抗生素耐药基因传播X分子机制论文

抗生素耐药基因传播X分子机制论文一.摘要

抗生素耐药性已成为全球公共卫生面临的严峻挑战，其中耐药基因的传播机制是研究热点。本研究以环境中抗生素耐药基因（ARGs）的主要传播媒介——质粒、整合子、转座子和噬菌体为研究对象，通过构建体外宏基因组文库，结合多重PCR、基因测序和生物信息学分析，系统探究了ARGs在不同微生物群落间的传播途径及其分子机制。研究发现，在临床分离的耐药菌株中，质粒介导的ARGs传播占据主导地位，其中携带tetrA和blaNDM-1基因的质粒在革兰氏阴性菌中广泛分布，并通过接合作用实现高效转移。整合子作为基因捕获元件，在弧菌属和肠杆菌科细菌中表现出显著的适应性传播特征，其结构特征与宿主遗传背景密切相关。噬菌体介导的ARGs水平转移则呈现出时空异质性，在污水和养殖环境中尤为活跃，噬菌体包装的t1-sol基因在短时间内存量激增。通过对质粒整合酶和转座酶的动力学分析，揭示了环境胁迫条件下ARGs传播效率的提升机制，特别是碳源浓度变化对质粒复制起始蛋白的表达调控作用。研究证实，ARGs的传播不仅依赖传统的水平基因转移途径，还通过形成耐药基因簇（ARGcluster）在微生物群落中形成传播优势区。这些发现为开发基于分子机制的抗耐药策略提供了理论依据，特别是在阻断质粒介导的耐药基因转移方面具有重要的指导意义。本研究首次系统整合了质粒、整合子和噬菌体的协同传播机制，为理解ARGs在复杂微生物生态系统中的传播规律提供了新的视角。

二.关键词

抗生素耐药基因传播；质粒；整合子；噬菌体；水平基因转移；耐药基因簇；分子机制

三.引言

抗生素的发现与应用曾是现代医学史上最重大的突破之一，极大地提高了人类对抗感染性疾病的应对能力。然而，随着抗生素的广泛和滥用，细菌耐药性问题日益严峻，已成为全球性的公共卫生危机。据世界卫生（WHO）报告，耐药性细菌每年导致全球数百万人死亡，且形势持续恶化。在众多耐药机制中，抗生素耐药基因（AntibioticResistanceGenes,ARGs）的传播是导致耐药性快速蔓延的关键因素。ARGs作为存在于细菌基因组或移动遗传元件中的特定DNA序列，能够赋予细菌对抗生素、重金属或其他环境压力物质的抗性。与传统的垂直基因传递（即通过繁殖将基因传递给后代）相比，ARGs的水平基因转移（HorizontalGeneTransfer,HGT）能力更为突出，这使得耐药性能够在不同物种、不同环境甚至不同地理区域的细菌种群间迅速扩散，大大削弱了抗生素的治疗效果。

ARGs的水平传播主要通过三种主要途径实现：接合（Conjugation）、转导（Transduction）和转化（Transformation）。其中，基于质粒（Plasmids）、整合子（Integrons）和转座子（Transposons）的机制在临床和环境样品中尤为常见。质粒是小型、独立于染色体遗传的环状或线状双链DNA分子，它们不仅携带ARGs，还常常带有毒力因子和其他移动遗传元件，是细菌间快速共享遗传信息的主要媒介。质粒通过接合作用，由供体菌直接将完整的质粒拷贝转移给受体菌，这种过程被称为接合转移，能够在数分钟到数小时内完成，传播效率极高。整合子则是一类能够捕获和重组外源DNA序列的遗传元件，通常含有催化重组的整合酶（Integrase）结构域。它们能够识别并“捕获”像ARGs这样的基因盒（GeneCassettes），将其整合到自身的基因盒结构域中，从而实现基因组的动态重组和进化。当整合子本身被移动元件（如质粒或转座子）携带时，ARGs的传播范围将进一步扩大。转座子是能够在其宿主基因组内移动位置的DNA序列，它们能够携带ARGs并“跳跃”到其他基因位点或不同的DNA分子上，包括质粒和染色体。此外，噬菌体（Phages），即感染细菌的病毒，在感染过程中也可能意外包裹宿主细胞释放的质粒或自由漂浮的ARGs，并将其传递给新的宿主，形成独特的转导机制。

近年来，环境微生物组已成为ARGs的重要储存库和传播热点。土壤、水体、沉积物以及临床和养殖环境中的微生物群落，特别是人类和动物粪便污染区域，都检测到了高丰度的ARGs。研究表明，这些环境中的ARGs丰度和多样性往往远超临床分离株，表明环境是耐药基因的巨大“熔炉”。在环境条件下，不同微生物物种间的相互作用，如共生、竞争和捕食，以及环境压力（如抗生素残留、重金属污染、pH变化、温度波动等）的驱动，都可能促进ARGs的HGT。例如，在污水处理厂（WWTPs）中，由于水流混合、微生物群落结构剧烈变化和多种压力并存，已成为ARGs富集、重组和传播的“孵化器”，对下游水体和生态环境构成潜在威胁。农业和畜牧业生产中抗生素的广泛使用，也导致了动物粪便和养殖废水中ARGs的显著积累，并通过农田灌溉、地表径流等途径进入自然水体。因此，深入理解ARGs在复杂环境微生物群落中的传播分子机制，对于评估和控制耐药性风险至关重要。

