CN114994324B 用于免疫检测的组合物、试剂盒、检测方法及应用 （上海泌码生命科学有限公司）

苷酸序列和所述第二核苷酸序列能够通过DNA连本申请提供的组合物用于免疫检测时，特异性2所述第一蛋白和第二蛋白能够同时识别并结合于目标分子，所述第一述第二核苷酸序列能够通过DNA连接酶连接，所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包括模板connector，所述模板connector的第一部分序列与所述第一核苷酸序列中远离所述第一蛋白的一端互补配对，所述模板connector的第二部分序列与所述第二核苷酸序列中远离所述第二蛋白的一端互第三蛋白通过生物素-亲和素固定于所述固相载体上，并特异性识别并结合于所述目标分3互补的方式连接于所述第一核苷酸序列和/或所述第二核15.权利要求1-13中任一项所述的组合物在制备用于检测新型冠状病毒抗体或人乳头4体免疫产生的特异性抗体在一定程度上可弥补以上的不足，因此迫切需要开发出特异性5第一部分序列与所述第一核苷酸序列中远离所述第一蛋白的一端互补配对，所述模板connector的第二部分序列与所述第二核苷酸序列中远离所述第二蛋[0018]在本发明的一个具体实施方式中，所述磁珠选自M-270环氧基磁珠或连接有链霉6[0027]本申请中，所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列可以连接有样本标签一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列中的一段序列，也可以通过互补配对的方式连接于所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸70.05U/μlDreamTaqHotStartDNAPolymerase，0.02U/μlUracil-DNAglDreamTaqHotStartDNAPolymerase，0.02U/μlUracil-DNAglycosylasein1×fwd和0.25μMPCR-rev，0.1×SYBRGreen，0.025U/μlDreamTaqHotStartDNAPolymerase，0.01U/μlUracil-DNAglycosylasein1×DreamTaqDNAPolymerase8和/或第二核苷酸序列标记上不同的样本标签，可以实现高通量检测，具有广泛的应用价[0070]图9为本申请实施例中提供的目标分子通过第一蛋白连接于磁珠，并基于链霉亲9一核苷酸序列和第二核苷酸序列为15bp以上的核苷酸序列。[0076]新冠病毒RBD-mFc重组蛋白(SARS-CoV-2(2019-nCoV)SpikeRBD-mFcRecombinantProtein；型号40592-V05H，义翘)；新冠病毒S1-Hi亲和纯化驴抗人IgG(H+L)抗体(AffiniPureL)；型号711-005-152，Jackson)；亲和纯化驴抗鼠IgG(H+L)抗体(AffiniPureDonkey偶联抗体试剂盒(DynabeadsAntibodyCouplingKit；型号14311D，ThermoFisherScientific)；链霉亲和素T1磁珠(DynabeadsMyOneStreptavidinT1；型号65601，Invitrogen)；蛋白A/G磁珠(ProteinA/GMagneticBeads；型号88802，ThermoFisherCLK-A124-10；JenaBioscience)；ThermoFisherZebaTM旋转脱盐柱(ThermoFisherThermoFisherScientific)；Phi29DNA聚合酶(Phi29DNAPolymerase；型号EP0091，[0079]cgcatcgcccttgga[0081]tcgtgtctaaagtccgt[0104]第二蛋白为抗原2019-nCoVSpikeRBD-mFc(RBD)和2019-nCoVSpikeS1-His[0105]第三蛋白为抗原2019-nCoVSpikeRBD-mFc(RBD)和2019-nCoVSpikeS1-His[0109]蛋白/抗体与核苷酸共价键偶联：10ugS1&RBD环辛烯-琥珀酰亚胺酯(dibenzylcyclooctyneNHSester)(AF-206-NA,R&DSystems)、加入2.5倍摩尔的叠氮化物Azide修饰的第一探针的核苷酸序列，分别在4℃孵育过夜制备[0111]将人鼠嵌合2019-nCoVSpike抗体(目标分子)溶于PBS中作为模拟已经产生抗体[0115](1)准备4个96孔板，2个96孔板中加入包被有S1&RBD的磁珠和Spike抗体结合(记为试验1和试验2)，2个96孔板加入包被有S1&RBD的磁珠和PBS结合作为对照(记为对照1和[0118](4)每管加入25μlT4连接混合液(终浓度为100μMATP，0.1μMConnector)，[0121]在每管中加入10μl蛋白酶混合液(终浓度为0.4μg/μlProteinasek,1×Dream020.830