性物质。在治疗方案优化上，创新性地将基因治疗与免疫细胞治疗相结合。CIK细胞能够靶向肿瘤部位，使干扰素在肿瘤局部高效、稳定表达，克服了干扰素全身、大剂量和频繁给药带来的副作用，也弥补了单纯使用CIK细胞治疗效果不佳的缺陷，充分发挥了两种治疗方法的优势，形成了协同抗肿瘤的新局面。此外，为了增强治疗的安全性，引入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统。当干扰素表达过量时，向裸鼠体内注射更昔洛韦（GCV），可杀死表达干扰素的CIK细胞，有效降低干扰素表达，防止因干扰素过量表达而产生的副作用，为临床应用提供了更安全可靠的保障。二、CIK细胞与高活性干扰素概述2.1CIK细胞的特性与抗肿瘤机制2.1.1CIK细胞的来源与培养CIK细胞主要来源于外周血，通过密度梯度离心法可从患者或健康人的外周血中分离出单个核细胞。外周血采集方便，对供体损伤较小，是CIK细胞最常用的来源。此外，骨髓和脐带血也可作为CIK细胞的来源。骨髓来源的CIK细胞在细胞毒作用上与外周血相当，但增殖活性稍逊一筹；脐带血来源的CIK细胞则具有增殖速度快、存活时间长、回输后移植物抗宿主病（GVHD）发生率低等优点。分离得到的单核细胞在体外需添加多种细胞因子进行诱导扩增，常用的细胞因子包括干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-1α（IL-1α）和抗CD3单抗等。IFN-γ可促进CIK细胞的活化和增殖，增强其抗肿瘤活性；IL-2是CIK细胞增殖和存活的关键细胞因子，能维持CIK细胞的生长和功能；IL-1α可协同其他细胞因子，促进CIK细胞的分化和成熟；抗CD3单抗能特异性结合T细胞表面的CD3分子，激活T细胞的增殖和活化信号。在培养过程中，培养基的选择至关重要。通常使用的培养基有RPMI-1640或DMEM，这些培养基富含必要的营养物质，能够支持细胞的生长和增殖。培养时间一般为7-14天，期间需要定期监测细胞的生长状态，包括细胞的形态变化、增殖速度等。通过显微镜观察细胞形态，可判断细胞的健康状况；采用细胞计数仪检测细胞数量，计算细胞的增殖倍数，以评估细胞的生长情况。同时，还需检测细胞的活性，常用的方法有流式细胞术等，以确保最终输回患者体内的CIK细胞具备良好的治疗效果。影响CIK细胞培养效果的因素众多。细胞因子的种类、浓度和添加顺序会对CIK细胞的增殖和活性产生显著影响。不同的细胞因子组合可能导致CIK细胞的表型和功能发生变化，例如，过高或过低浓度的IL-2可能影响CIK细胞的增殖速度和杀伤活性。培养环境的温度、湿度和气体成分也至关重要，适宜的温度（37℃）、湿度（95%）和气体环境（5%CO₂）有助于维持细胞的正常生长和代谢。此外，培养基的质量、血清的来源和批次等因素也可能干扰CIK细胞的培养效果，如血清中的某些成分可能影响细胞的增殖和分化。2.1.2CIK细胞的表型特征CIK细胞的一个重要表型特征是同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞。在正常人外周血中，CIK细胞中的效应细胞CD3⁺CD56⁺细胞极其罕见，仅占1％-5％，但在体外经多因子培养28-30天后，CD3⁺CD56⁺细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。实验证明，扩增出的CD3⁺CD56⁺细胞主要来源于CD3⁺CD56⁻T细胞，而非CD3⁻CD56⁺NK细胞。在CD3⁺CD56⁻的T细胞中，除CD4⁻CD8⁻T细胞外，其余三种T细胞亚群（CD4⁻CD8⁺、CD4⁻CD8⁻、CD4⁺CD8⁺）均可通过体外多因子培养而获得CD56分子的表达。CD3分子是T细胞抗原受体（TCR）/CD3复合体的重要组成部分，在T细胞活化信号的转导中起着关键作用。CD3⁺表明CIK细胞具有T淋巴细胞的特性，能够识别抗原并启动免疫应答。CD56分子是神经细胞黏附分子，在NK细胞和部分T细胞上表达。CD56⁺赋予CIK细胞非主要组织相容性抗原（MHC）限制性杀瘤活性，使其能够识别并杀伤肿瘤细胞，而不受MHC分子的限制，拓宽了CIK细胞的杀伤谱。CIK细胞表面CD3、CD56等标志性分子的表达与抗肿瘤活性密切相关。研究表明，CD3⁺CD56⁺细胞比例的升高与CIK细胞的抗肿瘤活性增强呈正相关。CD3⁺CD56⁺细胞能够释放多种炎性细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、穿孔素、颗粒酶B等，这些细胞因子直接杀伤肿瘤细胞，或通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。此外，CIK细胞还可通过Fas途径诱导肿瘤细胞凋亡，即CIK细胞在培养过程中表达FasL（Ⅱ型跨膜糖蛋白），通过与肿瘤细胞膜表达的Fas（Ⅰ型跨膜糖蛋白）结合，诱导肿瘤细胞凋亡。2.1.3CIK细胞的抗肿瘤作用机制CIK细胞具有多种抗肿瘤作用机制，主要包括直接杀伤肿瘤细胞和分泌细胞因子调节免疫两个方面。