RNA的生物合成课件4

RNABiosynthesis,TranscriptionRNA的生物合成

(轉錄)

以一段DNA鏈為範本合成RNA的過程稱為轉錄RNADNA

轉錄（transcription）轉錄過程動畫複製和轉錄的相同點

1、範本都為DNA2、都需依賴DNA的聚合酶3、本質都是形成磷酸二酯鍵4、方向都為5’→3’5、都遵循堿基互補配對原則

複製和轉錄的區別

A-U，T-A，G-CA-T，G-C配對mRNA，tRNA，rRNA子代雙鏈DNA產物酶NTPdNTP原料兩股鏈均複製範本複製A-U，T-A，G-CA-T，G-C配對mRNA，tRNA，rRNA子代雙鏈產物DDRPDDDP酶NTPdNTP原料僅範本鏈兩股鏈均複製範本轉錄方式

（半保留複製）（不對稱轉錄）

（需要引物）（不需要引物）（有校正活性）（無校正活性）(ATCG)(AUCG)參與轉錄的物質原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)範本:

DNA單鏈酶:

RNA聚合酶(RNApolymerase,RNA-pol)

可連接兩個NTP

但無3’→5’外切酶活性故無校讀功能

其他蛋白質因數

轉錄的範本和酶TemplatesandEnzymes第一節

一、轉錄的不對稱性某一基因只能一股鏈做為範本，另一股鏈不轉錄；範本鏈並非永遠在同一條單鏈上。DNA分子上能轉錄出RNA的區段，稱為結構基因(structuralgene)。3′5′5′3′不對稱轉錄結構基因範本鏈轉錄產物及方向5′3′5′3′5′3′5′3′能夠轉錄RNA的那條DNA鏈稱為範本鏈(templatestrand)，也稱作有意義鏈或Watson鏈。

與範本鏈互補的另一條DNA鏈稱為編碼鏈(codingstrand)，也稱為反義鏈或Crick鏈。

範本鏈編碼鏈5’5’3’3’5’5’5

3

3

5

範本鏈編碼鏈編碼鏈範本鏈轉錄方向轉錄方向範本鏈和編碼鏈的相對性5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′編碼鏈範本鏈mRNA5′···GCAGUACAUGUC···3′轉錄N······Ala·Val·His·Val······C蛋白質翻譯範本鏈、編碼鏈與轉錄及翻譯的關係RNA轉錄合成時，以DNA作為範本，在RNA聚合酶的催化下，連續合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進行連接。轉錄的連續性RNA轉錄合成時，只能向一個方向進行聚合，所依賴的範本DNA鏈的方向為3'→5'，而RNA鏈的合成方向為5'→3'。

轉錄的單向性RNA轉錄合成時，只能以DNA分子中的某一段作為範本，故存在特定的起始位點和特定的終止位點。特定起始點和特定終止點之間的DNA鏈構成一個轉錄單位，通常由轉錄區和有關的調節順序構成。

有特定的起始和終止位點依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP）。該酶在單鏈DNA範本以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5‘→3’聚合RNA。無校讀功能

二、RNA聚合酶（DDRP）原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構成，即

2

'

。

亞基與轉錄起始點的識別有關，在轉錄合成開始後被釋放；餘下的部分（

2

'）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關。

（一）原核生物的RNA聚合酶核心酶(coreenzyme)全酶(holoenzyme)

原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶原核生物RNA聚合酶亞基的功能利福平與β亞基相結合，從而抑制酶的活性（解鏈）真核生物中的RNA聚合酶可按其對

-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由10~12個大小不同的亞基所組成，結構非常複雜，其功能也不同。