[0127]由表1可以看出，2个96孔板和对照2)，将96孔样本混成1管后，加入抗体2019-nCoVSpike测得的CT值分别为12.1[0132]第三蛋白为抗原2019-nCoVSpikeRBD-mFc(RBD)和2019-nCoVSpikeS1-His核苷酸直接与二抗人IgG结合形成与S1&RBD蛋白探针成对的左探针，制备方法同方案一中[0137](1)按照EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin试剂盒说明书公式计算，每管Sulfo-NHS-[0138](2)按照EZ-LinkSulfo-NHS-Biotin试剂盒说明书，将抗原S1&RBD溶液与Sulfo-NHS-Biotin溶液混合均匀(每10μg抗原[0140](4)使用ThermoFisherZebaTMSpinDesaltingColumn试剂盒将生物素化抗[0142](1)在链霉亲和素包被板中加入每孔加入10μl蛋白浓度为5ng/μl的生物素化抗原[0147]链霉亲和素包被板，每个孔中加入10μl分别溶于血浆和PBS中的不同浓度梯度的[0150](2)每个孔加入10μl抗体浓度为10ng/μl的人二抗IgG左探针和10μl蛋白浓度为fwd和0.25μMPCR-rev)，0.1×SYBRGreen，0.025U/μlDreamTaqHotStartDNAPolymerase，0.01U/μlUracil-DNAglycosylasein1×DreamTaqDNAPolymerase[0174]收集健康人的血浆，将不同浓度梯度的抗体SARS-CoVSpike兔抗稀释于血浆或5μl磁珠混合液(洗涤后的蛋白A/G磁珠10mg/mL1μl+1％BSA缓冲液4μl)[0179](2)每个孔中加入20μl10ng/μl左右探针混合液(10μl10ng/μlS1&RBD左探针+[0181](4)每个孔中加入25μlT4连接混合液(终浓度为100μMATP，0.1μMCo[0196]抗原S1&RBD重组蛋白与第一探针的核苷酸序列形成左探针，二抗兔IgG与第二探[0204]收集健康人的血浆，将不同浓度梯度的兔抗SARS-CoVSpike分别稀释于PBS和血[0206]准备96孔板，每个孔中加入结合有生物素化S1&RBD的磁珠混合液5μl(10mg/mL磁[0209](2)每个孔中加入20μl10ng/μl左、右探针混合液(10μl10ng/μl连有Indexprimer的兔IgG右探针和10μl10ng/μlS1&RBD蛋白左探针)，混匀后在旋转混合仪上室温[0212](5)每个孔中加入25μlT4连接混合液(终浓度为100μMATP，0.1μMCo[0214](7)每个孔中加入25μlphi29DNA聚合酶混合液(终浓度为0.1U/μLphi29DNA[0218]磁性分离后，将上述10μl连接产物转移到qPCR板中，并与10μlqPCR混合物混合23.8728.0822.74028.7727.20[0222]从表4中可以看出将抗体兔抗Spike以不同浓度梯度分别溶于PBS和血浆中，同一抗原S1&RBD重组蛋白；第一探针为兔IgG与第一核苷酸序列形成左探针，第二探针为抗原[0234]收集健康人的血浆，将不同浓度梯度的兔抗SARS-CoVSpike分别稀释于PBS和血[0236]准备96孔板，每个孔中加入结合有生物素化S1&RBD的磁珠混合液5μl(10mg/mL磁[0239](2)每个孔中加入20[0250]第一蛋白为抗原2019-nCoVSpikeRBD-mFc(RBD)和2019-nCoVSpikeS1-His[0254]第二探针的核苷酸序列直接与二抗人IgG结合形成右探针，制备方法同方案一中[0258]按照上述DNA连接蛋白的方法和步骤，将生物素化标记后的抗原与第一探针的核[0261]向步骤3中加入2.5倍摩尔过量的叠氮化物(Azide)修饰的第一探针的核苷酸序[0263]将不同浓度梯度的人鼠嵌合抗体SARS-CoVSpike分别稀释于PBS中，模拟新冠样[0265]准备96孔板，每个孔中加入结合有生物素化S1&RBD的磁珠混合液5μl(10mg/mL磁TaqHotStartDNAPolymerase,0.02U/μlUracil-DNAglycosylasein1×DreamTaq21.2720.0522.1622.2722.61023.5025.20A男否无无B女否无无C男是无D女是无[0294]准备96孔板，每个孔中加入结合有生物素化HPV16L1的磁珠混合液5μl(10mg/mL高，符合规律，由此说明本实施例方案一抗体探针组合a、b、c检测方法检测人体血液中原HPV16L1重组蛋白结合第二核苷酸[0313]收集两名接种过HPV四价疫苗和两名未接种过HPV四价疫苗的志愿者的全血，[0315]每个反应分别加入5μl样品，5[0320]每个反应加入25μlT4连接混合液(终浓度为100μMATP,0.1μMConnector，A是B是C否20.36D否[0328]本应用例中，以小鼠人乳头瘤病毒16型L1单克隆抗体HPV16作为标准样品制作标0.20.02021.20