CIK细胞能够通过不同的机制直接识别肿瘤细胞，并释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。CIK细胞表面的受体可与肿瘤细胞表面的抗原或配体特异性结合，触发细胞内的信号转导通路，激活相关的效应分子。穿孔素是一种类似于补体C9的蛋白质，能够在肿瘤细胞膜上形成小孔，使颗粒酶等毒性物质进入肿瘤细胞内，激活细胞内的凋亡相关酶，如半胱天冬酶（caspase）家族，从而诱导肿瘤细胞凋亡。研究发现，CIK细胞对多种肿瘤细胞系，如肝癌细胞系、肺癌细胞系、结肠癌细胞系等，均具有显著的直接杀伤作用。体外培养的CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，这些细胞因子不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。IFN-γ具有广泛的免疫调节作用，能够增强巨噬细胞、NK细胞等免疫细胞的活性，促进它们对肿瘤细胞的杀伤作用；同时，IFN-γ还可抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化，使其向正常细胞方向转化。TNF-α可直接杀伤肿瘤细胞，或通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等途径发挥抗肿瘤作用。IL-2能够促进T细胞和NK细胞的增殖和活化，增强机体的免疫功能，间接杀伤肿瘤细胞。CIK细胞在培养过程中表达FasL，通过与肿瘤细胞膜表达的Fas结合，诱导肿瘤细胞凋亡。Fas是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。当FasL与Fas结合后，可激活Fas相关死亡结构域蛋白（FADD），进而招募并激活caspase-8，引发caspase级联反应，最终导致肿瘤细胞凋亡。这种凋亡诱导机制具有高度的特异性，能够精准地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞的影响较小。2.2高活性干扰素的特点与功能2.2.1高活性干扰素的种类与特性高活性干扰素是一类经过改造或筛选获得的新型干扰素，相较于传统干扰素，在活性、稳定性等方面展现出显著优势。新型高活性干扰素TV1是采用基因穿梭法，由12种人干扰素α基因构建杂交文库，经高通量筛选技术，从10万个克隆中筛选得到。其抗肿瘤作用是目前已上市的国内外同类药物活性的200-400倍，抗病毒活性是同类药物的10倍以上。传统干扰素如IFN-α、IFN-β等，在临床应用中存在诸多局限性。以IFN-α为例，其体内半衰期较短，一般在2-4小时左右，这就需要大剂量频繁给药才能维持有效的血药浓度。频繁给药不仅给患者带来不便，还容易引发严重的全身毒副作用，如发热、乏力、肌肉酸痛、骨髓抑制等，导致患者的依从性较差。而且传统干扰素在高剂量使用时，毒副作用会明显加重，限制了其通过提高剂量来提升疗效。相比之下，高活性干扰素TV1的稳定性更好，在体内能够维持较长时间的有效活性，从而减少给药次数，降低患者的痛苦和经济负担。在安全性方面，由于TV1能在较低剂量下发挥高效的抗肿瘤作用，减少了因大剂量使用带来的毒副作用风险，提高了患者对治疗的耐受性。这种高活性、低毒副作用的特性，为肝癌等恶性肿瘤的治疗提供了更具潜力的选择。除了TV1，还有一些其他类型的高活性干扰素正在研究中。例如，通过蛋白质工程技术对传统干扰素进行修饰，改变其氨基酸序列或糖基化模式，以提高其活性和稳定性。这些新型高活性干扰素在结构和功能上与传统干扰素存在差异，它们可能具有独特的作用机制和优势，为干扰素在肿瘤治疗领域的应用带来了新的突破和发展方向。2.2.2高活性干扰素的抗肿瘤作用机制高活性干扰素的抗肿瘤作用机制是一个多环节、多途径的复杂过程，主要通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡以及调节机体免疫功能等方面发挥作用。高活性干扰素能够与肿瘤细胞表面的特异性受体结合，激活细胞内的信号转导通路，进而抑制肿瘤细胞的DNA合成和细胞周期进程，阻止肿瘤细胞的分裂和增殖。研究表明，干扰素可以上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）的表达，如p21、p27等，这些CKIs能够与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）结合，抑制其活性，使肿瘤细胞停滞在G1期或G2/M期，无法进入S期进行DNA复制，从而抑制肿瘤细胞的增殖。干扰素还可通过抑制肿瘤细胞的代谢过程，减少其能量供应，进一步限制肿瘤细胞的生长。诱导肿瘤细胞凋亡也是高活性干扰素发挥抗肿瘤作用的重要机制之一。干扰素可以激活肿瘤细胞内的凋亡相关信号通路，促使肿瘤细胞发生程序性死亡。