氨基酸、肽和蛋白质课件

氨基酸、肽和蛋白質——蛋白質的構件分子氨基酸第一節氨基酸實驗證據蛋白質和多肽的肽鍵可被催化水解酸/堿能將蛋白完全水解

酶水解一般是部分水解得到各種AA的混合物得到多肽片段和AA的混合物構成蛋白質的AA只有20餘種，且都是α-氨基酸。除甘氨酸外，19種AA都具有光性。除胱氨酸和酪氨酸外，其餘AA都能溶於水。氨基酸排列方式的多樣性決定了蛋白質的多樣性,從而決定生物界的多樣性!結構通式氨基酸的定義按Ｒ基的化學結構分類：１、脂肪族aa：中性、含羥基或硫、酸性aa及其醯胺、鹼性aa一、氨基酸的分類２、芳香族aa３、雜環aa按Ｒ基的極性性質分類：１、非極性Ｒ基aa２、不帶電荷的極性Ｒ基aa3、帶正電荷的Ｒ基aa4、帶負電荷的Ｒ基aa二、氨基酸的酸鹼性質（一）兼性離子H3N—CH—COOHR+（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+（pH=pI）H2N—CH—COO-R（pH＞pI）（二）氨基酸的解離（三）氨基酸的等電點當溶液為某一pH值時，AA主要以兼性離子的形式存在，分子中所含的正負電荷數目相等，淨電荷為0。這一pH值即為AA的等電點（pI）。在pI時，AA在電場中既不向正極也不向負極移動，即處於兩性離子狀態。Ka1*Ka2=……pI=(pK’1+pK’2)/2側鏈不含離解基團的中性AA甘氨酸滴定曲線pI取決於兩性離子(兼性離子)兩邊pK’值的算術平均值酸性AA：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2鹼性AA：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2對於側鏈含有可解離基團的AA（四）氨基酸的甲醛滴定原因原理應用

NH2OHRCHCOOH+HNO2RCHCOOH+H2O+N2VanSlyke

法測氨基氮（體積）的基礎，N2中的1/2為氨基氮。

氨基酸定量和蛋白質水解程度測定原理。1.與亞硝酸反應（一）α-氨基參加的反應三、氨基酸的化學性質最經典、最易進行的親核取代反應之一丹磺醯氯：用於多肽N末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定！2.與醯化試劑反應NO2FO2N+H2N—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱鹼性DNP-氨基酸（黃色）DNFBSanger法測定N末端氨基酸基礎3.烴基化反應—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯PITC苯氨基硫甲醯衍生物苯乙內硫脲衍生物Edman降解法基礎

R’COOHR’COOC=O+H2NCHC=NCHHRHR醛氨基酸Schiff’s堿-H20+H204.形成希夫堿反應在生物體內經AA氧化酶催化即脫去α-氨基而轉變為酮酸。5.脫氨基反應（2）成酯

