DNA提取方法和步骤

DNA提取方法和步骤植物DNA的提取与纯化

DNAextraction实验一文档附赠有可编辑的3D小人素材实验原理植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：1.DNA的纯度可以满足下游操作的要求2.DNA必须完整3.DNA应当有足够的量构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段20kb以下

,并可保证包含PCR所扩增的片段

一般2kb以下

。如果对植物进行大规模筛选,操作程序应当快捷,简便,价格低廉,并尽可能避免使用有毒试剂。核酸的理化性质RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。

天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白DNP形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把蛋白质和糖去除,同时除去RNA及无机离子等,从中分离DNA。

核酸的提取方法提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法,对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。实验材料和试剂实验材料：新鲜植物组织。100mmol/LTris-HClpH8.050mmol/LEDTA500mmol/LNaCl1.5%SDSDNA提取缓冲液实验所需试剂：24:1/氯仿:戊醇其它试剂：液氮、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇。2×CTABbuffer100mMTrispH8.01.4MNaCl20mMEDTApH8.02%CTAB0.2%巯基乙醇酚/氯仿1:1

氯仿：50ml无水乙醇实验仪器实验步骤：取新鲜叶片约3g,剪碎,加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；2.在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入NaBisufite,混匀并调pH至8.0；3.在管中加入适量提取液,60℃水浴保温约30min,不时颠倒混匀；

4.冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇,用力摇匀后,放置摇床上摇动15min左右；5.室温下10000rpm离心15min,小心吸上清于新的离心管中,加入两倍体积的冷酒精,-20℃放置1h或过夜；6.挑出DNA置于新的管中,挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精,摇动洗涤10min,重复洗涤2-3次；

7.吹干DNA,加入适量TE在65℃溶解,完全溶解后离心去除杂质；

加入RNase

10mg/mL

,室温处理0.5-1h,

除去RNA,4℃或-20℃贮存。

如需纯化DNA,再加入适量TE,氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清,加入3ml/LNaAc和两倍体积的乙醇,-20℃放置1h或过夜；吹干沉淀后,加入适量TE,65℃溶解,4℃或-20℃贮存。

1.植物叶子约3g,剪碎置预冷研钵中

加入液氮充分研磨,注意不能干磨混合球磨仪3.60℃水浴保温30-60min加入等体积氯仿,用力摇匀6.再次10000rpm离心5min；

将上清小心吸入新的离心管中；

DNA样品在1%Agarose胶上电泳例图

实验注意事项微量移液枪的使用一定要规范,吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中；提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段,所以为保证DNA的完整性,各步操作均应较温和,避免剧烈震荡。