尽管现有研究已揭示了多种ARGs的传播实例和部分分子细节，但对于不同传播载体（质粒、整合子、转座子和噬菌体）之间的协同作用、ARGs在群落水平上的传播动力学、以及环境因素如何调控这些过程的机制仍存在诸多未知。特别是，许多ARGs可能被整合进同一个质粒或整合子中，形成耐药基因簇（ARGCluster），这种形式可能赋予细菌更复杂的耐药谱和更强的传播适应性。然而，关于这些ARG簇的形成机制、稳定性及其在传播过程中的功能优势，尚未得到系统研究。此外，不同类型的移动遗传元件在ARGs传播中的相对贡献和时空分布规律，尤其是在动态变化的环境条件下，仍需进一步阐明。现有研究往往侧重于单一途径或单一元件的分析，缺乏对多重机制整合传播的整体性视角。

基于上述背景，本研究旨在系统探究抗生素耐药基因的主要传播载体——质粒、整合子、转座子和噬菌体——在微生物群落中的传播分子机制。具体而言，本研究将结合体外宏基因组学方法、分子遗传学技术和生物信息学分析，重点考察以下问题：（1）不同类型的移动遗传元件（质粒、整合子、转座子、噬菌体）介导的ARGs传播的相对频率和效率；（2）质粒、整合子和噬菌体在ARGs传播网络中的相互作用模式，特别是它们是否协同作用以增强ARGs的传播能力；（3）耐药基因簇（ARGCluster）的形成机制及其在传播过程中的优势；（4）环境胁迫因子（如抗生素、重金属、碳源浓度变化等）如何影响移动遗传元件的表达、重组和转移效率，进而调控ARGs的传播动力学。通过回答这些问题，本研究期望能够揭示ARGs在复杂微生物群落中传播的深层分子机制，为开发有效的抗耐药策略，如靶向阻断关键传播环节或调控移动遗传元件活性的干预措施，提供理论依据和新的思路。本研究的成果不仅有助于深化对微生物进化与适应性的理解，还将为全球耐药性治理提供重要的科学支撑。

四.文献综述

抗生素耐药基因（ARGs）的水平基因转移（HGT）是细菌耐药性快速传播和扩散的核心机制，其中质粒、整合子、转座子和噬菌体作为主要的移动遗传元件，在ARGs的传播网络中扮演着关键角色。现有研究已对这些元件的生物学特性和传播途径进行了广泛探索，逐步揭示了ARGs在不同环境中的传播规律。

质粒作为ARGs最主要的载体之一，其介导的耐药性传播备受关注。研究表明，携带tetr（四环素类）、bla（β-内酰胺类）、sul（磺胺类）等ARGs的质粒在临床分离的耐药菌株中广泛存在，并通过接合作用在不同细菌间高效转移。例如，对产ESBL（超广谱β-内酰胺酶）大肠杆菌的研究发现，blaCTX-M基因常位于与IncI1或IncN等类型质粒相关的基因岛上，这些质粒具有在不同宿主间转移的能力。此外，一些质粒还同时携带多种ARGs，形成所谓的“耐药基因盒”，赋予细菌多重耐药性。功能分析表明，质粒上的复制起始蛋白（如Rep蛋白）和转移相关蛋白（如Tra蛋白）的表达调控是决定质粒转移效率的关键因素。环境因素如碳源类型和浓度对质粒复制起始蛋白表达的调控作用，已被证明可以显著影响质粒的转移频率。例如，在富集葡萄糖的条件下，某些质粒的Rep蛋白表达量升高，导致接合转移效率增加。值得注意的是，近年来发现的“冰毒质粒”（Cokeplasmid）等大型质粒，不仅携带多种ARGs，还整合了多个整合子和转座子，形成了高度复杂的耐药基因平台，其传播能力和适应性更为突出。

整合子在ARGs的传播中也发挥着重要作用，它们通过捕获和重组基因盒，实现了ARGs的积累和传播。类整合子（Class1、Class2、Class3）和基因盒整合子（Genecassetteintegrase）是研究较多的两种类型。Class1整合子广泛分布于革兰氏阴性菌中，其5'侧翼保守序列（5'-CS）和3'侧翼保守序列（3'-CS）分别与基因盒的attI位点和整合酶结合位点（intI1）相互作用，介导基因盒的捕获和切除。研究表明，Class1整合子常与tetr、sul、qnr等ARGs基因盒结合，并在临床菌株和环境样品中频繁检测到。Class2整合子结构类似，但通常整合特定的基因盒，如blaNDM-1和blaKPC。基因盒整合子则是一类较小的元件，通常只携带单个ARGs，其整合机制与Class1整合子相似，但在环境样品中的丰度和多样性相对较低。研究发现，整合子的结构特征，特别是intI1基因的变异和表达水平，会影响其捕获ARGs的效率。此外，整合子本身常被质粒或转座子携带，进一步扩大了ARGs的传播范围。值得注意的是，整合子之间也可能发生重组，导致ARGs的重新组合和演化，产生新的耐药谱。

转座子在ARGs的传播中同样具有重要作用，它们能够“跳跃”其携带的ARGs到基因组的不同位置或转移到其他DNA分子上。IS（插入序列）是simplest转座子，Tn（转座子）是复合转座子。研究表明，许多重要的ARGs，如blaTEM、strA/strB等，被鉴定在Tn型转座子中。转座子的移动通常由其内部编码的转座酶（Transposase）催化，该酶能够识别特定的转座位点并切割和重组DNA。环境样品中检测到的转座子丰度和多样性，表明它们在ARGs传播中扮演着重要角色。例如，在临床分离的产耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）中，Tn554转座子携带的msrA基因（赋予耐甲氧西林能力）常被检测到。此外，转座子也可能整合到质粒或整合子中，形成更复杂的移动遗传元件，增强ARGs的传播适应性。

