生物学考研经典复习题 (十)

蛋白质组学

定义：

是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，包括蛋白质（在空间和时间上）的表达水

平、翻译后修饰、蛋白与蛋白相互作用等。

意义：

1.研究疾病发展过程或发生中蛋白质含最和活性的变化，增强人们对细胞行为的系统性了

解。

2.为临床研究提供新的药物靶点，发现新的诊断标记。

工具：质谱仪

质谱仪

结构组成：离子源（电离），S-lens（汇聚离子束），弯曲的多极杆（去除中性粒子），四

极杆（离子传输或质量筛选），八极杆（离子传输），质量分析器（分析离子质量）。

特点：

1.能同时分析成千上万种蛋白质（高通量）。

2.能同时定量丰度差异大的蛋白质。

3.能鉴定蛋白质的翻译后修饰。

4.能使蛋白质的细胞内定位可视化。

基本原理：

用适当方法使待测分子电离，得到带电荷离子，通过其质荷比的不同，在电场或磁场的作

用下区分这些带电荷离子，井得到相应分子质量，通过检测带电荷离子的相对丰度实现对待

测分子的定量。

补充说明：带电荷离子可以是电离后的原子（O二）、基团（0H）、大分子或者它们的碎裂片

段。

质谱图：

X轴：mz,质荷比，代表不同离子。

Y轴：相对离子强度，代表离子丰度。

同位素：

单同位素元素，指只含一种自然产生的稳定同位素，一般是丰度最高的那种，例如，12C,

31Po

（

双同位素元素，指含有两种同位素的元素,例如，（叱，】30、14N,15N）O

多同位素元素，指含有多种同位素的元素。

同位素丰度表示：

I.使它们总和为100%来表示每种同位素所占比例。

2.以最高丰度归一化为100%来表示每种同位素的相时丰度。

分子的平均质量和同位素峰：

第二个小峰为第•个峰的同位素峰，它的丰度是按其同位素出现的概率的加和来计算的

（以第一个峰的丰度为100%），1.1%是13c在自然界中出现的概率，而在分子中有4个C,

所以】3（：在该分子中出现的概率为4.4%,以此类推，2H在该分子中出现的概率为0.16%,所

以含有一个13c和一个2H的该分子的丰度为4.4%+0.16%=4.56%：

同位素离子：含有一个或多个自然界中低丰度同位素的离子。

单同位素离子：不含自然界中低丰度同位素的离子。

准确质量指的是单同位素离子的质量，一般来说，单同位素离子是丰度最高的，但是如果

该分子中有同位素的原子的个数太多，同位素离子出现的概率就会大大的增加，从而造成单

同位素离子丰度不是最高的。

质谱为什么要抽真空：

1.防止空气中氧气对仪器（运作时温度非常高）本身的氧化：

2.减少分子间的相互作用，当气压低时分子间相互作用小；

3.减少对分子运动轨迹的影响；

注：质谱仪中没有空气，但在离子碰撞室中有惰性气体（氮气或者氮气）提供高压，从而

实现对分子的裂解。

电离方法：

目前较常用的是电喷雾电离法（ESI）和基质辅助激光解吸电离法（MALDI）,前者是对成

团的生物大分子施加强电场使分子带电荷，后者是在基质的辅助下用激光轰击生物大分子

使分子带电荷。

两者之间的差异：

质量分析器：

1.TOF：通过不同离子在电场飞行到达检测器的时间判断mz；

2.三级串联四极杆：通过电场限定特定mz离子飞行，若后端检测器检测到离子到达

则该离子的mz为这个特定值；

3.三维离子阱：由一个环形电极和两个端盖电极形成一个小的三维电场空间，将离子

困在这个空间里，通过快速的电场变化，以一定的顺序将离子抛出到检测器，每次

变化只能抛出一种mz的离子，若检测器检测到离子，则此时的电场信息转换为m

z信息。（与上面的原理相似）

4.线性离子阱：由四极杆演变而来，在原理上与三维离子阱几乎可以说一样，但由于

它是线性的，空间更大，可分析的离子更多。

5.Orbitrap：不能碎裂离子（2-4都有碎裂离子的功能），但能同时检测多种mz的离

子，速度更快，精确度更高。（PPT中没讲，仅做补充知识）

蛋白质组分析工作流程：样品准备-＞质谱分析-＞数据库搜索-＞蛋白质ID&QUAN

1.样品准备：收集样品-＞细胞器分馈-＞抗体纯化-＞凝胶电泳-〉蛋白消化（因为

质谱仪有限的质量范围，用消化得到的多肽片段识别蛋白）反向HPLC-SCX

HPLC多肽分储-〉去盐、样品清洁（质谱仪不能耐受盐和其他的污染物］

⑴蛋白消化：蛋白水解的酶

EnzymeCleavageSite

・TrypsinKR

•ChymotrypsinFYW

・V8-DENDEQ

•Arg-CR

・Asp-NND

⑵凝胶电泳：由于质谱仪在给定的时间内只能有限的蛋白质，所以对于大于200

蛋白质的样品需要进行离线分储简化样品，可以应用反相HPLC,阳离子交换HPLC,

等电聚焦电泳等。

2.质谱分析

（1）蛋白鉴定的方法:Peptidemassfingerprinting（PMF）,MSFragmentation-

ShotgunProteomics

①PMF：未知的兴趣蛋白被消化为多肽，用MALDI-TOF类质谱仪得到精确质量;