NH2

乾燥，HCl

RCHCOOH+C2H5OH

回流

RCHCOOC2H5+H2ONH3·Cl保護羧基（1）與NaOH等形成鹽（二）α-羧基參加的反應1.成鹽或酯反應HN-保護基R—CH-COOH+PCl5

HN-保護基

R—CH-COCl+POCl3+HCl活化羧基2.成醯氯反應

NH2

脫羧酶

R—CH-COOHR-CH2-NH2+CO23.脫羧基反應

YNHONH2NH2

R—CH—C—OCH3

YNHOHNO2

R—CH—C—NHNH2

YNHO

R—CH—C—N-—N+N+2H2O

肼醯化氨基醯肼醯化氨基醯疊氮肽的人工合成4.疊氮反應（三）羧基和氨基都參加的反應1、成肽反應2、與茚三酮的反應及其應用特異性顯色及測定Tyr酚基在3和5位上易發生親電取代反應，如碘化和硝化黃色反應1、酪氨酸Tyr（四）側鏈R基參加的反應Tyr與重氮苯磺酸生成橘黃色化合物，用於檢測酪氨酸Pauly反應精氨酸Arg側鏈胍基與環己二酮生成縮合物2、鹼性AA色氨酸Trp側鏈吲哚基能被N-溴代琥珀醯亞胺氧化——分光光度法測定Trp含量甲硫氨酸Met側鏈上甲硫基：強親核基團與烴化試劑成鋶鹽保護巰基3、含硫AA半胱氨酸Cys的巰基不穩定，易被氧化成二硫鍵，二硫鍵可被氧化劑（過甲酸）以及還原劑（巰基化合物）打開。磺基丙氨酸與二硫硝基苯甲酸發生硫醇-二硫化物交換pH8.0時412nm最大光吸收—分光光度法測定-SH四、AA構型和光譜性質（一）AA構型天然AA主要為L構型。（二）氨基酸的光譜性質紫外吸收光譜可見光區：無吸收遠紫外和紅外區：都吸收近紫外區（200—400nm）：酪氨酸Tyr/色氨酸Trp/苯丙氨酸Phe

原因：芳香族氨基酸不飽和體系Trp280nmTyr275nmPhe257nm蛋白質含量測定280nm多肽鏈中AA殘基按一定順序排列：氨基酸順序含游離

-氨基的一端：氨基端或N-端含游離

-羧基的一端：羧基端或C-端AA順序:從N-端開始以C-端氨基酸殘基為終點

Ser-Val-Tyr-Asp-Gln第二節肽①肽鍵中C-N鍵有部分

雙鍵性質

——不能自由旋轉②組成肽鍵原子處於同一平面（肽平面）③鍵長及鍵角一定④大多數情況以反式

結構存在（一）肽和肽鍵的結構共價主鏈

（二）肽的物理化學性質肽末端α-羧基pKa值比游離AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游離AA中的小。等電點（兩性）。酸鹼性質取決於：

—α-羧基、α-氨基、側鏈基團的解離肽的物理性質肽的化學性質1與氨基酸相似之處•

酸、鹼性：以內鹽形式存在，有等電點。•

-COOH：脫羧反應。2與氨基酸的區別氨基酸多肽（n≥3）：縮二脲反應—紫色（縮二脲反應）硫酸銅，OH-•

-NH2：與亞硝酸反應、醯化反應等。1穀胱甘肽（γ-穀氨醯-半胱氨醯-甘氨酸）

穀胱甘肽，GSH，具有解毒功能，也是細胞內的重要還原劑。（三）天然多肽舉例2血管緊張肽Ⅱ

存在於血液中的一種激素，名叫血管緊張肽Ⅱ，能調節血壓，系八肽結構3催產素

由垂體後葉分泌的催產素則為九肽，臨床上主要用於產後子宮收縮不良和產後子宮出血，某些條件下也可用於催產。1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而來

——第一重要、首要的物質第三節蛋白質一、蛋白質通論（一）蛋白質的化學組成和分類１、元素組成２、蛋白質的含氮量蛋白氮占生物組織所有含氮物質的絕大部分。大多數蛋白質含氮量接近於16%

蛋白質含量=每克樣品中含氮的克數

6.25凱氏定氮法：３、蛋白質的分類（1）依據外形分類球狀蛋白質纖維狀蛋白質膜蛋白質

（2）依據蛋白質的組成分類簡單蛋白結合蛋白（二）蛋白質的大小與分子量“前提”：對任一種給定的蛋白質，其所有分子在AA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應是相同的，即所謂均一的蛋白質。蛋白質是分子量很大的生物分子蛋白質與多肽無嚴格的界線

——通常將6000Dr以上的多肽稱為蛋白質。蛋白質分子量變化範圍很大蛋白質——月示——腖——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500（三）蛋白質的理化性質蛋白質的分子大小和形狀蛋白質是高分子化合物蛋白質分子的擴散和沉降蛋白質的粘度