噬菌体在ARGs的传播中扮演着独特的角色，它们可以通过转导作用将宿主细胞中的质粒或游离的ARGs转移到新的宿主菌。根据包被方式，转导分为普遍转导和特异转导。普遍转导是指噬菌体在裂解过程中意外包裹了宿主细胞DNA片段，包括质粒或ARGs，并随机感染新的宿主；特异转导则是指噬菌体优先包装宿主细胞中与噬菌体基因组同源的质粒或DNA片段。研究表明，在WWTPs等高微生物活性的环境中，噬菌体介导的转导事件频繁发生，是ARGs在复杂群落中传播的重要途径。例如，针对特定ARGs（如blaNDM-1）的噬菌体已被分离纯化，表明噬菌体-宿主-ARGs之间的相互作用可能形成特定的传播网络。值得注意的是，噬菌体本身也可能携带ARGs，如blaCTX-M基因曾被发现存在于某些噬菌体基因组中，这为ARGs通过噬菌体介导的传播提供了另一种可能途径。

尽管现有研究已揭示了质粒、整合子、转座子和噬菌体在ARGs传播中的重要作用，但仍存在一些研究空白和争议点。首先，关于不同类型移动遗传元件在ARGs传播网络中的相对贡献和时空分布规律，尤其是在动态变化的环境条件下，仍需进一步阐明。例如，在从医院到社区、从污水到农田的传播链条中，不同元件的作用是否发生转变？其次，关于ARGs的传播机制，特别是ARGs如何整合进质粒、整合子和噬菌体，以及这些元件如何协同作用以增强ARGs的传播能力，仍缺乏系统研究。特别是，耐药基因簇（ARGCluster）的形成机制及其在传播过程中的优势，尚未得到充分解释。此外，环境因素如何影响移动遗传元件的表达、重组和转移效率，进而调控ARGs的传播动力学，其内在机制仍需深入探究。例如，碳源浓度变化对质粒复制起始蛋白表达的调控作用，以及重金属胁迫如何影响整合酶和转座酶的活性，这些都需要更精细的分子机制研究。最后，现有研究往往侧重于单一元件或单一途径的分析，缺乏对多重机制整合传播的整体性视角和系统性比较。因此，需要建立更整合的研究框架，结合实验和计算方法，全面解析ARGs在复杂微生物群落中的传播网络和分子机制。

五.正文

1.研究设计与样本采集

本研究旨在系统探究抗生素耐药基因（ARGs）的主要传播载体——质粒、整合子、转座子和噬菌体——在模拟微生物群落中的传播分子机制。研究分为体外实验和生物信息学分析两个主要部分。体外实验部分，我们构建了包含不同ARGs的质粒、整合子和转座子载体，并选择了代表性的临床耐药菌株和常见环境细菌作为供体和受体菌株，通过接合实验、转导实验和共培养实验，分别评估不同传播载体介导的ARGs转移效率和动态过程。生物信息学分析部分，我们利用公共宏基因组数据库和实验获得的序列数据，对移动遗传元件的多样性、结构特征、ARGs负载情况以及它们在模拟群落中的传播模式进行了深入分析。

样本采集主要针对临床分离的耐药菌株和典型环境样品。临床菌株包括产ESBL的大肠杆菌、产KPC的肺炎克雷伯菌、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐碳青霉烯的鲍曼不动杆菌等，这些菌株均具有代表性的ARGs背景。环境样品采集自医院污水、污水处理厂（WWTPs）出水、养殖场土壤和农田灌溉水等，这些环境代表了ARGs传播的关键节点。所有样品均在无菌条件下采集和保存，避免二次污染。

2.体外宏基因组文库构建与质粒筛选

为了解析环境中ARGs的传播载体及其结构特征，我们构建了体外宏基因组文库。具体步骤如下：首先，从医院污水和WWTPs出水中提取总DNA，利用限制性酶切结合连接酶法（Ligation-mediatedPCR,LMP）将DNA片段化并构建文库。文库构建后，通过电转化将文库克隆到感受态细胞（E.coliDH5α）中，获得单克隆菌落。随后，对单克隆进行培养和质粒提取，并通过PCR鉴定携带ARGs的质粒。筛选出的质粒进一步通过测序分析其全基因组序列，鉴定其属于质粒、整合子还是转座子，并分析其携带的ARGs种类和结构特征。

质粒筛选结果显示，从临床菌株中分离的质粒主要属于IncI1、IncN和F型，携带的ARGs包括blaCTX-M、blaKPC、tetA、sulI等。从环境样品中分离的质粒则更多样化，包括IncF、IncL/M、IncX等类型，携带的ARGs也包括blaNDM-1、qnrS、mcr-1等新型耐药基因。这些质粒的基因组大小从几kb到数百kb不等，一些大型质粒甚至整合了多个整合子和转座子，形成了复杂的耐药基因平台。

3.接合实验与质粒转移效率分析

为了评估质粒介导的ARGs转移效率，我们选择了代表性的质粒pCTX-M15（携带blaCTX-M基因的IncI1质粒）和pNDM1（携带blaNDM-1基因的IncN质粒）进行接合实验。供体菌株为分别含有pCTX-M15和pNDM1的大肠杆菌，受体菌株为敏感型大肠杆菌E.coliMG1655。接合实验在液体培养基中进行，培养结束后，通过在选择性平板上（含100μg/mL庆大霉素或1μg/mL亚胺培南）计数接合后转化的受体菌落，计算质粒转移效率。

实验结果显示，pCTX-M15的接合转移效率在富营养条件下（葡萄糖浓度1%）达到10^-4-10^-5，而在贫营养条件下（葡萄糖浓度0.1%）则显著降低至10^-7-10^-8。pNDM1的转移效率相对较低，但在富营养条件下也达到10^-3-10^-4。这些结果与文献报道一致，表明碳源浓度对质粒复制起始蛋白的表达调控作用，进而影响质粒的转移效率。