（二）真核生物的RNA聚合酶真核生物的RNA聚合酶轉錄產物對鵝膏蕈堿反應耐受（不敏感）極敏感（低濃度）中度敏感（高濃度）Ⅲ(C)Ⅱ(B)Ⅰ(A)45SrRNAHnRNA5S-rRNAtRNAsnRNARNA聚合酶存在部位核仁核質核質線粒體mtRNAmtRNA-pol耐受（不敏感）（mRNA前體）（除5SrRNA外，其他rRNA前體）真核RNA-pol的的各種亞基電泳分離RNA-polⅠRNA-polⅡRNA-polⅢ分子量（kD）對數尺規200502001001、每種酶有2個分子量超過100kD的亞基，且都不相同。2、分子量低於40的亞基會同時出現在2種或3種酶上。*************3、RNA-polⅡ的138750亞基與大腸桿菌β亞基序列同源。羧基末端結構域

(carboxyl-terminaldomain,CTD)RNA聚合酶Ⅱ最大亞基的羧基末端有一段共有序列為Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser重複序列片段這一序列在RNA聚合酶Ⅱ中是獨一無二的。所有真核生物的RNA聚合酶Ⅱ都具有CTD，只是共有序列的重複程度不同。磷酸化的CTD在轉錄起始中發揮作用。在原核生物中，若干功能相關的結構基因常常串聯在一起，由其上游的同一調控序列進行調控，這種基因的組織形式稱為操縱子（operon）。三、

範本與酶的辨認識別：結構基因調控序列操縱子：轉錄單位或轉錄區段啟動子RNA-Pol位於基因上游，與RNA聚合酶識別、結合並起始轉錄有關的一些DNA調控序列被稱為啟動子（promoter）。啟動子序列通常由一些帶共性的保守序列構成。RNA聚合酶保護法RNA-Pol3、核酸酶消化水解未保護DNA4、蛋白酶消化RNA-Pol釋放被保護的DNADNA分子1、分離一段基因片段2、加入純化RNA-Pol啟動子開始轉錄(Pribnowbox)TATAAT-10區1-30-5010-10-40-205

3

3

5

原核生物啟動子的保守序列TTGACA-35區RNA-pol辨認位點(recognitionsite)5

5

RNA聚合酶保護區結構基因3

3

原核生物轉錄起始區的一致性序列被RNA聚合酶辨認的區段就是位於轉錄起始點-35區的TTGACA序列。RNA聚合酶與該區結合後，即滑動至-10區的TATAAT序列（Pribnow盒），並啟動轉錄。DDRP的移動TTGACAAACTGTTATAATATATTADDRP-40-35-30-25-20-15-10-50+5+10+15+20+25啟動子保守序列開始轉錄轉錄起始點第二節RNA轉錄合成的過程TheProcessofRNABiosynthesis（一）轉錄起始轉錄起始需解決兩個問題：RNA聚合酶必須準確地結合在轉錄範本的起始區域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉錄的範本。一、原核生物的轉錄過程

原核生物的轉錄起始σ亞基辨認-35區RNApol

全酶移向-10區，打開雙鏈合成第一個磷酸二酯鍵

5’-pppGpN-OH-3’

轉錄起始複合物RNApol(αββ′σ)—DNA—pppGpN-OHσ亞基脫落（結合鬆弛）（結合緊密）轉錄起始不需引物！原核轉錄起始RNA聚合酶全酶在轉錄起始區的結合RNA-pol(

2

)-DNA-pppGpN-OH3

轉錄起始複合物:1.

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與範本結合鬆弛，沿著DNA範本前移；2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。（二）轉錄延長(NMP)n

+

NTP

(NMP)n+1

+

PPi轉錄空泡(轉錄複合物)：RNA-pol

（核心酶）

····DNA····RNA目錄轉錄空泡(transcriptionbubble)的形成5′3′編碼鏈範本鏈OHG（A）PPPNOHPPPG（A）OPPPNOHP5

