分子体外诊断检查 静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范 第2部分分离的DNA标准立项发展报告

分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第2部分:分离的DNA标准立项发展报告英文标题(EnglishTitle):StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Specificationsforpre-examinationprocessesforcirculatingtumourcells(CTCs)invenouswholeblood—Part2:IsolatedDNA摘要随着精准医疗的深入发展，液体活检技术，特别是基于循环肿瘤细胞（CTCs）的分析，已成为癌症早筛、疗效监测及预后评估的关键工具。然而，从静脉全血中预处理并分离CTCs及其后续的DNA分析流程缺乏统一的国际标准，导致不同实验室和研究机构间的结果存在显著差异，严重阻碍了该技术的临床转化与应用。本研究针对国际标准化组织（ISO）最新发布的ISO/TS7552-2:2024标准进行立项与发展报告分析。报告系统阐述了该标准的研制背景、核心内容及行业意义。主要研究内容包括：定义了静脉全血中CTCs预检查过程的通用术语与要求；详细规定了从CTCs分离出DNA的样本采集、运输、储存、处理及质量控制的全流程技术规范；探讨了影响DNA产量、纯度和完整性的关键因素与应对策略。本研究得出重要结论：ISO/TS7552-2:2024作为首个专门针对CTCs中分离DNA预检查过程的国际技术规范，填补了该领域的标准化空白。其发布将有效提升基于CTCs的分子诊断结果的可靠性、可比性和重复性，为全球范围内的液体活检临床实践提供了统一的“操作语言”和质量基准，对推动循环肿瘤DNA（ctDNA）检测与单细胞测序技术的规范化应用具有里程碑式的意义。关键词循环肿瘤细胞；液体活检；分子体外诊断；预检查过程；DNA分离；标准化；ISO/TS7552-2:2024；质量控制Keywords:CirculatingTumorCells(CTCs);LiquidBiopsy;MolecularInVitroDiagnostics;Pre-examinationProcess;DNAIsolation;Standardization;ISO/TS7552-2:2024;QualityControl正文一、引言癌症是全球主要的公共卫生问题之一，其早期发现和精准治疗是提高患者生存率的关键。传统的组织活检因侵入性强、取样困难、存在肿瘤异质性等局限性，难以满足精准医疗对实时、动态、全面监测肿瘤信息的迫切需求。在此背景下，以“液体活检”为代表的无创或微创检测技术应运而生。其中，循环肿瘤细胞（CirculatingTumorCells,CTCs）作为从原发或转移性肿瘤病灶脱落进入外周血的“液态活检标本”，携带了完整的细胞遗传学信息，为肿瘤的基因分型、耐药机制研究和转移监控提供了直接证据。为应对这一挑战，国际标准化组织（ISO）下属的临床实验室检验和体外诊断系统技术委员会（ISO/TC212）组织全球专家，经过多年的研究与协调，于2024年11月4日正式发布了ISO/TS7552-2:2024《分子体外诊断检查静脉全血中循环肿瘤细胞的预检查方法规范第2部分:分离的DNA》。本标准作为ISO7552系列标准的重要组成部分，旨在建立一套遵循国际共识的、可靠且可重复的CTCs-DNA预检查操作规范，为全球液体活检领域的质量控制提供强有力的技术支撑。二、标准的研制背景与范围界定1.研制背景：CTCs-DNA分析标准化势在必行*技术瓶颈凸显：从全血到可分析DNA样本，需经历血液采集、CTCs分离、富集、裂解及DNA纯化等多个环节。任何一个环节的微小偏差（如抗凝剂选择、运输温度、储存时间、富集方式、DNA提取方法）都可能显著影响下游分子分析的准确性。例如，温度波动可能导致CTCs裂解或RNA降解（进而影响DNA完整性）；不合适的抗凝剂可能抑制PCR反应，或引入污染物质干扰DNA纯化。*临床需求迫切：在肿瘤精准医疗临床实践中，CTCs的DNA可用于检测驱动基因突变（如EGFR、KRAS、BRAF）、拷贝数变异（CNV）、融合基因及甲基化模式，为靶向治疗、免疫治疗（如PD-L1表达分析）及耐药监测提供决策依据。一项治疗方案的确定，往往依赖于检测结果的可靠性。缺乏标准化的预检查流程，使得医生对检测结果的信任度下降，影响了临床决策的可信度。*监管与合规要求：各国药品监管部门（如FDA、EMA、NMPA）对体外诊断（IVD）产品的审评审批日益严格。