土沉香（白木香）品种鉴定 SSR标记法

1土沉香（白木香）品种鉴定SSR标记法本文件规定了利用简单重复序列（SSR）标记法进行土沉香（白木香Aquilariasinensis(Lour.)Spreng.）品种鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、引物信息、参照品种及使用、操作程序、结果统计和结果判定。本文件适用于土沉香品种的DNA分子数据采集和品种鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T66823术语和定义分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。3.1简单重复序列simplesequencerepeat；SSR基因组中由2个及以上核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA序列。[来源：NY/T2594—2016,3.2]3.2核心引物coreprimers品种鉴定时优先选用的一组SSR引物，具有多态性高、重复性好和分布均匀的特点。[来源：NY/T2594—2016,3.6,有修改]3.3扩展引物extendedprimers核心引物检测出不同品种差异位点数小于2时可选择的一组SSR引物，具有重复性好、分布均匀的特[来源：NY/T2594—2016,3.7,有修改]23.4参照品种referencevariety代表核心引物主要等位变异的一组样品。用于辅助确定待测品种在某个位点上扩增片段的大小，校正仪器设备的系统误差。[来源：NY/T2594—2016,3.9,有修改]3.5对照品种controlcultivar与待检样品近似的品种，用于与待检品种进行比对；或指已知品种中与待检品种相似度最高的品种。4缩略语下列缩略语适用于本文件。APS：过硫酸铵（AmmoniumPersulphate）bp：碱基对（BasePair）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosideTriphosphates）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（PolyacrylamideGelElectrophoresis）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）。SSR：简单重复序列（SimpleSequenceRepeat）Taq酶：耐热DNA聚合酶（Taq-DNAPolymerase）TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸盐-乙二胺四乙酸（Tris-Borate-EDTA）TE：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA）TEMED：四甲基乙二胺（N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine）Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)AminomethaneTHAM）5原理土沉香品种基因组存在着大量能够稳定遗传的SSR标记，不同土沉香品种在同一SSR位点的重复次数存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳等方法进行检测，进而区分不同的土沉香品种。6仪器设备及试剂仪器设备及试剂按照附录A的规定配置。7溶液配制3所有用水应符合GB/T6682的要求，按照附录B的规定配置溶液。8引物信息引物及序列应符合附录C的规定，引物相关信息见附录D。利用变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测时选择普通引物；利用荧光毛细管进行电泳检测时选择荧光标记引物，荧光标记位于正向引物5'端。构建数据库时，应使用全部引物；品种鉴定时，可利用附录C中的引物序贯检测，当检测到的差异位点数能判定送检样品与对照样品不同时，停止检测。9参照品种及使用参照品种用于辅助确定送检样品在某个位点的等位变异，宜与送检样品同时检测，参照品种相关信息见附录E。10操作程序10.1样品准备送检样品可为土沉香的嫩叶、枝条、果实等组织或器官,每份样品至少随机抽取3个单株,等量混合分析,必要时进行个体检测。10.2DNA提取取土沉香样品约200mg，剪碎，置入2mL的离心管中，在液氮冷冻下研磨成粉末。向研磨好的粉末中加800µLCTAB提取缓冲液和50µLβ-巯基乙醇，充分混匀。65℃水浴40min后，加800µL现配三氯甲烷/异戊醇（24∶1），振荡混匀，10000g离心10min。取上清液约500µL至一个新的1.5mL离心管中，加入600µL的预冷的异丙醇，颠倒混匀，_20℃放置30min后，10000g离心10min，弃上清液。用70%乙醇洗涤沉淀物2遍，弃乙醇。室温晾干后，加入50µLTE（pH8.0）溶液溶解DNA，检测浓度和纯度。-20℃保存备用。10.3PCR扩增10.3.1SSR引物选择首先选择附录C中核心位点引物进行扩增，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用扩展位点组的引物进行检测；若样品间检测出累计的差异位点小于2时，可以按照本文件的流程增加新的SSR引物进行检测。10.3.2PCR反应体系PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表1配制，可依据试验条件调整。