（正式版）DB31∕T 1194-2019 《猪增生性肠炎诊断技术规范》

2019-09-18发布2020-01-01实施上海市市场监督管理局发布 I 12规范性引用文件 3缩略语 14诊断方法 1 4.2聚合酶链式反应(PCR) 2 4.4免疫过氧化物酶单层试验(IPMA) 64.5免疫荧光抗体试验(IFAT) 64.6酶联免疫吸附试验(竞争ELISA) 75综合判定 7 7 8附录A(规范性附录)PCR试剂的配制 9附录B(规范性附录)细胞培养试剂的配制 附录C(规范性附录)IPMA和IFAT试剂的配制 附录D(规范性附录)竞争ELISA试剂的配制 I1猪增生性肠炎诊断技术规范GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法下列缩略语适用于本文件。ELISA:酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay)IEC-18:大鼠回肠细胞系(ilealePPE:猪增生性肠炎(porcineproliferativeenteritis)RI:局限性回肠炎(regional4.1.1流行病学特点2常发生于4月龄以上的猪，特别是4月～12月育肥猪和后备母猪。症状为出血性贫血，病初排黑高达50%。部分病例没有粪便异常，仅表现为皮肤苍白而突然死亡。病理变化主要为PHE,剖检可见发病阶段与慢性型基本一致，病猪无临床症状，排便正常，但生长速度慢忽视。剖检病理变化与慢性型基本一致。4.2.2试剂b)磷酸盐缓冲液(0.01mmol/L,pH7k)溴化乙锭(配制见A.6);3p)引物(荧光PCR引物见A.9;套式荧光PCR浓度分别为1%和0.5mg/mL,振荡混匀；b)56℃水浴30min,置沸水孵育8min;e)加等体积异丙醇(-20℃预冷),振荡混匀，4℃12000g离心10min,弃上清；对照设立同时设置阳性对照和阴性对照。第一阶段：95℃预变性5min;报告荧光(reportdye)设定为FAM,淬灭荧光(quenchdye)设定为TEMRA,校准荧光设定为4试验成立条件对照设立阴性对照：取已知阴性的同类样品作为阴性对照。PCR扩增循环参数72℃延伸7min。第二步扩增循环参数与第一步相同。取15μL第2步扩增产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果，阳性对照出现270bp的特异性条结果判定细菌的分离和鉴定所用试剂见附录B。5.2制备10mLSPG。肠壁黏膜在组织研磨器上研磨1min,再加入10mLSPG以备过滤；棉拭样制备细胞板将样品滤液在含抗生素细胞维持液中稀释，稀释比例为1:15,然后加至单层IEC-18细胞上。单层细胞和细菌悬液在2000g水平离心30min,转移至智能工作站中，置换的气体浓度为8%O₂,10%CO₂,75.8%N₂,6.2%育6d,每2天换1次细胞维持液。收获培养物倒掉单层细胞的培养液，加入0.1%氯化钾溶液，在37℃培养箱中孵育5min。用吸管吸去0.1%氯化钾溶液，加入0.2%氯化钾溶液，在37℃培养箱中孵育10min。用吸管吸去0.2%氯化钾溶液，加入SPG,然后用细胞刮削器将单层细胞解离下来，将解离后的细胞液反复通过21号针头注射器3次以64.4.1材料样品拍干。加入HRP-SPA,每孔100μL,37℃孵育1h,弃去液体。洗板3次，各孔中加入AEC溶液4.5免疫荧光抗体试验(IFAT)4.5.1材料4.5.2操作方法74.6.1材料89 A.1灾菌双蒸水A.2焦碳酸二乙酯(DEPC)水A.5蛋白酶K溶液(10mg/mL)容到10mL,-20℃保存备用。A.6溴化乙锭(EB)溶液溴化乙锭(EB)200mg,加灭菌双蒸水至20mL,混匀。A.9胞内劳森菌实时荧光PCR扩增引物序列A.10胞内劳森菌套式PCR扩增引物序列(规范性附录)细胞培养试剂的配制B.1磷酸盐缓冲液(PBS)(KH₂PO₄)0.24g,用盐酸(HC1)调pH值至7.4,加二级水至1000mL,(121±2)℃高压灭菌20min,室取0.10g胰酶溶于100mLPBS中，调pH值至7.4,0.22μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存，4℃一周内用完。B.3谷氨酸钠钾溶液(SPG)牛血清(FBS)50mL,加二级水至500mL,调pH至7.0,0.22μm滤膜过滤除菌后，4℃保存。B.6含抗生素细胞维持液取氨乙基咔唑(3-amino-9-ethyl-carbazole)4mg加人二甲基甲酰胺(N,N-dimethy-formamide)取乙酸钠(CH₃COONa)4.1g加人1000mL二级水中，用100%乙酸调整至pH5.0。C.2.3AEC溶液(用于IPMA)C.5.1将长成单层的IEC-18细胞用0.1%胰酶消化1min,用细胞生长液悬浮细胞，使细胞浓度达到1×10⁶个/mL,在96孔细胞培养板中每孔分别加入100μL,5%CO₂培养箱，37℃培养18h~24h。计算TCID₅0,达到1×10⁵/mL以上方可用于制备IPMA/IFAT诊断板。C.5.3用细胞维持液稀释LI菌液为1×10⁵mL,每孔50μL,剩余2孔作为对照孔。置8%O₂,10%CO₂,75.8%N₂,6.2%H₂培养环境中37℃培养48h～7加入预冷的无水乙醇4℃固定45min,或预冷的80%丙酮固定45min。(规范性附录)竞争ELISA试剂的配制柠檬酸(C₆H₈O₇)1.92g,二级水加至10D.3.20.1mol/L磷酸氢二钠溶液D.4终止液(2mol/L