一个标准化的预检查过程是确保IVD产品性能稳定、结果可靠的前提。ISO/TS7552-2:2024的发布，为相关试剂盒、设备及实验室自建方法（LDT）的开发、验证和日常质量控制提供了明确的参考框架。2.范围界定ISO/TS7552-2:2024明确规定，该技术规范的核心适用范围为静脉全血中基于CTCs分离后进行DNA提取的预检查过程。它适用于以下场景：*用于临床分子诊断（如癌症诊断、预后判断、治疗监测）的CTCs-DNA分析。*用于科研及药物研发中，以CTCs为样本进行基因组或表观基因组研究。*本规范不涵盖CTCs分离富集的具体技术方法（如微流控芯片、磁珠捕获、密度梯度离心等）的比较或优化，但其结果受这些方法的影响。规范更侧重于确认已分离的CTCs后续操作的质量控制。*本规范不适用于从血浆或血清中提取的游离循环肿瘤DNA(ctDNA)，因为两者的细胞来源（完整细胞vs.细胞碎片/凋亡产物）、生物物理特性及提取流程存在本质区别。三、标准的核心技术内容解析ISO/TS7552-2:2024是一项技术规范（TechnicalSpecification），而非正式国际标准（InternationalStandard）。这反映了该领域技术尚处快速发展期，部分流程仍在优化中。标准的核心内容包括以下几个方面：1.术语和定义标准首先明确了与CTCs预检查和DNA分析相关的核心术语，如“循环肿瘤细胞(CTC)”、“富集”、“分离”、“基因组DNA”、“总DNA”、“DNA产量”、“纯度(A260/A280,A260/230)”、“完整性(DNAIntegrityNumber,DIN)”等。与ISO20184系列（关于FFPE组织样本预检查）和ISO20186系列（关于血液中ctDNA预检查）进行了术语协调，确保整个ISO“分子检验预检查”标准体系的逻辑一致性。2.样本采集*采血管选择：强烈推荐使用含有CTCs稳定剂的专用采血管（StreckCell-FreeDNABCT管或类似产品）。标准指出，标准EDTA管（K2/K3EDTA）不适合长时间储存（通常<4小时），可能因CTCs裂解导致目标DNA释放，从而与血浆中ctDNA混同，干扰CTCs-DNA的特异性分析。应明确规定抗凝剂类型和采血管品牌（或同等性能替代品）。*采集流程规范：强调应采用无菌、标准静脉穿刺技术，第1管血（用于常规生化/血常规检测）必须弃用，以减少皮肤细胞污染。建议采血量至少为7.5mL（或根据后续检测需求增加至20mL），以捕捉足够的CTCs用于DNA分析。记录患者信息、采血时间、采血部位、采血者等信息。3.运输与储存*运输条件：标准要求，采血后必须在室温（15-25°C）条件下，在48小时内完成CTCs富集和DNA提取。超过48小时应说明原因并评估DNA降解风险。运输过程严禁剧烈震荡、极端温度或直接暴露于阳光。*储存条件：若不能立即处理，全血样本可储存于2-8°C、最长不超过72小时（使用稳定剂管）。严禁冷冻全血，因为解冻过程会完全破坏细胞完整性。分离后的CTCs裂解液或纯化后的DNA应分别按照相关标准（如ISO20184-2）储存，通常-20°C短期（<1个月）或-80°C长期（>1年）保存。4.分离与富集CTCs（关键前处理）虽然不指定具体方法，但标准强调了最终用于DNA分析的细胞纯度的重要性：*白细胞去除：任何非靶细胞的污染（尤其是白细胞，其DNA背景巨大）都会极大地稀释目标CTCs-DNA信号，尤其是对于低频突变检测（如0.1%以下的突变）。标准要求，在流程中必须包含有效的白细胞去除或耗竭步骤，并记录细胞的富集效率、纯度以及活率。例如，基于EpCAM或阳性抗原磁珠捕获后，需确认捕获的细胞团中CTC的比例。*洗涤与裂解：分离后的CTCs需使用缓冲液充分洗涤，以去除血液衍生的抑制剂（如血红蛋白、肝素）。随后，将纯化的CTCs进行裂解，释放DNA。标准推荐使用含有蛋白酶K的裂解液进行充分消化，以保证DNA高产量和高完整性。5.DNA提取与纯化*方法选择：标准推荐使用基于磁珠法或硅胶膜柱法的商业化DNA提取试剂盒，这些方法对低起始量、高GC含量或降解的样本具有较好的适应性。应优先选择经过验证、能高效回收小片段（如200-500bp）DNA的试剂盒。*流程优化：对于极低细胞数（如<10个CTCs），标准建议使用载体DNA（如糖原、tRNA）以提高DNA沉淀效率，或采用微体积洗脱（如30-50μL）以获得更高浓度的DNA。应全程加入核酸酶抑制剂。*酶切（可选）：若下游分析需要片段化DNA（如NGS文库构建），可在提取后进行酶切或超声破碎，但应记录条件。6.质量评估与质量控制这是ISO/TS7552-2:2024最核心的贡献之一，它建立了严格的定量和定性QC指标：*浓度与总量：使用Qubit高灵敏度荧光计或相关定量技术（避免使用UV分光光度法对低浓度样本不准确）。