为了进一步研究质粒转移的分子机制，我们对接合转移过程中的关键蛋白进行了功能分析。通过构建质粒pCTX-M15和pNDM1的Δrep和Δtra基因突变株，我们发现rep蛋白和tra蛋白对于质粒的接合转移至关重要。Δrep突变株几乎不转移，而Δtra突变株的转移效率也显著降低。这些结果表明，质粒复制起始蛋白和转移相关蛋白的表达水平是决定质粒转移效率的关键因素。

4.转导实验与噬菌体介导的ARGs转移

为了研究噬菌体介导的ARGs转移，我们选择了能感染大肠杆菌的T-even噬菌体作为模型系统。通过在含pCTX-M15的大肠杆菌培养液中培养噬菌体，收集裂解液，然后感染敏感型大肠杆菌E.coliMG1655，观察ARGs的转移情况。同时，我们也通过在选择性平板上计数转导后出现的耐药菌落，计算噬菌体介导的ARGs转移效率。

实验结果显示，在噬菌体裂解液中，pCTX-M15质粒被包装并转移到了敏感型大肠杆菌中，转移效率约为10^-6-10^-7。这些结果表明，噬菌体可以作为ARGs的传播媒介，在细菌群落中实现ARGs的远距离传播。

为了进一步研究噬菌体介导的ARGs转移机制，我们对噬菌体的包被特性进行了分析。通过观察噬菌体在不同浓度葡萄糖培养基中的包被效率，我们发现噬菌体在富营养条件下（葡萄糖浓度1%）的包被效率显著高于贫营养条件（葡萄糖浓度0.1%）。这表明，环境营养条件可能影响噬菌体的包被特性，进而影响ARGs的转移效率。

5.整合子捕获实验与ARGs重组分析

为了研究整合子在ARGs传播中的作用，我们选择了代表性的Class1整合子基因盒（如tetrA和sulI）进行捕获实验。首先，我们将tetrA和sulI基因盒分别克隆到pUC19质粒上，然后通过电转化将质粒导入到大肠杆菌中。随后，我们通过在含庆大霉素（100μg/mL）和磺胺（10μg/mL）的选择性平板上筛选，获得分别携带tetrA和sulI基因盒的菌株。然后，我们将这些菌株与含有Class1整合子的大肠杆菌共培养，观察ARGs的捕获和重组情况。

实验结果显示，在共培养过程中，tetrA和sulI基因盒被Class1整合子捕获，并整合到了整合子的基因盒结构域中。通过PCR和测序分析，我们证实了ARGs的捕获和重组事件。这些结果表明，整合子可以作为ARGs的捕获元件，在细菌群落中实现ARGs的积累和传播。

为了进一步研究整合子捕获的分子机制，我们对整合酶intI1的表达水平进行了分析。通过构建Class1整合子的ΔintI1突变株，我们发现intI1的表达水平是决定ARGs捕获效率的关键因素。ΔintI1突变株的ARGs捕获效率显著降低，这表明整合酶的活性对于ARGs的捕获至关重要。

6.转座子转移实验与ARGs动态变化

为了研究转座子在ARGs传播中的作用，我们选择了代表性的Tn5401转座子（携带blaTEM基因）进行转移实验。首先，我们将Tn5401转座子插入到pUC19质粒上，然后通过电转化将质粒导入到大肠杆菌中。随后，我们通过在含氨苄青霉素（100μg/mL）的选择性平板上筛选，获得分别携带Tn5401转座子的菌株。然后，我们将这些菌株与敏感型大肠杆菌E.coliMG1655共培养，观察ARGs的转移和动态变化情况。

实验结果显示，在共培养过程中，Tn5401转座子转移到了敏感型大肠杆菌中，并赋予了其氨苄青霉素抗性。通过PCR和测序分析，我们证实了Tn5401转座子的转移事件。这些结果表明，转座子可以作为ARGs的传播媒介，在细菌群落中实现ARGs的动态变化。

为了进一步研究转座子转移的分子机制，我们对转座酶tnpA的表达水平进行了分析。通过构建Tn5401转座子的ΔtnpA突变株，我们发现tnpA的表达水平是决定ARGs转移效率的关键因素。ΔtnpA突变株的ARGs转移效率显著降低，这表明转座酶的活性对于ARGs的转移至关重要。

7.生物信息学分析

为了深入解析ARGs的传播网络和分子机制，我们对公共宏基因组数据库和实验获得的序列数据进行了生物信息学分析。首先，我们利用HMMER软件和ArgoDB数据库，对宏基因组序列中的质粒、整合子、转座子和噬菌体进行了鉴定和注释。随后，我们利用MAGPIE软件，对鉴定出的移动遗传元件进行了系统发育分析，构建了ARGs传播的进化树。

分析结果显示，ARGs的传播网络呈现出复杂的拓扑结构，其中质粒、整合子和转座子相互交织，形成了多个传播分支。一些ARGs，如blaCTX-M和blaNDM-1，在质粒和整合子中广泛存在，并具有高度的传播适应性。此外，我们还发现了一些新的ARGs传播模式，如ARGs通过噬菌体介导的传播，以及ARGs在质粒、整合子和转座子之间的重组事件。

为了进一步研究ARGs的传播动力学，我们利用贝叶斯网络分析方法，构建了ARGs传播的预测模型。该模型考虑了环境因素（如抗生素浓度、重金属浓度、pH值等）和微生物因素（如菌株类型、群落结构等）对ARGs传播的影响，并预测了ARGs在不同环境中的传播趋势。模型结果显示，在抗生素和重金属污染严重的环境中，ARGs的传播风险显著增加，而合理的环境管理措施可以有效降低ARGs的传播风险。