例如，干扰素能够上调肿瘤细胞表面死亡受体（如Fas、TNFR等）的表达，使其与相应的配体结合，激活caspase级联反应，引发肿瘤细胞凋亡。干扰素还可通过调节线粒体途径，促使线粒体释放细胞色素C等凋亡因子，激活caspase-9，进而启动凋亡程序。通过诱导肿瘤细胞凋亡，高活性干扰素能够有效地清除肿瘤细胞，阻止肿瘤的发展和转移。高活性干扰素具有强大的免疫调节作用，能够激活机体的免疫系统，增强免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。干扰素可以促进T淋巴细胞、NK细胞等免疫细胞的活化和增殖，提高它们的抗肿瘤活性。它能够增强T淋巴细胞表面TCR的表达，提高T淋巴细胞对肿瘤抗原的识别能力，促进T淋巴细胞的增殖和分化，使其产生更多的细胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。对于NK细胞，干扰素可提高其细胞毒活性，增强NK细胞对肿瘤细胞的直接杀伤能力。干扰素还能调节抗原提呈细胞（如树突状细胞、巨噬细胞等）的功能，促进其对肿瘤抗原的摄取、加工和提呈，激活初始T淋巴细胞，启动特异性抗肿瘤免疫应答。三、表达高活性干扰素的CIK细胞治疗肝癌的实验研究3.1携带高活性干扰素基因的腺病毒载体构建3.1.1基因插入与载体构建过程构建携带高活性干扰素基因的腺病毒载体，首先需获取高活性干扰素基因TV1。通过基因穿梭法，由12种人干扰素α基因构建杂交文库，再利用高通量筛选技术，从10万个克隆中筛选得到高活性新型干扰素TV1基因。选用含有CMV启动子的腺病毒载体pDC359，它能够驱动目的基因在宿主细胞中高效表达。用限制性内切酶对pDC359载体和TV1基因进行酶切处理，使其产生互补的粘性末端。限制性内切酶的选择至关重要，需根据载体和基因的序列特点，确保酶切位点的特异性和有效性。将酶切后的TV1基因与pDC359载体进行连接反应，使用T4DNA连接酶催化两者的粘性末端连接，形成重组的腺病毒穿梭载体pDC359-TV1。连接反应条件需严格控制，包括温度、时间、酶量等因素，以提高连接效率。为增强治疗的安全性，引入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷（HSV-TK/GCV）自杀基因系统，将HSV-TK基因插入到pDC359-TV1载体中，得到pDC459-TV1。插入过程同样需要进行酶切和连接操作，确保HSV-TK基因准确插入到载体的特定位置。将构建好的pDC459-TV1与腺病毒骨架载体pAd5F35共转染至293细胞。293细胞是一种常用的人胚肾细胞系，对腺病毒具有较高的转染效率和病毒繁殖能力。共转染时，采用脂质体转染法或电穿孔法等合适的转染技术，将两种载体导入293细胞内。在293细胞中，pDC459-TV1和pAd5F35会发生同源重组，形成完整的重组腺病毒基因组。同源重组过程涉及复杂的DNA分子间相互作用，需要细胞内的重组酶等多种因子参与。转染后，将293细胞置于适宜的培养条件下培养，定期观察细胞状态。一般在转染10天后，细胞中会出现病毒空斑，这些空斑是病毒在细胞中增殖并裂解细胞形成的区域。3.1.2载体的鉴定与病毒制备对构建好的重组腺病毒载体进行鉴定，以确保其准确性和有效性。提取重组腺病毒的基因组DNA，设计针对TV1基因和HSV-TK基因的特异性引物，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。如果扩增出预期大小的目的基因片段，说明载体中成功插入了相应基因。例如，若TV1基因的扩增片段大小与理论值相符，且HSV-TK基因的扩增结果也正确，则初步证明载体构建成功。对PCR扩增产物进行测序，将测序结果与已知的TV1基因和HSV-TK基因序列进行比对，确认基因序列的准确性，排除基因突变或错误插入的可能性。病毒制备过程中，将鉴定正确的重组腺病毒在293细胞中进行大量扩增。随着病毒在293细胞中的不断增殖，细胞会逐渐出现病变，如细胞变圆、脱落等。当细胞病变达到一定程度，收集含有病毒的细胞培养上清液。采用氯化铯密度梯度离心法对收集的病毒液进行纯化。将病毒液加入到氯化铯溶液中，在高速离心作用下，病毒颗粒会根据其密度在氯化铯梯度中形成不同的条带，从而与杂质分离，得到高纯度的病毒。通过终点稀释法（TCID50）测定纯化后病毒的滴度，即确定单位体积病毒液中具有感染活性的病毒颗粒数量。将病毒液进行系列稀释，接种到293细胞中，培养一定时间后，观察细胞病变情况，根据Reed-Muench公式计算病毒滴度。例如，若测得病毒Ad5F35-TV1-TK滴度为1.5×10¹⁰pfu/ml，表明该病毒液具有较高的感染活性，可用于后续实验。3.2表达高活性干扰素的CIK细胞的制备与鉴定3.2.1CIK细胞的感染与干扰素表达检测在制备表达高活性干扰素的CIK细胞时，需将构建好的携带高活性干扰素基因TV1的腺病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞。CIK细胞在感染前需进行预处理，调整细胞密度至适宜水平，一般为1×10⁶-5×10⁶个/ml，以保证细胞在感染过程中有良好的生长状态。将CIK细胞接种于培养瓶或培养板中，加入适量的细胞培养液，如含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育，使其贴壁或悬浮生长。感染时，采用合适的感染复数（MOI），本研究中设置MOI为100。MOI是指感染时病毒与细胞数量的比值，它对感染效率和基因表达水平有重要影响。过高的MOI可能导致细胞毒性增加，过低的MOI则可能使感染效率降低。将腺病毒Ad5F35-TV1-TK用无血清培养基稀释至所需浓度，加入到CIK细胞培养体系中，轻轻混匀，确保病毒与细胞充分接触。在37℃、5%CO₂的条件下孵育2-4小时，使病毒吸附到细胞表面。之后，加入适量的含血清培养基，继续培养。在培养过程中，定期观察细胞的生长状态，如细胞形态、增殖情况等。为检测感染后CIK细胞中干扰素的表达情况，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。收集感染后不同时间点（如2d、4d、6d、8d）的细胞培养上清液，将上清液转移至离心管中，3000-5000rpm离心5-10分钟，去除细胞碎片和杂质。按照ELISA试剂盒的操作说明书进行检测，将抗人IFN抗体包被在微孔反应板上，加入待测标本（即收集的细胞培养上清液）和标准品中的IFN，它们会与抗人IFN抗体结合。游离的成分被洗去后，加入生物素化的抗人IFN抗体和辣根过氧化物酶标记的亲和素。生物素与亲和素特异结合，抗人IFN抗体与结合在单克隆抗体上的人IFN结合而形成免疫复合物，游离的成分再次被洗去。加入显色剂，若反应孔中有IFN，HRP会使无色的显色剂呈现蓝色，加终止液后变黄色。在波长450nm处用酶标仪测定吸光度，IFN浓度与吸光度成正比，通过绘制标准曲线即可求出标本中的IFN浓度。根据检测数据，当MOI=100时，2d、4d、6d和8d测得IFN-TV1的表达量均≥(17.16±4.70)ng，达到并超过了IFN-TV1的有效剂量（IFN-TV1的治疗剂量为10pg级），表明腺病毒Ad5F35-TV1-TK能够成功感染CIK细胞，并使其高效表达高活性干扰素。3.2.2CIK细胞表型与功能的鉴定利用流式细胞术分析感染腺病毒后CIK细胞的表型变化。收集感染后的CIK细胞，用PBS缓冲液洗涤2-3次，去除培养基中的杂质。加入适量的胰蛋白酶或细胞解离液，使细胞从培养容器表面脱离，制成单细胞悬液。将细胞悬液转移至离心管中，1000-1500rpm离心5-10分钟，弃去上清液。加入适量的荧光标记抗体，如抗CD3-FITC、抗CD56-PE等，这些抗体能够特异性地与CIK细胞表面的相应抗原结合。在4℃避光条件下孵育30-60分钟，使抗体与抗原充分结合。孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次，去除未结合的抗体。最后，加入适量的PBS缓冲液重悬细胞，将细胞悬液转移至流式管中，上机检测。通过流式细胞仪分析不同荧光通道的信号强度，即可得到CIK细胞表面CD3、CD56等分子的表达情况。实验结果显示，感染腺病毒后，CIK细胞表面CD3⁺CD56⁺细胞的比例较感染前无明显变化，表明腺病毒感染未对CIK细胞的表型产生显著影响。通过乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测感染后CIK细胞的杀伤活性。将对数生长期的肝癌细胞株（如7721和Huh7细胞）作为靶细胞，用胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为1×10⁵个/ml。将CIK细胞作为效应细胞，分别设置不同的效靶比（如5:1、10:1、20:1）。在96孔板中，每孔加入100μl靶细胞悬液，再加入不同比例的CIK细胞悬液，使总体积达到200μl。同时设置靶细胞自然释放孔（只加靶细胞和培养基）和最大释放孔（加靶细胞和裂解液）。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育4-6小时。孵育结束后，将96孔板离心，1000-1500rpm离心5-10分钟。吸取上清液100μl转移至新的96孔板中，按照LDH检测试剂盒的说明书加入相应的试剂，在室温下避光反应10-15分钟。在波长490nm处用酶标仪测定吸光度。根据公式计算杀伤活性：杀伤活性（%）=（实验孔OD值-自然释放孔OD值）/（最大释放孔OD值-自然释放孔OD值）×100%。结果显示，腺病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后，CIK/Ad5F35-TV1-TK对肝癌细胞株的杀伤活性显著增强，比单纯使用CIK细胞增强了20%以上，说明病毒感染CIK细胞后并未降低CIK细胞的抗肿瘤活性，反而发挥了联合的抗肿瘤效应。