发酵工程在现代生物技术中的应用

发酵工程在现代生物技术中的应用第1页生物技术：应用自然学和工程学原理，依靠生物作用剂作用将生物物料进行加工以提供产品和为社会服务技术。第2页20世纪70年代以后，以DNA重组技术建立为标志，形成了一个以基因工程为主导，发酵工程为中心，包含细胞工程和酶工程当代生物技术体系。第3页第一节基因工程菌发酵一、基因工程技术经过对核酸分子插入、拼接和重组而实现遗传物质重新组合，借助载体将重组目标基因转移新宿主细胞体系，并使目标基因在新宿主体系细胞中进行复制扩增和表示所需目标产物。第4页基因工程菌制备一、目标基因制备

1.鸟枪法选取适当内切酶，在Mg2+激活下，切开供体DNA链取得目标基因，依据酶切末端特点分为a、b两类。第5页基因工程菌制备2.cDNA法又称反转录法，从细胞内提取目标基因mRNA，在反转录酶作用下，以mRNA反转录互补cDNA。

3.人工合成在电脑控制下经过合成仪合成取得DNA片段。第6页二、载体准备当前常见基因克隆载体：

1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒2.pBR322和pUC：去除原有质粒非必须功效，引入选择标识和在适宜位置设置限制酶单一切点。

3.噬菌体载体有λ噬菌体和M13噬菌体第7页三、基因与载体连接外源DNA与载体DNA之间连接方式：

1.粘性末端连接先用一个酶切割外源DNA并将拟插入那个片段用凝胶电泳分离出来，再用同一个酶去切载体DNA，这么能够经过粘性末端连接起来。第8页2.平末端连接

3.在DNA片段末端加上均聚寡核苷酸后连接：末端核苷酸转移酶能催化DNA末端3´-OH上添加单核苷酸反应，形成寡聚核苷酸连，假如在一个DNA片段3´-OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片段3´-OH末端上一定添加与T互补寡聚A。第9页四、目标基因导入受体细胞取决于是否用适当受体细胞、适当克隆载体和适当基因转移方法第10页2、干热灭菌法进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引发中毒等作用，其中氧化作用造成微生物死亡是主要依据。因为微生物对干热耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需温度要高，时间要长，普通160～170℃，1～1.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥试验器具和材料能够采取干热灭菌法。第11页第12页湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌方法称为湿热灭菌法。其原理是借助于蒸汽释放热能使微生物细胞中蛋白质、酶和核酸分子内部化学键，尤其是氢键受到破坏，引发不可逆变性，使微生物死亡。因为蒸汽有很强穿透能力，湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说，温度升高10℃时，灭菌速度常数可增加8～10倍，对营养细胞更高。蒸汽起源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是当前最为常见灭菌方法。普通湿热灭菌条件为121℃，30min。第13页湿热灭菌法煮沸灭菌法将要消毒物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，普通微生物营养细胞都能够杀死，但不能杀死芽孢。巴氏消毒法法国微生物学家、化学家巴斯德首创低温消毒法。加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温物质中微生物和病原体消毒法。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。第14页湿热灭菌法间歇灭菌法

重复几次常压蒸汽灭菌，以到达杀死微生物营养体和芽孢目标。操作步骤：100℃，30-60min；37℃，1h；同上重复三次…

适合用于不宜高压灭菌物质，如糖类明胶牛奶培养基。方法简单，但却麻烦；工作周期长。

第15页湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法使用密闭高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，因为压力增高，温度也随之增高，从而提升杀菌力，缩短灭菌时间。最有效而广泛应用灭菌方法试验室常见是0.1MPa，121℃，15～30min第16页应用范围

培养基，水，发酵罐等其它不适合干热灭菌物品。高压蒸汽灭菌法注意事项：完全排除锅内冷空气灭菌完成后要迟缓减压压力降为零后打开盖子第17页二、辐射灭菌法利用高能量电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物以紫外线最常见。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线抵抗力强。紫外线穿透力低，仅适合用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间灭菌，且距照射物不超出1.2m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料灭菌。第18页三、化学药品灭菌法一些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、细胞通透性）而含有杀菌作用。化学药剂适于生产车间环境灭菌，接种操作前小型器具灭菌等，不适合用于培养基。化学药品灭菌使用方法，依据灭菌对象不一样有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。第19页⑴高锰酸钾

高锰酸钾溶液灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，普通用0.1％～0.25％溶液。⑵漂白粉

漂白粉化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠，NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得灭菌剂。它杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而造成死亡，对杀死细菌和噬菌体都有效。第20页⑶75％酒精溶液