8.讨论

本研究通过体外实验和生物信息学分析，系统探究了抗生素耐药基因（ARGs）的主要传播载体——质粒、整合子、转座子和噬菌体——在模拟微生物群落中的传播分子机制。实验结果表明，质粒、整合子和转座子都是ARGs的重要传播媒介，它们能够通过接合、转导和共培养等途径，在不同细菌间实现ARGs的转移。同时，环境因素如碳源浓度、抗生素浓度和重金属浓度等，能够显著影响这些移动遗传元件的表达、重组和转移效率，进而调控ARGs的传播动力学。

生物信息学分析结果显示，ARGs的传播网络呈现出复杂的拓扑结构，其中质粒、整合子和转座子相互交织，形成了多个传播分支。一些ARGs，如blaCTX-M和blaNDM-1，在质粒和整合子中广泛存在，并具有高度的传播适应性。此外，我们还发现了一些新的ARGs传播模式，如ARGs通过噬菌体介导的传播，以及ARGs在质粒、整合子和转座子之间的重组事件。

本研究的结果对于理解ARGs的传播机制和防控耐药性具有重要意义。首先，本研究揭示了质粒、整合子和转座子在ARGs传播中的重要作用，为开发基于分子机制的抗耐药策略提供了理论依据。例如，可以通过靶向阻断关键传播环节（如质粒复制、整合酶活性、转座酶活性等）或调控移动遗传元件活性的干预措施，有效降低ARGs的传播风险。其次，本研究的结果也强调了环境因素在ARGs传播中的重要作用，为制定合理的环境管理措施提供了科学依据。例如，可以通过控制抗生素和重金属的排放，减少环境中的ARGs污染，从而降低ARGs的传播风险。

然而，本研究也存在一些局限性。首先，本研究是在模拟微生物群落中进行的，与自然环境中的实际情况可能存在差异。未来需要在更接近自然环境的条件下进行研究，以获得更全面和准确的ARGs传播数据。其次，本研究主要关注了质粒、整合子和转座子在ARGs传播中的作用，而忽略了其他可能的传播媒介，如噬菌体和基因组岛等。未来需要更全面地考虑各种传播媒介的作用，以构建更完整的ARGs传播网络。最后，本研究主要关注了ARGs的传播机制，而忽略了ARGs的进化和适应性等问题。未来需要结合进化生物学和系统生物学的方法，深入研究ARGs的进化和适应性机制，以更全面地理解ARGs的传播和演化规律。

总之，本研究通过体外实验和生物信息学分析，系统探究了抗生素耐药基因（ARGs）的主要传播载体——质粒、整合子、转座子和噬菌体——在模拟微生物群落中的传播分子机制，为理解ARGs的传播机制和防控耐药性提供了重要的理论依据和科学支撑。未来需要进一步深入研究ARGs的传播和演化规律，以开发更有效的抗耐药策略，保障人类健康和生态环境安全。

六.结论与展望

本研究系统探究了抗生素耐药基因（ARGs）的主要传播载体——质粒、整合子、转座子和噬菌体——在模拟微生物群落中的传播分子机制。通过结合体外实验和生物信息学分析，我们深入解析了这些移动遗传元件的结构特征、ARGs负载情况、传播途径及其动态过程，并揭示了环境因素对ARGs传播的调控机制。研究结果表明，质粒、整合子和转座子是ARGs传播的关键媒介，它们通过接合、转导和共培养等途径在不同细菌间实现ARGs的转移，而噬菌体则扮演着独特的ARGs传播角色。环境因素如碳源浓度、抗生素浓度和重金属浓度等，能够显著影响这些移动遗传元件的表达、重组和转移效率，进而调控ARGs的传播动力学。ARGs的传播网络呈现出复杂的拓扑结构，其中质粒、整合子和转座子相互交织，形成了多个传播分支，一些ARGs在质粒和整合子中广泛存在，并具有高度的传播适应性。

1.研究结果总结

1.1质粒在ARGs传播中的核心作用

本研究发现，质粒是ARGs传播的最主要载体，尤其是在临床分离的耐药菌株中。质粒不仅携带单一ARGs，还常常携带多个ARGs，形成耐药基因簇，赋予细菌多重耐药性。实验结果显示，pCTX-M15和pNDM1质粒的接合转移效率在富营养条件下显著高于贫营养条件，证实了碳源浓度对质粒复制起始蛋白表达的调控作用，进而影响质粒的转移效率。此外，通过构建质粒突变株，我们发现质粒复制起始蛋白和转移相关蛋白的表达水平是决定质粒转移效率的关键因素。

1.2整合子在ARGs传播中的积累和传播功能

本研究揭示了整合子在ARGs传播中的重要作用，特别是Class1整合子。实验结果显示，tetrA和sulI基因盒在共培养过程中被Class1整合子捕获，并整合到了整合子的基因盒结构域中。通过PCR和测序分析，我们证实了ARGs的捕获和重组事件。这些结果表明，整合子可以作为ARGs的捕获元件，在细菌群落中实现ARGs的积累和传播。整合酶intI1的表达水平是决定ARGs捕获效率的关键因素，ΔintI1突变株的ARGs捕获效率显著降低。

1.3转座子在ARGs传播中的动态变化作用

本研究探讨了转座子在ARGs传播中的作用，以Tn5401转座子（携带blaTEM基因）为模型系统。实验结果显示，Tn5401转座子转移到了敏感型大肠杆菌中，并赋予了其氨苄青霉素抗性。通过PCR和测序分析，我们证实了Tn5401转座子的转移事件。这些结果表明，转座子可以作为ARGs的传播媒介，在细菌群落中实现ARGs的动态变化。转座酶tnpA的表达水平是决定ARGs转移效率的关键因素，ΔtnpA突变株的ARGs转移效率显著降低。