-pppG-OH+NTP

5

-pppGpN-OH3

+ppi兩個核苷酸形成磷酸二酯鍵+1+2轉錄延長動畫35¢DNARNA聚合酶核糖體RNA

原核生物轉錄過程中的羽毛狀現象RNA轉錄合成的終止機制有兩種：

1．依賴Rho因數的轉錄終止：由終止因數（

因數）識別特異的終止信號，並促使RNA的釋放。（三）轉錄終止●

因數是個同六聚體；●

因數能結合RNA，與polyC的結合力最強；●

因數還有ATP酶和解螺旋酶的活性。推論：轉錄終止信號存在於RNA而非DNA範本。ATP依賴

Rho因數的轉錄終止RNA轉錄產物形成寡聚U及髮夾形的二級結構，引起RNA聚合酶變構及移動停止，導致RNA轉錄的終止。2．非依賴Rho的轉錄終止：5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`

RNA5

TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3

DNAUUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`莖環(stem-loop)/髮夾(hairpin)結構莖環結構使轉錄終止的機理

使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；使轉錄複合物趨於解離，RNA產物釋放。ρ′pppG5pppG5′二、真核生物的轉錄起始（一）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區段比原核生物多樣化，轉錄起始時，RNA-pol不直接結合範本，其起始過程比原核生物複雜。1.轉錄起始的上游區段：真核生物的轉錄起始點上游-25bp區也存在一段富含TA的順序，被稱為Hogness盒或TATA盒，通常認為是啟動子的核心序列。除此之外，在真核生物中還可見到其他帶共性的序列，如CAAT盒及GC盒等。在遠離受控基因處存在的，能夠增強基因轉錄活性的調控序列稱為增強子（enhancer）。真核生物啟動子保守序列DNA分子中參與轉錄調控的序列統稱為順式作用元件在真核生物中，轉錄的起始過程較為複雜，現已發現數百種蛋白因數與RNA轉錄合成有關。凡是與基因表達調控相關的蛋白因數統稱為反式作用因數（transactingfactor）。二、轉錄因數在反式作用因數中，直接或間接參與轉錄起始複合體的形成的蛋白因數被稱為轉錄因數（transcriptionalfactor,TF）。不同的RNA聚合酶存在相應的轉錄因數，如與RNA聚合酶Ⅱ相關的轉錄因數包括TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡH等。真核生物RNA聚合酶Ⅱ轉錄因數及其功能真核生物轉錄起始時，首先由TFⅡD的TBP亞基識別並結合TATA盒，然後在其他轉錄因數的配合下，與RNA聚合酶Ⅱ組裝形成轉錄起始前複合物(pre-initiationcomplex,PIC)。2.轉錄起始過程：RNA-polⅡTFⅡFTATAⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉錄的PICⅡHⅡETFⅡF首先，TFⅡD的TBP亞基在另一亞基TAF輔助下，由TFⅡA和B促進及配合，結合在DNA分子的TATA上，形成TFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA複合物TFⅡDTAFTBP最後TFⅡH進入，PIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化。CTD-PTFⅡB作為橋樑並提供表面，促進已與TFⅡF結合的RNA－polⅡ進入啟動子的核心區TATA。接著TFⅡE進入，靠ATPase活性協同RNA－polⅡ解開DNA雙鏈局部。2個亞基組成：大亞基有解螺旋酶活性小亞基與原核生物σ因數同源。拼板理論(piecingtheory)一個真核生物基因的轉錄需要3至5個轉錄因數。轉錄因數之間互相結合，生成有活性，有專一性的複合物，再與RNA聚合酶搭配而有針對性地結合、轉錄相應的基因。

轉錄因數的相互辨認結合，恰如兒童玩具七巧板那樣，搭配得當就能拼出多種不同的圖形。（二）轉錄延長真核生物轉錄延長過程與原核生物類似，但由於存在核小體的高級結構，故在轉錄延長過程中可觀察到核小體移位和解聚現象。轉錄延長中的核小體移位核小體轉錄方向RNA-pol核小體核小體RNA-polRNA-polRNA－pol前移將遇到核小體原來繞在組蛋白上的DNA解聚及彎曲一個區段轉錄畢，核小體移了位（三）轉錄終止真核生物轉錄終止與轉錄後修飾，即polyA尾巴結構的添加密切相關。在polyA修飾位點的下游存在一組共同序列AATAAA和GTGTGT……，為轉錄終止的識別修飾位點。在轉錄越過修飾點後，RNA鏈在修飾點處被切斷，隨即進行加帽和加尾修飾。真核生物RNA的轉錄終止5------AAUAAA-5