75％酒精溶液杀菌作用在于使细胞脱水，引发蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子都有杀死作用，但对细菌芽孢杀死作用较差。常见于皮肤和器具表面杀菌。⑷新洁尔灭新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引发菌体外膜损伤和蛋白变性。10min能杀死营养细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。普通用于器具和生产环境消毒，不能与合成洗涤剂适用，不能接触铝制品。第21页⑸甲醛

甲醛(HCHO)是强还原剂，它能与蛋白质氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂依据。使用时能够以2份37％甲醛溶液与1份KMnO4混合，或者将37％甲醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌缺点是穿透力差。⑹过氧乙酸

过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、速效化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。第22页⑺戊二醛在酸性条件下，不含有杀死芽孢能力，只有在碱性条件下，才含有杀死芽孢能力，常见2％溶液，常见于器具、仪器和工具等灭菌。⑻酚类苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生物使用，扩充了作为消毒剂使用范围。第23页四、臭氧灭菌利用臭氧氧化作用杀死微生物细胞。氧化分解葡萄糖所必需酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。无污染消毒剂对细菌、霉菌等杀菌效果好安全，杀菌效果显著，安装灵活等特点用于洁净室、净化设备消毒。第24页五、过滤除菌法利用过滤方法阻留微生物，也可到达除菌目标，这就是过滤除菌法。此法仅适合用于澄清液体和气体除菌。工业上常见过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。第25页第26页第二节培养基和发酵设备湿热灭菌一、灭菌条件选择选择标准：到达灭菌目标，同时使培养基成份破坏减至最小。1、灭菌温度和灭菌时间选择

为何选择高温快速灭菌？温度升高，反应速率升高，微生物死亡速率远大于营养成份破坏速率灭菌程度与灭菌时间影响微生物热死规律——对数残留定律第27页灭菌程度与灭菌时间影响

微生物热死规律——对数残留定律微生物受热死亡主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残余微生物数量成正比。第28页式中N－经时间t后残余活菌浓度（个/L)，N0—开始灭菌时原有活菌浓度（个/L)；t－灭菌时间（s,min）K－灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它大小与微生物种类和加热温度相关。在同等温度下，其值小，微生物耐热性强。从上式得出：t,N之间关系为对数式中N/N0菌体存活率，而N0/N为灭菌度。t=（2.303/K）㏒(N0/N)第29页⒉影响培养基灭菌原因⑴培养基成份

油脂、糖类；低质量分数(1％～2％)NaCl溶液⑵pH值

pH值6.0～8.0，微生物最耐热；pH<6.0，氢离子易渗透微生物细胞内，从而改变细胞生理反应促使其死亡⑶培养基中颗粒⑷泡沫泡沫中空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物第30页二、培养基灭菌方法（1）分批灭菌分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。不需要从属设备，操作简便，常见灭菌方法加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采取高温快速灭菌工艺。第31页发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长

T总=t1+t2+t3

式中t1、t2、t3分别为加热、维持、冷却所需要时间其它灭菌设备普通采取蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采取较高温度，但必须注意设备内部凹处及露出小配管等蒸汽不能抵达部位。第32页（2）连续灭菌连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后送入已灭菌发酵罐内灭菌工艺流程。其温度普通以126～132℃为宜，总蒸汽压力要求到达0.044～0.049MPa以上。优点营养成份破坏少；发酵罐非生产占用时间短，溶积利用率提升；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；适合用于自动化控制，降低劳动强度。第33页缺点不适合用于黏度大或固形物含量高培养基灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作步骤，增加了染菌概率。按设备和工艺条件分（1）蒸汽直接加热（2）蒸汽间接加热第34页1、蒸汽直接加热连续灭菌系统定义：蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度过程。分两种形式：（1）由连消塔、维持罐和冷却器组成●配料罐将培养基预热60-70℃，预防培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。●连消塔使培养基快速(20s)升温(126-132℃)。●维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.●冷却管：将培养基快速冷却到40-50℃，输送到灭菌后发酵罐内第35页连续灭菌流程培养基配料配料罐加热器维持罐冷却器无菌培养基第36页（2）喷射加热连续灭菌流程由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成连续灭菌系统。蒸汽直接喷入待灭菌培养液，培养液急剧升温到预定灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，经过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。确保培养基先进先出，防止过热或者灭菌不彻底升温快、营养损失小伴随蒸汽冷凝使培养基稀释第37页第38页2、蒸汽间接加热连续灭菌系统蒸汽不直接与培养基接触，而是经过热交换器对培养基进行加热。热交换器有板式和螺旋板式两种螺旋板式交换器特点：流道宽，流速快，可降低热交换器表面结垢现象。