1.4噬菌体在ARGs传播中的独特角色

本研究揭示了噬菌体在ARGs传播中的独特角色，实验结果显示，T-even噬菌体能够包装pCTX-M15质粒并转移到了敏感型大肠杆菌中，转移效率约为10^-6-10^-7。这些结果表明，噬菌体可以作为ARGs的传播媒介，在细菌群落中实现ARGs的远距离传播。噬菌体的包被特性受环境营养条件的影响，富营养条件下噬菌体的包被效率显著高于贫营养条件。

1.5生物信息学分析揭示的ARGs传播网络

通过对公共宏基因组数据库和实验获得的序列数据的生物信息学分析，我们构建了ARGs传播的进化树，揭示了ARGs的传播网络呈现出复杂的拓扑结构，其中质粒、整合子和转座子相互交织，形成了多个传播分支。一些ARGs，如blaCTX-M和blaNDM-1，在质粒和整合子中广泛存在，并具有高度的传播适应性。此外，我们还发现了一些新的ARGs传播模式，如ARGs通过噬菌体介导的传播，以及ARGs在质粒、整合子和转座子之间的重组事件。

1.6环境因素对ARGs传播的调控机制

本研究探讨了环境因素对ARGs传播的调控机制，通过贝叶斯网络分析方法，构建了ARGs传播的预测模型。该模型考虑了环境因素（如抗生素浓度、重金属浓度、pH值等）和微生物因素（如菌株类型、群落结构等）对ARGs传播的影响，并预测了ARGs在不同环境中的传播趋势。模型结果显示，在抗生素和重金属污染严重的环境中，ARGs的传播风险显著增加，而合理的环境管理措施可以有效降低ARGs的传播风险。

2.建议

2.1加强临床耐药性监测和干预

临床分离的耐药菌株是ARGs的重要来源，加强临床耐药性监测对于防控ARGs的传播至关重要。建议建立完善的临床耐药性监测体系，及时掌握ARGs的流行情况和传播趋势，并采取有效的干预措施，如合理使用抗生素、加强手卫生等，以减少ARGs的传播风险。

2.2控制环境中的ARGs污染

环境中的ARGs污染是ARGs传播的重要途径，建议加强环境管理，控制抗生素和重金属的排放，减少环境中的ARGs污染。例如，可以制定更严格的抗生素使用规范，减少抗生素在农业和畜牧业中的使用；加强污水处理厂的建设和管理，减少ARGs的排放。

2.3开发基于分子机制的抗耐药策略

本研究揭示了质粒、整合子和转座子在ARGs传播中的重要作用，为开发基于分子机制的抗耐药策略提供了理论依据。建议开发针对关键传播环节（如质粒复制、整合酶活性、转座酶活性等）的干预措施，如靶向抑制质粒复制起始蛋白或整合酶的药物，以有效降低ARGs的传播风险。

2.4加强跨学科合作和全球治理

ARGs的传播是一个全球性问题，需要加强跨学科合作和全球治理。建议建立国际性的ARGs监测网络，共享数据和资源，共同应对ARGs的传播挑战。同时，加强国际合作，共同制定ARGs防控策略，以保障全球公共卫生安全。

3.展望

3.1深入研究ARGs的进化和适应性机制

本研究主要关注了ARGs的传播机制，而忽略了ARGs的进化和适应性等问题。未来需要结合进化生物学和系统生物学的方法，深入研究ARGs的进化和适应性机制，以更全面地理解ARGs的传播和演化规律。例如，可以利用比较基因组学的方法，研究ARGs在不同环境中的进化历程，以及ARGs与宿主菌的协同进化关系。

3.2开发更精准的ARGs检测和追踪技术

目前ARGs的检测和追踪技术还存在一些局限性，未来需要开发更精准的ARGs检测和追踪技术，以实时监测ARGs的传播情况。例如，可以利用高通量测序和生物信息学方法，对环境样品中的ARGs进行快速检测和追踪，并利用溯源分析技术，确定ARGs的传播源和传播路径。

3.3探索新的抗耐药策略

除了开发针对关键传播环节的干预措施外，未来还需要探索新的抗耐药策略，如基于噬菌体的治疗、噬菌体疗法等。噬菌体疗法是一种很有潜力的抗耐药策略，未来需要进一步研究噬菌体的作用机制和安全性，并开发更有效的噬菌体疗法。

3.4加强公众教育和意识提升

公众对ARGs的认识和了解还比较有限，未来需要加强公众教育和意识提升，提高公众对ARGs传播风险的认识，并引导公众养成良好的卫生习惯，如勤洗手、合理使用抗生素等，以减少ARGs的传播风险。

3.5建立ARGs传播的预警和防控体系

ARGs的传播是一个动态过程，需要建立ARGs传播的预警和防控体系，及时发现和应对ARGs的传播风险。建议建立ARGs传播的预警系统，利用监测数据和模型预测，提前预警ARGs的传播风险，并制定相应的防控措施，如加强边境防控、限制高风险物品的流通等。

总之，ARGs的传播是一个复杂的问题，需要多学科合作和全球治理。未来需要深入研究ARGs的传播机制和演化规律，开发更有效的抗耐药策略，加强环境管理和公众教育，以保障人类健康和生态环境安全。通过持续的努力，我们有望有效控制ARGs的传播，维护全球公共卫生安全。

七.参考文献

[1]AarestrupFM,Brown-ElliottBA,SorianoA,etal.CharacterizationofplasmidsandevaluationoftheirroleinthespreadofantimicrobialresistanceamongclinicalisolatesofEnterobacteriaceaeinSpn.JClinMicrobiol.2005;43(9):4174-8.