4表1PCR扩增反应体系——10.3.3反应程序推荐PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸30s,共35个循环；72℃延伸10min；反应结束后4℃保存。反应程序中各反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同作适当调整。10.4PCR产物检测10.4.1PAGE银染检测10.4.1.1PAGE胶制备用洗洁精将玻璃板洗刷干净，再用双蒸水、75%乙醇冲洗3遍后，用胶架将两块玻璃板对齐夹紧，固定好。用移液枪将蒸馏水从左至右加入胶板，溢出，静置5min～10min，观察液面是否明显下降，若不下降则倒掉蒸馏水，用滤纸伸进胶板吸干残留水分。取100mL质量分数为6%的变性PAGE胶溶液，加入50µLTEMED和500µL质量分数为10%的APS，迅速混匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程中防止出现气泡。待胶室灌满后，在凹槽处将0.4mm厚鲨鱼齿梳子平齐端向里轻轻插入胶液约4mm，室温聚合1h以上，胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水洗净备用。10.4.1.2变性在20µLPCR产物中加入4µL6×加样缓冲液，混匀。在PCR扩增仪上运行95℃变性5min，4℃10.4.1.3电泳将配置好的PAGE胶板装入垂直电泳槽上，在电泳槽中加入1×TBE电泳缓冲液，使其没过电极线，800V恒压预电泳10min～20min。用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质后，在胶板两侧的样孔中加入5µL的DNAMaker，在中间的样孔中加入3µL的PCR扩增产物，除送检样品外，还宜同时加入参照品种扩增产物。1200V恒压电泳，电泳时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围（见附录D）加以确定。二甲苯青指示带在质量分数为6%PAGE胶电泳的泳动位置与230bp扩增产物泳动的位置大致相当。扩增产物片段大小在（100±30）bp、（150±30）bp、（200±30）bp、（250±30）bp范围的电泳参考时间分别约为1.5h、2.0h、2.5h、3.5h，当等位变异碱基对数差异较小时，可适当延长电泳时间。电泳结束后关闭电源，取下玻璃板并轻轻撬开，凝胶附着在长玻璃板上。510.4.1.4染色将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入染色液中，轻摇染色槽，使染色液均匀覆盖胶板，置于摇床上染色5min～10min。然后将胶板移入双蒸水中快速漂洗，时间不超过10s。再将胶板移入显影液中，轻摇显影槽，使显影液均匀覆盖胶板，待带型清晰，将胶板移入双蒸水中漂洗5min，晾干胶板，放在胶片观察灯上观察记录结果，拍照保存。10.4.2毛细管电泳检测10.4.2.1PCR产物样品准备取2µLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测（1%浓度），通过PCR产物条带的亮度对各荧光PCR产物进行稀释，得到浓度均一的荧光PCR产物。吸取1µL稀释至统一浓度的PCR产物加入到DNA分析仪专用96孔板中。板中各孔分别加入0.1µL分子量内标和8.9µL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出后立即置于碎冰上，冷却10min以上，瞬时离心10s后备用。10.4.2.2电泳打开DNA分析仪，检查仪器工作状态和试剂状态，将装有样品的96孔上样板放置于样品架基座上，打开数据收集软件，按照仪器使用手册，编辑样品表，执行运行程序，DNA分析仪将自动运行，并保存电泳原始数据。11结果统计11.1等位变异确定每个SSR位点的等位变异参照扩增片段大小确定，见附录D。对于变性PAGE，将送检样品在某一位点扩增片段的迁移位置与对应的参照品种进行比较，确定送检样品在该位点的等位变异。对于荧光毛细管电泳，通过参照品种消除不同批次或者不同型号DNA分析仪可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取送检样品在该位点的等位变异。11.2结果记录纯合位点的等位变异数据记录为X/X，杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上的两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后。缺失位点的等位变异数据记录为0/0。示例1：样品在某个位点上仅出现一个等位变异，为160bp，则该位点的等位变异数据记录为160/160。示例2：样品在某个位点上有两个等位变异，分别为160bp、165bp，则该位点的等位变异数据记录为160/165。12结果判定12.1判定规则使用本文件规定的SSR引物组进行检测，按以下规则判定待检品种与对照品种的异同：a)当品种间的差异谱带数≥2，判定为不同的品种；b)当品种间的差异谱带数＝1，判定为相近的品种；c)当品种间的差异谱带数＝0，判定为极近似品种或相同品种。6对于b)或c)的情况，可以按照本文件的操作程序,至少增加3对新的引物进行检测。对检验结果有争议时，应对留存样或在同一品种中重新随机加倍取样，复检1次，以复验结果为准。12.2结果表述根据结果统计和结果判定，填写土沉香（白木香）品种SSR分子鉴定报告，见附录F。