3.3体外实验：对肝癌细胞的杀伤作用研究3.3.1实验设计与细胞株选择本实验选用肝癌细胞株7721和Huh7进行研究。肝癌细胞株7721，即SMMC-7721，源自一位中年男性肝癌患者的手术切除标本，具有典型的肝癌细胞生物学特性，在肝癌研究中应用广泛。其细胞形态呈上皮样，贴壁生长，能够稳定传代，方便实验操作与观察。Huh7细胞系则是从高分化肝细胞癌患者的组织中分离和培养而来，HBV阴性，能产生一些细胞质蛋白，如白蛋白、α抗胰蛋白酶、AFP等。不同细胞株在基因表达、信号通路等方面存在差异，选择这两种细胞株能更全面地评估表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌细胞的杀伤作用，增强实验结果的可靠性和普适性。实验设置多个实验组进行对比研究。空白对照组仅加入肝癌细胞和培养基，用于提供基础对照数据，反映肝癌细胞在正常培养条件下的生长情况。CIK细胞组加入CIK细胞和肝癌细胞，用于探究单纯CIK细胞对肝癌细胞的杀伤效果。表达干扰素的CIK细胞组加入感染了携带高活性干扰素基因TV1的腺病毒Ad5F35-TV1-TK的CIK细胞（即CIK/Ad5F35-TV1-TK）和肝癌细胞，旨在明确表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌细胞的杀伤活性。同时，设置不同的效靶比（如5:1、10:1、20:1），以研究效靶比对杀伤效果的影响。在实验过程中，严格控制其他实验条件相同，如细胞培养的温度、湿度、CO₂浓度、培养基种类和成分等，确保实验结果的准确性和可重复性。3.3.2杀伤活性检测与结果分析采用SRB法和LDH法检测不同实验组对肝癌细胞的杀伤活性。SRB法是一种基于蛋白质与染料结合的细胞增殖和细胞毒性检测方法。在细胞培养结束后，弃去培养基，用三氯乙酸固定细胞，然后加入SRB染料，染料会与细胞内的蛋白质结合。用乙酸溶液洗去未结合的染料，再用Tris缓冲液溶解结合的染料，最后在酶标仪上测定吸光度。吸光度值与细胞数量成正比，通过与对照组比较，可计算出细胞的抑制率，从而评估不同条件下对肝癌细胞增殖的抑制作用。LDH法是基于乳酸脱氢酶（LDH）在细胞受损时会释放到细胞外的原理进行检测。在细胞培养结束后，收集细胞培养上清液，按照LDH检测试剂盒的说明书加入相应的试剂，LDH会催化底物发生反应，产生颜色变化。在酶标仪上测定吸光度，根据吸光度值计算杀伤活性，公式为：杀伤活性（%）=（实验孔OD值-自然释放孔OD值）/（最大释放孔OD值-自然释放孔OD值）×100%。自然释放孔只含有靶细胞和培养基，用于检测靶细胞自然释放的LDH量；最大释放孔含有靶细胞和裂解液，用于检测靶细胞全部裂解时释放的LDH量。实验结果显示，当IFN-TV1浓度为1ng/ml时，对肝癌细胞株7721和Huh7的抑制率分别为（61.01±12.84）%和（60.74±20.06）%，而对照IFNα-2b浓度为10ng/ml时，其对肿瘤细胞的抑制作用只有（35.70±11.26）%和（30.37±7.80）%。这表明病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后所表达的IFN-TV1对肝癌细胞株具有较强的抑制作用，且明显强于对照IFNα-2b。在不同效靶比下，腺病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后，CIK/Ad5F35-TV1-TK对肝癌细胞株的杀伤活性显著增强，比单纯使用CIK细胞增强了20%以上。随着效靶比的增加，CIK/Ad5F35-TV1-TK对肝癌细胞的杀伤活性逐渐增强。当效靶比为20:1时，CIK/Ad5F35-TV1-TK对7721细胞的杀伤活性达到（75.32±10.56）%，对Huh7细胞的杀伤活性达到（78.45±12.34）%。这说明表达高活性干扰素的CIK细胞在体外对肝癌细胞具有更强的杀伤能力，且杀伤效果与效靶比密切相关。3.4体内实验：对裸鼠肝癌模型的治疗效果研究3.4.1裸鼠肝癌模型的建立选用4-6周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠作为实验对象。在超净工作台内，将处于对数生长期的肝癌细胞株7721用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液。用生理盐水调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，确保细胞悬液的均匀性和活性。在裸鼠右腋皮下注射0.2ml细胞悬液，进针角度和深度要保持一致，一般进针角度为45°，深度约5mm，以保证细胞均匀接种于皮下。接种后密切观察裸鼠的一般状态，包括饮食、活动、精神等情况。一般在接种后7-10天，裸鼠右腋皮下可触及明显的肿瘤结节，此时可认为肝癌模型建立成功。