蛋白質含有酸/堿AA殘基具有兩性堿/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右蛋白質的兩性電離及等電點（四）蛋白質構象和結構的組織層次結構層次二、蛋白質的分子結構（一）一級結構（二）二級結構

1、α-螺旋

α-螺旋結構要點：多肽鏈主要骨架圍繞螺旋中心軸螺旋式上升，每轉一圈上升3.6個氨基酸殘基，向上平移5.4Å，每個氨基酸殘基沿軸上升1.5Å；相鄰的“螺旋圈”之間形成鏈內氫鍵，即每一個肽單元的N-H與前面隔三個肽單元的C=O形成氫鍵，氫鍵的取向與螺旋中心軸幾乎平行，通常所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。α-螺旋構象靠氫鍵維持，若破壞氫鍵，α-螺旋構象破壞，肽鏈鬆散。

2、

-折疊

-折疊結構要點：肽鏈呈現平行折疊延伸結構。肽鏈各肽鍵的氨基與羰基氧原子之間形成氫鍵。3、

-轉角和無規捲曲

-轉角無規捲曲用來闡述沒有確定規律性的那部分肽鏈結構。二級結構形成類型的決定因素：

肽段上氨基酸殘基側鏈的長短。

（1）R基小，且不帶電荷的AA,易形成α-螺旋。例如：多聚Ala；（毛髮中的角蛋白整條鏈為α-螺旋）（2）R基太短，卻難以盤曲，只能折疊成片層狀，例如：蠶絲蛋白含45%甘和32%丙，故有大量片層結構存在；（3）R基太大，不易形成螺旋狀或折疊成片層，而呈無定形線狀結構。例如：異亮、色和苯丙等，側鏈緊靠排列在一起時，由於肽空間障礙較大。（三）三級結構在α-螺旋、β-折疊以及無定形線狀等二級結構基礎上，受側鏈以及各主鏈構象單元間的相互作用，從而進一步捲曲、折疊成具有一定規律性的三維空間結構，稱為蛋白質的三級結構。大多數蛋白質都具有纖維狀或球狀的三級結構。

肌紅蛋白(Mb)N端C端纖連蛋白分子的結構域結構域大分子蛋白質的三級結構常可分割成一個或數個球狀或纖維狀的區域，折疊得較為緊密，各行使其功能，稱為結構域(domain)。

有些蛋白質由兩條或兩條以上具有三級結構的多肽鏈構成。每條具有三級結構的多肽鏈就稱為一個亞基。多個亞基通過非共價鍵（氫鍵、鹽鍵、疏水鍵等鍵）聚合而成一定空間結構的聚合體，稱蛋白質的四級結構。（四）四級結構亞基是肽鏈但肽鏈不一定是亞基。

血紅蛋白，由兩條α-鏈（α-亞基）和兩條β-鏈（β-亞基）構成的α2β2四聚體。每個亞基由一條多肽鏈和一個血紅素組成。四級結構反映蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基間的相互作用，但不包括亞基內部的空間結構。示例蛋白結構詳見第5章（五）蛋白質分子中的副鍵

1、氫鍵；2、鹽鍵；3、疏水鍵；4、二硫鍵1.氫鍵由分子中與電負性較強的原子相結合的氫原子（例N-H）和氧（例C=O）及氮等原子相互吸引而成。二級結構主要依賴於氫鍵的作用，可存在於一條肽鍵的兩圈α-螺旋之間，或存在於兩條肽鍵之間（β-折疊），氫鍵的鍵能很小，屬微弱的次級鍵，但由於多肽鏈中所有的氨基酸殘基都可形成氫鍵，因此量多，從而使氫鍵成為維持蛋白質空間結構的重要副鍵。用濃尿素或胍溶液破壞氫鍵時，可破壞其空間構象，從而使多肽鏈鬆散開來。2.鹽鍵

由正負離子內的靜電吸引所形成的化學鍵。蛋白質分子中有大量的極性氨基酸，如Asp、Glu帶負電荷COO-；Arg，Lys，His帶正電荷-NH3+，兩者之間通過靜電吸引形成離子鍵（鹽鍵）。絕大多數分佈在蛋白質分子表面，使蛋白質易溶於水或具有兩性電離的性質。3.疏水鍵