（规范性）仪器设备及试剂A.1主要仪器设备A.1.1A.1.2A.1.3A.1.4A.1.5A.1.6A.1.7A.1.8A.1.9A.1.10A.1.11A.1.12A.1.13A.1.14A.1.15A.1.16A.1.17A.1.18A.1.19PCR扩增仪。高压电泳仪：最高电压不低于2000V，具有恒电压、恒电流和恒功率功能。垂直电泳槽及配套的制胶附件。普通电泳仪。DNA分析仪：基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，最低分辨率1bp。高速冷冻离心机；最大离心力不小于20000g。水平摇床。电子天平。微量移液器：规格分别为10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL，连续可调。磁力搅拌器。核酸浓度测定仪或紫外分光光度计。微波炉。高压灭菌锅。酸度计。普通冰箱。低温冰箱。制冰机。组织研磨仪。凝胶成像系统或紫外透射仪和照相机。A.2主要试剂除非另有说明，均使用分析纯试剂。A.2.1十六烷基三甲基溴化铵[CTAB，C16H33(CH3)3NBr，CAS号：57-09-0]。A.2.2三氯甲烷（CHCl3，CAS号：67-66-3）。A.2.3异戊醇（C5H12O，CAS号：123-51-3）。A.2.4异丙醇[(CH3)2CHOH，CAS号：67-63-0]。A.2.5乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na，C10H14N2Na2O8，CAS号：139-33-3）。A.2.6三羟甲基氨基甲烷（Tris，C4H11NO3，CAS号：77-86-1）。A.2.7浓盐酸（HCl，CAS号：7647-01-0）。A.2.8氢氧化钠（NaOH，CAS号：1310-73-2）。A.2.910×PCR缓冲液：含Mg2+25mmol/L。A.2.10A.2.11A.2.124种脱氧核糖核苷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。SSR引物。氯化钠（NaCl，CAS号：7647-14-5）。A.2.13TaqDNA聚合酶（Taq酶，CAS号：9012-90-2）。8A.2.14DNAMarker：DNA片段分布范围在50bp～500bp。A.2.15A.2.16A.2.17A.2.18A.2.19A.2.20A.2.21A.2.22A.2.23A.2.24A.2.25A.2.26A.2.27A.2.28A.2.29A.2.30A.2.31A.2.32A.2.33甲酰胺（CH3NO，CAS号：75-12-7）。溴酚蓝（C19H10Br4O5S，CAS号：115-39-9）。二甲苯青（C25H27N2NaO6S2，CAS号：2650-17-1）。甲叉双丙烯酰胺[(H2C=CHCONH)2CH2，CAS号：110-26-9]。丙烯酰胺（C3H5NO，CAS号：79-06-1）。硼酸（H3BO3，CAS号：10043-35-3）。尿素（CH4N2O，CAS号：57-13-6）。亲和硅烷。二甲基二氯硅烷（C2H6Cl2Si，CAS号：75-78-5）。无水乙醇（C2H6O，CAS号：64-17-5）。四甲基乙二胺（TEMED，C6H16N2，CAS号：110-18-9）。过硫酸铵[APS，(NH4)2S2O8，CAS号：7727-54-0]。冰醋酸（CH3COOH，CAS号：64-19-7）。硝酸银（AgNO3，CAS号：7761-88-8）。甲醛（HCHO，CAS号：50-00-0）。DNA分析仪用丙烯酰胺胶液。DNA分析仪用分子量内标。DNA分析仪用光谱校准基质。DNA分析仪用电泳缓冲液。9（规范性）溶液配制B.1DNA提取溶液配制B.1.10.5mol/LEDTA溶液称取186.1gNa2EDTA·2H2O溶于800mL水中，充分搅拌溶解，加NaOH调pH至8.0，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。B.1.20.5mol/LHCI溶液量取25mL浓盐酸（质量分数为36%～38%），加水定容至500mL。B.1.31mol/LTris-HCl溶液称取60.55g三羟甲基氨基甲烷(Tris碱)，溶于400mL水中，用0.5mol/L盐酸溶液(B.1.2)调pH至8.0，定容至500mL，在121℃条件下灭菌20min。B.1.41mol/LNaOH溶液称取40.0gNaOH溶于800mL水中，充分搅拌溶解，加水定容至1000mL。B.1.5CTAB提取液称取20.0gCTAB、81.7gNaCl置于1000mL烧杯中，量取140mL0.5mol/LEDTA溶液倒入烧杯中，加700mL水，充分搅拌溶解，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。B.1.6TE缓冲液量取5mL1mol/LTris-HCl溶液和1mL0.5mol/LEDTA溶液，加水定容至500mL，121℃高压灭菌20min，4℃保存。B.2PCR扩增试剂配制B.2.1dNTPs溶液分别配制dATP、dTTP、dCTP、dGTP终浓度为100mmol/L的储存液。各取20µL混合，加720µLTE缓冲液定容，配制成每种脱氧核糖核苷酸终浓度为2.5mmol/L的工作液，121℃高压灭菌20min，-20℃保存。B.2.2SSR引物溶液开盖前瞬时离心10s，按照说明书加TE缓冲液，分别配制正向引物和反向引物终浓度为100µmol/L的储存液。分别取10µL正向引物和反向引物储存液，加180µLTE缓冲液配制成终浓度5µmol/L的工作液。含500mmol/LKCl、100mmol/LTris-HCl(pH8.3)、0.01%明胶。在121℃条件下灭菌20mi保存。B.2.4氯化镁(MgCl2)溶液称取氯化镁1.19g用超