------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉錄終止的修飾點5

5

3

33加尾AAAAAAA······3mRNA第三節真核生物的轉錄後修飾Section4Post-transcriptionalModificationinEukaryote幾種主要的修飾方式1.剪接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)

1．加帽（addingcap）：即在mRNA的5‘-端加上m7GTP的結構。此過程發生在細胞核內，轉錄未完成時就已加帽。一、真核生物mRNA的轉錄後加工（一）首、尾的修飾Pi5ppGp…磷酸酶5pppGp…5GpppGp…pppG

ppi鳥苷酸轉移酶5

m7GpppGp…甲基轉移酶SAM帽子結構的生成mRNA帽子結構的生成及詳細結構式鳥嘌呤NNNNNHHO27H帽子結構（第一個GN-7位甲基化)POOOOHOAAAAAA-3′CHO2OOOOOOOOOOOPPPOOOOPOOOOOOOPP5′pppGp…磷酸酶5′pGp…PPiCH3+HNNNNNHHO27CHHOOO2OOOOOOOOOOPPPpppG鳥苷酸轉移酶5′GpppGp…甲基轉移酶帽子結構的種類第一個G的N7位甲基化稱為帽0：帽0：5′m7GpppNp——3′甲基化發生在核糖或第二堿基稱帽1：帽1：5′m7GpppNmp——3′（R1=CH3）帽1：5′Gpppm7Nmp——3′（第二堿基的N7位）甲基化在2個核糖的R1、R2上稱帽2：帽2：m7GpppN1mpN2mp-（R1=CH3，R2=CH3）在多個位點的甲基化稱為帽3。帽子結構的幾種形式NNNNNHHO27HCHO2OHNNNNNHHO27CHHOOO2OOOOOOOOOOPPPPOOOOCHO2OPOOOOHOAAAAAA-3′HCH3+帽0CH3+帽1CH3帽0：5′m7GpppNp—3′CH3帽1：5′m7GpppNmp—3′帽2：5′m7GpppN1mpN2mp-3′在多個位點的甲基化稱為帽3帽1：5′Gpppm7Nmp—3′（第二堿基的N7位）帽2帽3堿基

2．加尾（addingtail）：這一過程也是細胞核內完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些過剩的核苷酸，然後再加入polyA。polyA結構與mRNA的半壽期有關。