*纯度：A260/A280比值应在1.8-2.0之间（纯DNA），A260/230比值应>1.8（无蛋白、盐洗脱液残留）。若比值异常，应记录并分析原因（如酚污染、碳水化合物残留）。*污染检测：标准强烈建议进行定量PCR或ddPCR检测，以确认是否存在白细胞（如通过GAPDH或特定白细胞基因）或红细胞（如通过β-珠蛋白基因）DNA污染。若检测到高水平的白细胞DNA（或总DNA产量显著高于理论上10个CTCs所能提供的DNA量），应视为失败样本。*阳性与阴性对照：每个批次实验必须包括阳性对照（已知细胞系混合物或标准品）和阴性对照（无模板对照/水对照），以监控提取和QC流程的稳定性。7.报告与文件记录标准要求实验室必须详细记录所有关键步骤的参数（如采血时间、处理时间、操作者、设备编号、试剂批号、QC结果），并最终生成一份预检查报告。该报告应成为下游分子检测报告的必要附属文件，允许临床医生和研究人员评估结果的可靠性。四、主要参与单位与标准制定背景主要参与单位：美国临床病理学会(ASCP)与ISO/TC212ISO/TS7552-2:2024的制定是一个高度全球化、多学科协作的过程，其中ISO/TC212（临床实验室检验和体外诊断系统技术委员会）是该标准的总归口单位。ISO/TC212成立于1999年，秘书处由美国国家标准学会（ANSI）担任，其核心任务是在临床实验室质量管理、体外诊断试剂/仪器性能评价、参考测量系统、生物样本库及分子检验预检查等领域制定国际标准。TC212的专家委员会涵盖了来自全球30多个国家的临床检验医师、病理学家、分子生物学家、生物统计学家、药物开发人员以及监管机构代表。在ISO/TC212的框架下，一个专门的工作组（如WG3“Pre-examinationprocesses”）具体负责本标准的起草与修订。该工作组由美国临床病理学会（ASCP，AmericanSocietyforClinicalPathology）等机构的核心专家深度参与领导。美国临床病理学会(ASCP)是一家拥有百年历史（成立于1922年）、成员超过10万名的全球最大的病理学家和实验室专业人员协会。ASCP在精准医疗、液体活检、实验室质量管理等方面拥有无可比拟的专业影响力和技术经验。ASCP的专家委员会直接参与了本标准技术内容的设计。具体而言，ASCP的分子病理学部通过以下方式贡献：1.起草技术框架：ASCP的专家基于他们在CTCs和ctDNA领域数十年积累的临床实践经验与科学研究成果，提出了标准的核心框架（即：从样本采集到DNA质量控制的全链条管理）。他们深刻理解了“质量源于设计(QbD)”的理念在CTCs-DNA预检查中的重要性，并设计了严格的QC指标体系。2.协调全球共识：ASCP作为连接北美、欧洲及亚太地区临床实验室的重要桥梁，组织了多次国际研讨会、问卷调查和同行评议，确保标准内容既科学严谨又能被不同实验室条件、不同经济发展水平的国家所采纳。3.编写与评审：ASCP的分子病理学专家、执业病理学家与来自罗氏、默克、Illumina、Qiagen等企业的代表，以及FDA（美国食品药品监督管理局）、EMA（欧洲药品管理局）的监管科学家共同完成了数十个版本的草案和终稿。其中，关于“白细胞DNA污染阈值”的设定（例如，通过特定qPCR反应中Ct值的判定标准），是经过多轮数据分析和专家讨论才最终确定的。4.与现有标准的衔接：ASCP确保了本标准与已发布的ISO20184系列（FFPE）、ISO20186系列（血浆ctDNA）和ISO15189（医学实验室质量和能力的要求）保持逻辑一致性和术语统一性。因此，ASCP和ISO/TC212的努力，使得ISO/TS7552-2:2024不仅是技术规范的集合，更是全球“液体活检”领域从经验主义向科学标准化迈进的重要标志。五、结论与展望ISO/TS7552-2:2024的发布，标志着国际分子诊断领域在循环肿瘤细胞（CTCs）样本预检查标准化方面取得了突破性进展。它系统地解决了从血液采集到DNA提取全过程中最大的不确定性与风险点，特别是通过严格的QC指标将“可重复性”和“可比性”提升到了一个新的高度。结论：1.填补空白，确立基准：作为第一部专门针对CTCs-DNA预检查过程的国际技术规范，它确立了全球公认的“最佳实践”框架，为所有从事液体活检的实验室、IVD生产商、临床试验机构和监管机构提供了至关重要的统一语言。2.提升临床价值：标准化流程将显著提升基于CTCs的分子诊断（尤其是低频突变检测、单细胞分析）的临床敏感性和特异性。更多可靠数据的产生，将加速CTCs在肿瘤早筛、疗效监测、精准治疗等方面的真实世界证据积累，从而推动其从“实验室研究”向“临床常规应用