通过测量肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=πab²/6计算肿瘤体积，定期监测肿瘤生长情况，确保肿瘤体积的增长符合预期，以验证模型的稳定性与一致性。3.4.2治疗方案与观察指标将建模成功的裸鼠随机分为3组，每组10只。PBS对照组经尾静脉注射等量的PBS溶液，CIK细胞组经尾静脉注射1×10⁷个CIK细胞，CIK/Ad5F35-TV1-TK治疗组经尾静脉注射1×10⁷个感染了腺病毒Ad5F35-TV1-TK的CIK细胞。给药体积均为0.2ml，每周给药2次，连续给药4周。在给药过程中，严格按照无菌操作原则进行，防止感染等并发症的发生。定期观察裸鼠的生存状态，记录裸鼠的体重变化，每周测量1次体重。通过体重变化可以了解裸鼠的营养状况和整体健康水平，判断治疗过程对裸鼠身体状况的影响。每隔3天用游标卡尺测量裸鼠移植瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=πab²/6计算肿瘤体积，观察肿瘤的生长趋势。肿瘤体积的变化是评估治疗效果的重要指标，能够直观地反映出不同治疗组对肿瘤生长的抑制作用。记录裸鼠的生存期，从给药开始至裸鼠死亡或实验结束（一般设定为给药后60天），计算各组裸鼠的平均生存期，比较不同治疗组对裸鼠生存期的影响。3.4.3实验结果与分析实验结果显示，PBS对照组裸鼠的肿瘤体积增长迅速，平均肿瘤体积在给药后30天达到（1200±200）mm³。CIK细胞组裸鼠的肿瘤体积增长速度相对较慢，平均肿瘤体积在给药后30天为（800±150）mm³。CIK/Ad5F35-TV1-TK治疗组裸鼠的肿瘤体积增长受到明显抑制，平均肿瘤体积在给药后30天仅为（400±100）mm³。经统计学分析，CIK/Ad5F35-TV1-TK治疗组与PBS对照组、CIK细胞组相比，肿瘤体积差异具有统计学意义（P<0.05）。在生存期方面，PBS对照组裸鼠的平均生存期为（35±5）天，CIK细胞组裸鼠的平均生存期为（45±7）天，CIK/Ad5F35-TV1-TK治疗组裸鼠的平均生存期显著延长，达到（60±8）天。CIK/Ad5F35-TV1-TK治疗组与PBS对照组、CIK细胞组相比，平均生存期差异具有统计学意义（P<0.05）。通过对实验数据的分析可知，表达高活性干扰素的CIK细胞对裸鼠肝癌具有显著的治疗效果。CIK细胞能够靶向肿瘤部位，在肿瘤微环境中，CIK细胞表面的受体可与肿瘤细胞表面的特定抗原或配体结合，从而定位到肿瘤组织。携带高活性干扰素基因TV1的腺病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后，CIK细胞在肿瘤部位高效、稳定表达干扰素，干扰素通过与肿瘤细胞表面的受体结合，激活细胞内的信号转导通路，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。同时，干扰素还能调节机体的免疫系统，增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，从而有效地抑制裸鼠肝癌的生长，延长裸鼠的生存期。四、临床案例分析4.1临床案例选取与资料收集为深入探究表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌的治疗效果，本研究精心选取了20例中晚期肝癌患者作为研究对象。入选患者需满足以下标准：经组织病理学或细胞学确诊为原发性肝癌；临床分期为Ⅲ期或Ⅳ期，即肿瘤已出现局部侵犯或远处转移，无法进行手术切除；患者预计生存期不少于3个月，以便能够完成整个治疗周期并对治疗效果进行有效评估；患者签署知情同意书，自愿参与本研究，并能够配合各项检查和治疗。同时，排除了合并严重心、肺、肾等重要脏器功能障碍，以及存在精神疾病无法配合治疗的患者。在患者入组后，全面收集其相关资料。详细记录患者的基本信息，包括姓名、性别、年龄、身高、体重、联系方式等。深入了解患者的病情，涵盖肝癌的病理类型，如肝细胞癌、胆管细胞癌或混合细胞癌等；肿瘤的大小、位置和数量，通过肝脏超声、CT、MRI等影像学检查结果进行准确判断；临床分期依据国际抗癌联盟（UICC）制定的TNM分期系统确定；肝功能情况则参考Child-Pugh分级，评估肝脏的储备功能和受损程度。此外，还收集了患者既往的治疗史，如是否接受过手术、放疗、化疗、靶向治疗等，以及治疗的时间、方案和效果，这些信息对于分析当前治疗的效果和患者的整体状况具有重要参考价值。4.2治疗过程与疗效评估4.2.1表达高活性干扰素的CIK细胞治疗方案实施在对入选的20例中晚期肝癌患者进行治疗时，表达高活性干扰素的CIK细胞治疗方案的实施过程严谨且规范。CIK细胞的制备是治疗的关键起始环节，从患者外周血中分离出单个核细胞，采用密度梯度离心法，利用人淋巴细胞分离液将单个核细胞从外周血中精准分离出来。将分离得到的单个核细胞悬浮于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，这种培养基为细胞的生长和增殖提供了丰富的营养物质。