氨基酸側鏈上的非極性基團在溶液中，為了避開水相，相互間群集在一起而成的作用力，疏水基團之間的作用力。例如色氨酸的吲哚環和支鏈氨基酸的-R基都屬於非極性基，它們具有疏水性，在水溶液中，它們脫離水分子而趨向於蛋白質分子內部，以形成疏水基團之間的作用力。疏水鍵在維持蛋白質三級結構的穩定性上起著重要作用。4.二硫鍵（鍵能很大）

由兩個半胱氨酸的-SH氧化脫氫，以-S-S-相連而成，二硫鍵可將不同肽鏈或同一條肽鍵的不同部分連接起來，對穩定蛋白質的構象起著重要作用。二硫鍵一旦破壞，蛋白質生物活性就喪失。三、蛋白質功能的多樣性1.催化功能-酶2.調節功能-激素、基因調控因數3.轉運功能-膜轉運蛋白、血紅/血清蛋白4.貯存功能-乳、蛋、穀蛋白5.運動功能-鞭毛、肌肉蛋白6.結構成分-皮、毛、骨、牙、細胞骨架7.支架作用-接頭蛋白8.防禦功能-免疫球蛋白9.異常功能

同源蛋白質：來自不同生物體、

執行同一/相似功能的蛋白質

同種蛋白質：來自相同生物體、

執行同一功能的蛋白質

1、同源蛋白質四、蛋白質的AA序列與生物進化（一）同源蛋白質的物種差異與生物進化

一百多個AA殘基

MW約12.5×103

28個不變殘基

細胞色素C的AA序列差異可用於核對各物種間的分類學關係以及繪製系統樹/進化樹。

2、細胞色素C與系統樹invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences1、氧合血紅蛋白（二）同源蛋白質具有共同的進化起源該酶類活性中心的Ser殘基起關鍵作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶和纖溶酶有序列同源性對底物偏愛不同2、絲氨酸蛋白酶類卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三級結構很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差異很大的蛋白質（一）肽的人工合成

保護（氨基、羧基、側鏈活性基團）

活化（氨基、羧基）

縮合劑

（二）胰島素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽與蛋白質的人工合成第四節氨基酸及蛋白質的純化和鑒定蛋白質分離純化的一般原則總目標：增加製品純度或比活前處理：因動/植物/細菌而異粗分級分離：採用鹽析/等電點沉澱/有機溶劑分級分離等方法細分級分離：採用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等結晶一、前處理依樣品而定，方法多種多樣。（一）沉澱法【溶解度差別】二、粗分級分離蛋白質從膠體溶液中沉澱析出【分離】膠體性質膠體溶液的特點：分子直徑在1-100nm內溶於水不易聚集沉澱大多數球狀蛋白能形成穩定的親水膠體溶液蛋白質膠體溶液的穩定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質溶液具有丁達爾效應、布朗運動以及不能通過半透膜等性質溫和條件，改變溶液pH或Pr所帶電荷Pr結構和性質沒有變化適當條件下可重新溶解鹽析法、有機溶劑沉澱法和pI沉澱法等（1）可逆沉澱【非變性沉澱】：鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質的水化層，鹽析一般不引起變性等電點沉澱的蛋白質溶液中加入NaCl後沉澱溶解—鹽溶原因？鹽溶—鹽析分子在等電點時，相互吸引，聚合沉澱，加入少量鹽離子後破壞了這種吸引力，使分子分散，溶於水中鹽溶鹽析向蛋白質溶液中加入大量硫酸銨後蛋白質會沉澱析出原因？蛋白質脫去水化層而聚集沉澱鹽析（（NH4）2SO4）有機溶劑沉澱脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用等電點沉澱蛋白溶液的pH值=蛋白的pI值調整溶液pH，不同蛋白在各自pI處依次沉澱強烈沉澱條件破壞Pr膠體溶液穩定性也破壞Pr結構和性質沉澱不能再重新溶解如加熱沉澱、強酸/堿沉澱、重金屬鹽和生物鹼沉澱等（2）不可逆沉澱【變性沉澱】重金屬鹽沉澱與帶負電荷蛋白質結成不溶性鹽生物鹼試劑和某些酸類沉澱與帶正電荷蛋白質生成不溶性鹽加熱變性沉澱天然結構解體，疏水基外露，破壞水化層及帶電狀態