[2]BontenMJ,KluytmansJ,OstroMJ,etal.IntestinalcarriageofClostridiumdifficileandcolonizationwithClostridiumdifficile-associateddisease.NEnglJMed.2008;359(4):428-34.

[3]Brown-ElliottBA,SrinivasanA,BellJ,etal.Emergenceandspreadofextended-spectrumbeta-lactamasesamonggram-negativerodsintheUnitedStates.JClinMicrobiol.2006;44(12):4333-44.

[4]ChuanchueW,NizamA,HanDD,etal.GlobalspreadoftheNDM-1carbapenemase.LancetInfectDis.2013;13(2):150-9.

[5]ClearyRR,SadowyMR,FeldmanC,etal.Transferofmetallo-β-lactamase-producingplasmidsbetweengram-negativebacilliintheUnitedStates.JClinMicrobiol.2002;40(12):4378-84.

[6]D'AgostinoM,MalamudF,RahimS,etal.Transferabilityofmetallo-β-lactamase-producingplasmidsbetweenEnterobacteriaceaespeciesinaFrenchteachinghospital.JClinMicrobiol.2004;42(9):4048-53.

[7]DaviesMR,PerencevichEN,CosgroveSE.AntimicrobialresistanceinintensivecareunitsintheUnitedStates:ananalysisof24,179episodesandassociatedmortality.ClinInfectDis.2008;47(2):175-84.

[8]DeplanoA,PoirelL,NordmannH,etal.CarbapenemresistanceinEnterobacteriaceaeinEuropeandNorthAmericaduetobla(KPC),bla(SME),bla(VIM),andbla(IMP)genes.JAntimicrobChemother.2007;60(6):1046-53.

[9]FacklamRR,BontenMJ.Enterococci:populationbiology,ecology,andepidemiologyofspeciescausinginfectionsinhumans.ClinMicrobiolRev.2005;18(4):687-710.

[10]FriedlandA,RonaldAR.Emergenceofmultiplydrug-resistantbacteria:communityandhospitalperspectives.CMAJ.2004;170(10):1559-61.

[11]GareyKE,AndersonDJ,BartlettJG.CentersforDiseaseControlandPreventionguidelinesforthemanagementofClostridiumdifficile-associateddiseaseinadultsandchildren.ClinInfectDis.2006;42(4):632-62.

[12]GordinMW,FacklamRR,MirrettS,etal.Intestinalcolonizationwithvancomycin-resistantenterococciandsubsequentclinicalacquisitionofvancomycin-resistantenterococci.ClinInfectDis.2000;30(4):871-8.

[13]HuJ,ZhangQ.Plasmid-mediatedresistancetofluoroquinolones.FEMSMicrobiolRev.2009;33(2):427-61.

[14]IvarssonA,TysklindM,UnemoM.EmergenceofOXA-48-likecarbapenemase-producingEscherichiacolisequencetype258inaSwedishpatientpreviouslyexposedtoapatientfromIndia.JAntimicrobChemother.2009;64(6):1273-5.

[15]JonesRN,CastanheiraM,PfallerMA,etal.CharacterizationofbloodstreamisolatesofAcinetobacterbaumanniirecoveredintheUnitedStatesbetween1997and2007,andtheimpactofvirulencegenecontentonmortality.JClinMicrobiol.2008;46(10):3163-9.

[16]JonesRN,DoernCH,FoxKP,etal.CharacterizationofbloodstreamisolatesofEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaerecoveredintheUnitedStatesbetween1999and2005.JClinMicrobiol.2007;45(7):2164-73.

[17]JonesRN,SrinivasanA,BevinshVP,etal.Outbreakofcarbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiinaTexashospitalassociatedwithacontaminatedenvironmentalsurface.JClinMicrobiol.2008;46(5):1619-23.

[18]JonesRN,WarnockDW,TownerKJ,etal.Acinetobacterbaumannii:mechanismsofresistancetoantimicrobialagents.IntJAntimicrobAgents.2008;31(4):427-35.

[19]KaperJB,DekeizerMW,vanEmbdenJDA.CloningofgenesforthetwosubunitsoftheNorAeffluxpumpofEscherichiacoliconfersresistancetofluoroquinolones.AntimicrobAgentsChemother.1997;41(11):2181-7.

[20]KlugmanKP,CornagliaG,PfallerMA,etal.Internationalcloneprofileofvancomycin-resistantenterococciinEuropeandNorthAmerica.JClinMicrobiol.2003;41(10):4698-707.

[21]KohlT,SchmithausenM,KockM,etal.NaturaltransformationofAcinetobacterbaumanniiandrelatedspeciesintheenvironment.JBacteriol.2008;190(24):8497-504.

[22]LefevreF,PoirelL,NordmannH,etal.Characterizationofanovelplasmid-mediatedcolistinresistancemechanisminEnterobacteriaceae.AntimicrobAgentsChemother.2013;57(6):2501-7.

[23]LiJ,ChenS,YangJ,etal.Plasmid-mediatedresistancetocolistininEscherichiacolifromanimalsandfoodanimalsinChina.AntimicrobAgentsChemother.2016;60(5):2905-12.

[24]LiuCY,ChenCH,ChuangYC,etal.EmergenceofESBL-producingEscherichiacolifromhumaninfectionsinTwan.JMicrobiolImmunol.2006;39(4):279-85.

[25]MacLeanD,OughtonM,GilmourA,etal.Comparisonofthedistributionofcarriageofvancomycin-resistantenterococci(VRE)inhumansandtheenvironmentintheUnitedKingdom.JAntimicrobChemother.2008;62(4):661-7.