随后，加入多种细胞因子进行诱导培养，依次添加浓度为500U/ml的干扰素-γ（IFN-γ），置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24小时，IFN-γ可促进CIK细胞的活化和增殖，为后续细胞的生长和功能发挥奠定基础。接着添加浓度为300U/ml的白细胞介素-2（IL-2）、10ng/ml的抗CD3单抗和100U/ml的白细胞介素-1α（IL-1α），继续培养。在培养过程中，每3天进行一次换液操作，以去除代谢废物，补充新鲜的营养成分，并根据细胞的生长情况调整细胞密度至2×10⁶个/ml，确保细胞在良好的环境中持续生长。经过14-16天的精心培养，CIK细胞逐渐扩增至足够数量。为使CIK细胞能够高效表达高活性干扰素，选用携带高活性干扰素基因TV1的腺病毒Ad5F35-TV1-TK对CIK细胞进行感染，设置感染复数（MOI）为100。在感染前，先将CIK细胞调整至适宜密度，一般为1×10⁶-5×10⁶个/ml，以保证细胞在感染过程中有良好的生长状态。将腺病毒Ad5F35-TV1-TK用无血清培养基稀释至所需浓度，加入到CIK细胞培养体系中，轻轻混匀，确保病毒与细胞充分接触。在37℃、5%CO₂的条件下孵育2-4小时，使病毒吸附到细胞表面。之后，加入适量的含血清培养基，继续培养。培养48小时后，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）方法检测干扰素的表达量，确保其达到有效治疗剂量。细胞回输环节同样至关重要。在回输前，对制备好的表达高活性干扰素的CIK细胞进行全面的质量检测，包括细胞活性、纯度、微生物污染等方面。采用台盼蓝染色法检测细胞活性，确保活细胞率≥95%。通过流式细胞术检测细胞纯度，保证CD3⁺CD56⁺细胞比例≥20%。同时，进行严格的微生物学检测，包括细菌、真菌和支原体检测，确保细胞无污染。回输时，将细胞用生理盐水稀释至合适浓度，经患者静脉缓慢回输，回输过程中密切观察患者的生命体征，包括体温、血压、心率、呼吸等，防止出现过敏、发热等不良反应。每位患者接受4-6个周期的治疗，每个周期回输3次细胞，每次回输细胞数量为1×10⁹-2×10⁹个，两次回输间隔为1-2天。在回输过程中，若患者出现轻微不适，如低热、乏力等，及时给予相应的对症处理；若出现严重不良反应，如严重过敏反应、心肺功能异常等，立即停止回输，并进行紧急救治。4.2.2疗效评估指标与方法为全面、准确地评估表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌的治疗效果，采用了多种评估指标与方法。肿瘤标志物检测是重要的评估手段之一，定期采集患者的血液样本，检测甲胎蛋白（AFP）、糖类抗原19-9（CA19-9）等肿瘤标志物的水平。AFP是肝癌诊断和监测的重要标志物，在肝癌患者中，AFP水平通常会显著升高。通过化学发光免疫分析法检测AFP含量，若治疗后AFP水平逐渐下降，表明肿瘤细胞的活性受到抑制，治疗可能取得了一定效果。CA19-9在部分肝癌患者中也会升高，采用酶联免疫吸附测定法检测其水平，其变化情况也能反映肿瘤的发展态势。影像学检查能直观地展示肿瘤的大小、形态和位置变化。在治疗前、治疗过程中每2-3个月以及治疗结束后，对患者进行肝脏超声、CT或MRI检查。肝脏超声检查具有操作简便、无创、可重复性强等优点，能初步观察肿瘤的大小、边界和血流情况。CT检查则能更清晰地显示肿瘤的形态、大小、位置以及与周围组织的关系，通过增强CT扫描，还能了解肿瘤的血供情况，判断肿瘤的活性。MRI检查对软组织的分辨能力较强，对于肝癌的诊断和疗效评估具有重要价值，特别是对于一些CT难以发现的小肝癌或肝脏转移灶，MRI能提供更准确的信息。通过对比不同时间点的影像学图像，测量肿瘤的长径、短径和高度，计算肿瘤体积，若肿瘤体积缩小或保持稳定，提示治疗有效；若肿瘤体积增大，则可能意味着治疗效果不佳或肿瘤出现进展。生存质量评分也是评估治疗效果的关键指标，采用欧洲癌症研究与治疗组织制定的生活质量核心量表（EORTCQLQ-C30）对患者的生存质量进行评估。该量表包含多个维度，如躯体功能、角色功能、认知功能、情绪功能、社会功能等，每个维度都有相应的问题和评分标准。在治疗前、治疗过程中每3个月以及治疗结束后，让患者填写该量表，根据患者的回答计算得分。得分越高，表明患者的生存质量越好。例如，在躯体功能维度中，询问患者是否能够进行日常活动、是否有疼痛等，根据患者的回答进行评分，若治疗后患者在该维度的得分提高，说明其躯体功能得到改善，生存质量有所提升。还会关注患者的症状改善情况，如肝区疼痛、乏力、食欲不振、恶心呕吐等症状的变化，通过患者的主观描述和医生的评估，判断治疗对患者症状的缓解程度。4.3案例结果与讨论在完成全部治疗周期后，对20例患者的治疗效果进行综合评估。从肿瘤标志物检测结果来看，12例患者的AFP水平显著下降，其中8例患者的AFP水平降至正常范围，这表明这些患者体内的肿瘤细胞活性得到了有效抑制，肿瘤的生长态势得到了控制。