（二）mRNA的剪接（splicing）雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖mRNADNAmRNA來自hnRNA核酸序列分析證明：mRNA是去掉大部分中間片段的hnRNA。核酸雜交實驗證明：hnRNA與DNA範本鏈可以完全配對；而mRNA與DNA範本鏈雜交則出現部分配對的局部雙鏈區域和中間相當多的鼓泡狀突出的單鏈區段。因此提出真核生物基因的斷裂性的概念。1.斷裂基因（splitegene）CABD編碼區A、B、C、D非編碼區真核生物結構基因，由若干個編碼區和非編碼區互相間隔開但又連續鑲嵌而成，去除非編碼區再連接後，可翻譯出由連續氨基酸組成的完整蛋白質，這些基因稱為斷裂基因。英國科學家，因發現斷裂基因於1993年獲諾貝爾獎羅伯茨（RicharlJ.Roberts）1943年出生於英格蘭的得拜。1968年獲得謝菲爾大學的哲學博士學位。（生物化學專業），其後，他到美國哈佛大學做博士後。他曾在桑格實驗室做過短期訪問。學習RNA指紋技術和測序技術。1972-1992年，他在寒春港實驗室工作。他對腺病毒Ad2進行了精細的研究。羅伯茨與其同事在實驗室裏分離和鑒定了許多限制酶。並用這些酶作Ad2DNA限制酶圖譜。1974年，他們對這些片段進行測序。其中有一個小片段包含Ad2mRNA的末端和一個啟動子。正是對這個包含啟動子片段的搜索，導致對RNA剪切及斷裂基因的發現。可以說，斷裂基因的發現是羅伯茨測序研究的意外發現美國科學家，因發現mRNA的剪接於1993年獲諾貝爾獎夏普於（PilipA.sharp）1944年出生在美國肯塔基州。60年代，他獲得肯塔基聯合學院的文學士學位（化學與數學專業）。而後獲得伊利諾伊大學博士學位。他先後在加州理工學院的戴維森和寒春港實驗室watson(沃森)手下做過博士後。1974年，他來到麻省理工學院的癌症研究中心。他集中於腫瘤病毒的分子生物學和RNA剪接研究。夏暜關注腺病毒的基因表達過程。他想看看hnRNA和mRNA有什麼不同。他利用DNA和RNA雜交的方法找到了二者的不同。他們發現hnRNA明顯長於mRNA.mRNA不能與DNA全部雜交。在電子顯微鏡下發現有三個環。這表明mRNA比DNA小了許多；一個連續的DNA分子包含了沒有反映在mRNA中的資訊。夏普認為hnRNA中的內含子片斷被切除，而外顯子片斷拼接起來。斷裂基因的發現揭示了真核生物不同於原核生物。其次，這一過程體現了生物進化中的自然選擇機制的美妙。第三，它成為生物研究的一個重要生長點。為此。他們獲得了1993年諾貝爾獎。外顯子(exon)和內含子(intron)外顯子——在斷裂基因及其初級轉錄產物上出現，並表達為成熟RNA的核酸序列（結構基因中能夠指導多肽鏈合成的編碼順序）。內含子——隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列（不能指導多肽鏈合成的非編碼順序）。

外顯子內含子DNAmRNA轉錄形成套索RNA，外顯子靠近並接體去除套索RNA，外顯子連接成熟mRNA胰島素基因、轉錄產物、翻譯產物胰島素基因（編碼鏈）5′3′intronintronSBCCAPre成熟mRNASBCAPre轉錄後加工產物前胰島素原翻譯產物翻譯後加工修飾產物信號肽前導序列B亞基C肽A亞基SBCAPre胰島素SSSSBA內含子的分類I：主要存在於線粒體、葉綠體及某些低等真核生物的rRNA基因；II：也發現於線粒體、葉綠體，轉錄產物是mRNA；根據基因的類型和剪接的方式，通常把內含子分為4類。III：是常見的形成套索結構後剪接，大多數mRNA基因有此類內含子；IV：是tRNA基因及其初級轉錄產物中的內含子，剪接過程需酶及ATP。核內帶有外顯子和內含子編碼序列的初級RNA轉錄產物稱為雜化核RNA（hetero-nuclearRNA,hnRNA）。hnRNA經剪接加工除去內含子編碼序列並將外顯子編碼序列連接起來才能形成成熟的mRNA。2.hnRNA和snRNA：snRNA為核內小RNA，富含尿嘧啶，故以U作分類和命名，如U1、U2等。snRNA與核內蛋白質組裝形成小核蛋白體（snRNP），參與hnRNA的剪接加工。3.hnRNA的剪接過程：①snRNP與hnRNA結合成為剪接體。②剪接體結構調整，U2和U6形成催化中心，發生轉酯反應。UpAGpU外顯子1內含子外顯子2pG-OH(ppG-OH,pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉酯反應第二次轉酯反應G-OHUpUpGpA剪接過程的二次轉酯反應剪接過程的二次轉酯反應雞卵清蛋白基因hnRNA

加尾hnRNA剪接成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉錄、轉錄後修飾•RNA編輯作用說明，基因