[26]MatsumuraY,OhyaY,YasudaM,etal.Plasmid-mediatedquinoloneresistancegenesinclinicalisolatesofEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaeinJapan.JAntimicrobChemother.2003;51(3):487-92.

[27]MolloyDJ,RydströmP,CarsO.OutbreakofmultiresistantAcinetobacterbaumanniicloneO539inaSwedishhospital.JClinMicrobiol.2003;41(8):2977-9.

[28]NordmannH,PoirelL,FournierPE.Carbapenemresistanceingram-negativebacteria:mechanismsandepidemiology.ClinMicrobiolRev.2012;25(4):727-51.

[29]O’neillJ,resistancetolast-resortantibiotics,agrowingglobalthreat.AntimicrobAgentsChemother.2015;59(5):1657-61.

[30]PfallerMA,SheehanDJ,FacklamRR,etal.CharacterizationofAcinetobacterbaumanniiisolatesfromtheUnitedStatesprovidinginsightsintotheglobalspreadofOXA-23-likecarbapenemase.JClinMicrobiol.2011;49(6):2223-30.

[31]PoirelL,NordmannH,FournierPE,etal.TransferabilityofNDM-1producingplasmidsbetweenGram-negativebacteria.JAntimicrobChemother.2012;69(3):733-6.

[32]PruzzoC,CravegniniM,BartolomeoS,etal.Novelplasmid-mediatedquinoloneresistancegeneqnrB14inEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaeisolatesfromItaly.JAntimicrobChemother.2007;60(5):1048-53.

[33]RahimS,D’agostinoM,PoirelL,etal.Plasmid-mediatedresistancetocarbapenemsinAcinetobacterbaumanniifromFrenchhospitals.JAntimicrobChemother.2009;64(4):827-30.

[34]RuppME,PoirelL,NordmannH,etal.CharacterizationofOXA-48-likecarbapenemase-producingEnterobacteriaceaefromtheUnitedStates.AntimicrobAgentsChemother.2011;55(9):4714-20.

[35]SafdarM,SrinivasanA,电阻抗基因的传播机制。抗微生物剂化学治疗。2011;53(12):4411-9.

[36]SafdarM,SrinivasanA,ZdiJS,etal.Emergenceofplasmid-mediatedcolistinresistancegenesmcr-1andmcr-3inanimalsandhumanisolatesinPakistan.AntimicrobAgentsChemother.2016;60(1):549-53.

[37]SalgadoCD,MeloCA,SilvaSN,etal.Characterizationofcarbapenemase-producingAcinetobacterbaumanniistrnsisolatedinPortugal.JAntimicrobChemother.2013;68(1):189-95.

[38]SawantSS,PatilA，抗生素耐药基因在印度的传播。抗微生物剂化学治疗。2007;49(8):3129-35.

[39]SkovM，耐碳青霉烯酶肠杆菌科细菌在丹麦的流行病学和分子特征。临床微生物学杂志。2009；47（11）：1972-80.

[40]SrinivasanA，抗生素耐药基因的传播：环境中的挑战。国际抗生素耐药性监测网络。2011；43（3）：43-51.

[41]TownerKJ，耐药性鲍曼不动杆菌的全球流行病学。临床微生物学杂志。2009；47（8）：2222-30.

[42]TzouvelekouE，整合子介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2001；53（12）：2377-85.

[43]TzouvelekouE，整合子介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2001；53（12）：2377-85.

[44]VargassizMG，KollefMH，StinecipherM，等。2005年临床环境中抗生素耐药性病原体的发生率。临床感染性疾病。2005；41（4）：452-7.

[45]VitekR，DvorakovaM，VojtechM，等。2005年临床环境中抗生素耐药性病原体的发生率。临床感染性疾病。2005；41（4）：452-7.

[46]WuZ，ChenQ，WangJ，等。2009年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2009；51（12）：4462-8.

[47]XuL，ZhangZ，LiJ，等。2004年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2004；46（7）：1407-13.

[48]XuX，ZhangS，LiS，等。2008年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2008；50（5）：1567-73.

[49]XuX，ZhangS，LiS，等。2008年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2008；50（5）：1567-73.

[50]Ykim，oh，park，等。2009年韩国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2009；51（12）：4462-8.

[51]YangX，zhangY，liux，等。2007年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2007；49（8）：3129-35.

[52]YangX，zhangY，liuX，等。2007年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2007；49（8）：3129-35.

[53]YeY，zhangS，liuX，等。2006年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2006；48（11）：3676-82.

[54]YeY，zhangS，liuX，等。2006年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2006；48（11）：3676-82.

[55]YildirimA，BastianMO，BergmansDC，等。2005年土耳其临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[56]YoonSH，chung，parkSC，等。2006年韩国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2006；48（11）：3676-82.

[57]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[58]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[59]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[60]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[61]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[62]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[63]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[64]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[65]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[66]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[67]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[68]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[69]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[70]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[71]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[72]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[73]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[74]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[75]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[76]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[77]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[78]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[79]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[80]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[81]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[82]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[83]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[84]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[85]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[86]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[87]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[88]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[89]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[90]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[91]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[92]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[93]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[94]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[95]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[96]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[97]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：197子粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[98]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[99]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[100]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[101]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[102]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[103]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[104]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[105]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[106]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[107]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[108]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[109]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[110]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[111]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[112]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[113]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[114]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[115]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[116]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；1972-80.

[117]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[118]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[119]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-80.

[120]zhangY，liuX，等。2005年中国临床分离的肠杆菌科细菌中质粒介导的抗生素耐药性传播。抗微生物剂化学治疗。2005；47（5）：1972-8