与数据库中已知质量的蛋白进行比对；已知蛋白水解理论值计算，得到最适

宜的匹配

②Fragmentation-ShotgunProteomics：用HPLC和质谱串联自下而上的技术

鉴定蛋白，蛋白先水解为多肽，多肽再断裂为片段

3.数据库搜索：三种搜索策略，应用多肽指纹数据（转录后修饰，单一氨基酸

的置换都会导致序列不匹配）；应用序列数据；应用MSMS数据

⑴蛋白序列数据库，NCBInr（搜索工具为BLAST,Entrez）、IPI＞SWISSPROT（序

列更可靠）

⑵应用多肽序列识别蛋白的网络工具：Mascot、PROWL、ProteinProspector

4.蛋白质组定量

⑴蛋白质组定量所用的技术

2Dimensionalelectrophoresis(2DE)

Massspectrometry:MS)basedtechnology

-Isotope-labeledtechonolgy

•Isotope-codedaffinitytags(ICAT)

•Isobarictagforrelativeandabsolutequantitation(iTRAQ)

•Enzymaticlabeling-180-waterfortrypsindigestion

•Metaboliclabeling-stableisotopelabelingofaminoacidsin

cellculture(SILACJ

•Mu11ip1e-reactionmonitoring(MRM)

-Label-freeMS

•MSpeakintensityorpeakarea

•Spectralcounting

一Mu11ip1e-reactionmonitoring(MRM)

—SWATH

⑵Metaboliclabeling：细胞在包含I3C6-lysineandor"C6-arginine的培

养基中培养，因为所用的胰蛋白酶在这两个位点切割(K或者R的后面)，这就

使得到的多肽片段至少含有一个标记

优点：永生化细胞6—8次传代后可以得到同位素＞90%的合并；因为重的和轻的

样品在MS分析之前就合并了，所以处理过程中得到偏差的水平低；这个方法尤

其适用于检测不同实验条件下样品蛋白小的改变或翻译后修饰

局限性：有些细胞会将一些精氨酸转变为脯氨酸，所以会出现两个分离的重同位

素标记的峰；对于那些很难生长或者是对于培养基环境的改变很敏感的细胞没有

用；可能会影响有机体的功能行使；平行实验的数量受到了限制，由于重同位素

数量有限。

⑶Enzymaticlabeling：一份样品用胰蛋白酶和因0标记的水水解,另一份用

，60,两份混合进行MS。缺点是会缓慢的将“置换为叼，需迅速做后续处理；

⑷Isotope-codedaffinitytags(ICAT)：组成Affinitytag(Biotin)

----isotopicallycodedlinker----Thiol-specificreactive----Protein-

reactivegroup----Protein

(5)IsobaricTagging：ChargedIsobaricTag(Totalmass=145)----Neutral

lossReporterBalance(Mass=114thru117)----PRG(Mass=31thru

28)PeptideReactiveGroup

⑹MRM-MS,相比于MS-MS,MRM更快,更敏感，更特异

优点：现存技术的新应用；实验时间轴短；可以多路复用；分子特异性高；容

易检测且避免干扰；需要的蛋白丰度低(1ngmL)；重现性好；不需要免疫分级

的抗体

5.蛋白质组定量可以分为两类：discoveryandtargetedproteomics

(DDiscovcry(iTRAQ,SILAC)：有限的样品数，小于20；不能重复分析；长的

分析时间；低的定量精确度；低的重现性

Targeted：MRM

Discovery、targeted----SWATH(SequentialWindowAcquisition

ofallTheoreticalfragmentations,expansionofMSMStechnology)

⑵SWATH优点：灵敏度高；重复性好；定量精确度高；线性活性范围宽；高通

(3)0ptimizedlon-Current-BasedQuantification(ICan)

优点：利用高分辨率质谱，ICan可以广泛应用于多生物样本可靠的灵敏的蛋

白质组分析；不能鉴定出的蛋白样品的数量少

6.Methodsforcharacterizationofproteinsandposttranslational

modifications(PTM)

(DMassesofPosttranslationalModifications

MassChangeModification

+14.0Methylation

+16.0Hydroxylation

+28.0Formylation

+30.0Nitrosylation

+42.0Acetylation

480.0Sulfation

+80.1Phosphorylation

+180Mono-glycosylation

+204.4Farnesylation

+210.4Myristoylation

(2)检测蛋白磷酸化的方法:Meta