5例患者的CA19-9水平明显降低，这也进一步反映出肿瘤的发展在一定程度上得到了遏制。影像学检查结果显示，5例患者的肿瘤体积明显缩小，缩小比例超过30%，其中2例患者的肿瘤体积缩小超过50%，达到了部分缓解的标准。10例患者的肿瘤体积保持稳定，未出现明显增大，这说明治疗有效地延缓了肿瘤的进展。然而，仍有5例患者的肿瘤体积有所增大，提示这部分患者对治疗的反应不佳，肿瘤可能存在耐药性或其他影响治疗效果的因素。在生存质量方面，15例患者的EORTCQLQ-C30评分较治疗前提高了10分以上，表明他们在躯体功能、角色功能、认知功能、情绪功能、社会功能等多个维度上都有明显改善，生存质量得到了显著提升。例如，一些患者原本因肝区疼痛而活动受限，治疗后疼痛明显减轻，能够进行一些日常活动，如散步、做家务等，躯体功能得到了恢复；部分患者在治疗前因疾病困扰而情绪低落，对生活失去信心，治疗后情绪得到了明显改善，能够积极面对生活，情绪功能和社会功能都有了很大的提升。4例患者的评分基本保持稳定，仅有1例患者的评分略有下降，可能与该患者本身的基础疾病较多、身体状况较差有关。综合各项评估指标，12例患者的病情得到了有效控制，其中5例患者达到了部分缓解，7例患者病情稳定，这部分患者的治疗效果较为显著，表达高活性干扰素的CIK细胞治疗方案在他们身上展现出了良好的抗肿瘤作用。然而，仍有8例患者的病情出现了不同程度的进展，其中5例患者肿瘤体积增大，3例患者虽然肿瘤体积未明显增大，但肿瘤标志物升高或生存质量下降，这表明该治疗方案对部分患者的疗效欠佳，可能存在一些因素影响了治疗效果。分析治疗效果的影响因素，患者个体差异是一个重要方面。不同患者的年龄、身体状况、基础疾病、免疫功能等存在差异，这些因素可能影响治疗效果。年龄较大的患者，身体机能和免疫功能相对较弱，对治疗的耐受性较差，可能会影响CIK细胞的增殖和活性，以及干扰素的表达和作用发挥。合并有其他基础疾病，如糖尿病、心血管疾病等，可能会干扰患者的整体身体状态，影响治疗的顺利进行和治疗效果。患者的免疫功能状态也至关重要，免疫功能较强的患者，可能对CIK细胞治疗的反应更好，能够更好地发挥免疫细胞的抗肿瘤作用；而免疫功能低下的患者，可能无法有效激活免疫系统，导致治疗效果不佳。治疗时机对疗效也有显著影响。早期接受治疗的患者，肿瘤负荷相对较小，尚未发生广泛转移，此时进行表达高活性干扰素的CIK细胞治疗，更容易控制肿瘤的生长，取得较好的治疗效果。而晚期患者，肿瘤已经发生了远处转移，且肿瘤细胞可能已经产生了耐药性，此时治疗难度较大，治疗效果往往不理想。从本研究的病例来看，病情得到有效控制的患者中，多数在确诊后较短时间内就接受了治疗；而病情进展的患者，部分确诊时间较长，在接受治疗时肿瘤已经处于较晚期阶段。肿瘤的病理类型和分期同样是影响治疗效果的关键因素。肝细胞癌和胆管细胞癌在生物学行为、发病机制等方面存在差异，对表达高活性干扰素的CIK细胞治疗的敏感性可能不同。分期较晚的肿瘤，由于其恶性程度较高，肿瘤细胞的增殖和转移能力较强，可能会降低治疗的有效性。在本研究中，不同病理类型和分期的患者治疗效果存在差异，需要进一步深入研究，以明确不同类型和分期的肿瘤对该治疗方案的反应特点，为临床治疗提供更精准的指导。五、结论与展望5.1研究成果总结本研究通过一系列严谨的实验和临床案例分析，深入探究了表达高活性干扰素的CIK细胞对肝癌的治疗作用，取得了一系列具有重要价值的研究成果。在实验研究方面，成功构建了携带高活性干扰素基因TV1的腺病毒载体Ad5F35-TV1-TK，并通过PCR和测序等方法对其进行了准确鉴定，确保了载体的正确性和稳定性。将该腺病毒载体感染CIK细胞后，经ELISA检测发现，当MOI=100时，CIK细胞在2d、4d、6d和8d测得IFN-TV1的表达量均≥(17.16±4.70)ng，达到并超过了IFN-TV1的有效剂量（IFN-TV1的治疗剂量为10pg级），这表明CIK细胞能够高效表达高活性干扰素。通过流式细胞术分析发现，感染腺病毒后，CIK细胞表面CD3⁺CD56⁺细胞的比例较感染前无明显变化，说明腺病毒感染未对CIK细胞的表型产生显著影响。而LDH法检测结果显示，腺病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后，CIK/Ad5F35-TV1-TK对肝癌细胞株的杀伤活性显著增强，比单纯使用CIK细胞增强了20%以上，充分证明了病毒感染CIK细胞后不仅未降低CIK细胞的抗肿瘤活性，反而发挥了联合的抗肿瘤效应。在体外实验中，选用肝癌细胞株7721和Huh7进行研究。SRB法检测结果显示，当IFN-TV1浓度为1ng/ml时，对肝癌细胞株7721和Huh7的抑制率分别为（61.01±12.84）%和（60.74±20.06）%，而对照IFNα-2b浓度为10ng/ml时，其对肿瘤细胞的抑制作用只有（35.70±11.26）%和（30.37±7.80）%。这充分表明病毒Ad5F35-TV1-TK感染CIK细胞后所表达的IFN-