CN116178573B 一种肠道靶向的双菌多核凝胶颗粒及其制备方法 （沈阳农业大学）

CGMCCNO.250462022.06.10CGMCCNO.250402022.06.09release.JournalofBiomaterialsScience,PolymerEdition.2018,1643-1655.一种肠道靶向的双菌多核凝胶颗粒及其制一种肠道靶向的双菌多核凝胶颗粒及其制备方制备包含青春双歧杆菌和枯草芽孢杆菌两种菌2取1~2mL青春双歧杆菌菌悬液于离心管中，并按5~15mg/mL的比例纤维素钠，混匀；然后加入20~40mL浓度为20~40mg/mL的海藻酸钠溶液和0.1~0.2gCaCO3将100~200mg羧甲基纤维素钠溶解在20~40mL的超纯水中，加入220~440mg1-乙所述青春双歧杆菌的保藏编号为CGMCCNo.2所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.23[0003]目前，凝胶包裹被广泛用于保护益生菌免受外部环境和胃肠道的不利条件的影在双歧杆菌释放后提供严格的厌氧环境且没有涉及[0004]现有的包载益生菌凝胶颗粒的报道多以单腔室存储区域的壳-核结构为主，且针[0007]将100～200mg羧甲基纤维素钠溶解在20～40mL的超纯水中，加入220～44CaCO3~40mg/mL氯化钙溶液中，滴注时将针尖与氯化钙溶液表面的距离控制在45-5[0018]所述青春双歧杆菌为青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)FS2-3，且已于2022年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC[0022]本发明制备得到的巯基化羧甲基纤维素钠的中巯基含量为139.02±5理30min后，双菌多核凝胶颗粒中位于外壳中的枯草芽孢杆菌SNBS-3活菌数明显高于位于[0025]冷冻干燥后获得的双菌多核凝胶颗粒粉剂中枯草芽孢杆菌和青春双歧杆菌的活枯草芽孢杆菌SNBS-3和内芯的青春双歧杆菌FS2-3在4℃条件下储存90d后，存活率分别高[0031]图5为羧甲基纤维素钠和巯基化羧甲基纤维素钠对肠表面的最大分离力和总粘附[0035]图9为双菌多核凝胶颗粒中枯草芽孢杆菌和青春双歧杆菌在人工肠液中的活菌数6于2022年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏和无细胞提取物对DPPH的清除率均超过了65具有良好的还原力，还原力大小的范围为[0040]本发明实施例中所述青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)FS2-3菌悬[0041]2、本发明实施例中所述枯草芽孢杆菌，筛选自辽宁省沈阳市采集的传统发酵豆[0042]枯草芽孢杆菌SNBS-3对黑星病菌的抑制效果显著，抑制率达到99.93接近100％。该菌株对南国梨黑星病和赤星病有明显的防治效果，能显著提高了果实品质和产[0043]本发明实施例中所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)SNBS-3菌悬液的制备方7[0046]将100～200mg羧甲基纤维素钠溶解在20～40mL的超纯水中，加入220～4[0056]本发明以青春双歧杆菌(B.adolescentis)FS2-3为例，通过体外黏附试验观察分8[0062]羧甲基纤维素钠/益生菌菌悬液制备：将10～20mg羧甲基纤维素钠溶解在2～4mL素钠100～200mg与1-2mL青春双歧杆入羧甲基纤维素钠/益生菌菌悬液和巯基化羧甲基纤维素钠/益生菌菌悬液，以生理盐水/益生菌菌悬液作对照，培养2h。用PBS洗2～3次，去除未黏附益生菌。再加入含1％SDS-[0069]从图2可知，青春双歧杆菌FS2-3对肠黏液的黏附率为7.69而添加巯基化羧甲基纤维素钠组中该菌的黏附率高达43.67±0.42明显高于羧甲基纤维素钠组的黏附率[0071]取小鼠肠道铺于无菌载玻片上，分别加入羧甲基纤维素钠/益生菌和巯基化羧甲9[0077]本发明利用流变仪和经典拉伸实验分析实施例1制备得到的巯基化羧甲基纤维素[0080]按50～100mg/mL将羧甲基纤维素钠和巯基化羧甲基纤维素钠加入等体积的肠黏率设定为1～2Hz，应变设定为0.11000测量并记录羧甲基纤维素钠和巯基化羧甲基[0081]从图4可知，羧甲基纤维素钠动态流变特性测试结果显示(图4a)，随着时间的变[0083]设置拉伸试验测量羧甲基纤维素钠和巯基化羧甲基纤维素钠与肠黏液的最大分[0084]从图5可知。对比两组数据，巯基化羧甲基纤维素钠的最大分离力达到82.35±[0088]取1～2mL青春双歧杆菌FS2-3菌悬液(1×108CFU/mL)于离心管中，并按5～15mg/[0090]将0.5～1ml枯草芽孢杆菌SNBS-3菌液(1×108CFU/mL)与0.5～1mL上述制得的内速逐滴挤压入浓度为20～40mg/mL氯化钙溶液中，滴注时将针尖与氯化钙溶液表面的距离[0093]利用微米粒径分析仪对实施例5制备得到的双菌多核凝胶颗粒粒径进行检测，结~18mL预热的人工胃液(质量浓度比为0.85％的NaCl溶液用0.1mol/L的HCl调节pH为1.5，多核凝胶颗粒中位于外壳中的枯草芽孢杆菌SNBS-3活菌数明显高于位于内芯的青春双歧[0106]上述结果表明，本发明制备得到的双菌多核凝胶颗粒能活菌数分别为7.60×107cfu/g和为芯的青春双歧杆菌FS2-3在4℃条件下贮藏90d后存活率高达84.10此时的活菌数为6.80×107