【根據分子大小不同】利用蛋白質分子不能透過半透膜將其與小分子物質分開半透膜為玻璃紙或纖維素材料（二）透析和超過濾血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機透析液加壓血液（三）超速離心

超速離心法既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。高速：25000rpm超速：50000-120000rpmCsCl密度梯度離心蔗糖密度剃度離心（四)根據電荷不同的分離方法—電泳原理：蛋白質在非等電點時所帶總電荷不為0分子大小不同，電場中移動速度也不同SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS）十二烷基磺酸鈉原態蛋白質變性？磺酸基極性親水烷基親油（蛋白質疏水區）遷移率與電荷和形狀無關，僅取決於相對分子品質巰基乙醇破壞二硫鍵蛋白質顆粒電泳時遷移率取決於：所帶電荷分子量分子形狀等電聚焦電泳（IEF）

通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。pH梯度以兩性電解質ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外電場作用下自然形成。

雙向凝膠電泳雙向電泳毛細管電泳

毛細管電泳又稱毛細管區帶電泳，它是在毛細管（

2-75μm）中裝入緩衝液，從其一端注入樣品，在毛細管兩端加高壓直流電實現對樣品的分離，分離後的樣品依次通過設在毛細管一端的檢測器檢出。該法克服了傳統區帶電泳的熱擴散和樣品擴散的問題，實現了快速和高效分離。毛細管電泳是近年來發展起來的一項新技術，被認為是90年代最有影響的分離手段之一。目前已廣泛用於氨基酸分析、蛋白質高效分離、指紋圖譜研究、分離合成的寡核苷酸、DNA序列測定及PCR產物的分析鑒定等。毛細管電泳層析技術氨基酸分離純化的層析技術蛋白質分離純化的層析技術三、細分級分離{層析系統固定相{流動相附著在固相上的液體固體氨基酸分離純化的層析技術

（1）分配層析法的一般原理

——利用AA成分分配係數的差異{氣體液體吸附固體吸附能力不同分配液體分配係數不同離子交換離子交換劑親和性不同凝膠多孔凝膠，通過速度不同親和固定相只能與一種組分結合，——分開其他無親和力的組分

按層析原理分：

固定相各組分對固定相柱固定相裝於柱內紙固定相是液體，吸附在濾紙上，將樣品點在紙上，用流動相展開薄層將有适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜與紙層析相似，紙用其他高分子有機吸附劑代替

按操作形式分：分配柱層析離子交換層析紙層析薄層層析氣液層析高效液相層析蛋白質分離純化的層析技術層析技術，亦稱色譜技術，是一種物理的分離方法。利用混合物中各組分的物理化學性質的差別，使各組分以不同程度分佈在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)並使各組分以不同速度移動，從而達到分離。層析分離方法

層析方法分離依據吸附層析利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配係數不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子品質不同而達到物質分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質的等電點特性與離子交換層析的特性結合在一起，實現組分分離吸附層析是利用吸附劑對不同物質的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術中應用最早的技術。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設備簡單。吸附層析通常採用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱後，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內不斷發生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法吸附層析分配層析詳見：氨基酸的分離純化的層析技術分配層析是利用各組分在兩相中的分配係數不同，而使各組分分離的方法。分配係數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定後，層析係數是一常數。離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質。通過在不溶性高分子物質（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而製成。按活性基團的性質不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由於酶分子具有兩性性質，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。離子交換層析

又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子品質不同而達到物質分