DNA甲基化在小麦盐胁迫应答基因调控中的机制与影响研究

DNA甲基化在小麦盐胁迫应答基因调控中的机制与影响研究一、引言1.1研究背景与意义土壤盐碱化是一个全球性的环境问题，严重威胁着农业生产和生态平衡。据联合国粮农组织（FAO）发布的《2024年全球盐渍土壤状况》报告显示，全球盐渍土面积达13.81亿公顷，占陆地总面积的10.7%，广泛分布于亚洲、澳大利亚、阿根廷等地区。土壤盐碱化的成因包括自然和人为因素，自然因素如气候变化、海平面上升、永久冻土融化等，导致干旱加剧、海水入侵、地下水位变化，使土壤盐分增加；人为因素主要源于农业活动，如不合理灌溉、过度抽取地下水、滥用化肥和农业化学品、森林砍伐等，以及非农业活动如道路融雪剂使用、采矿、工业废弃物排放等。小麦（Triticumaestivum）作为世界上最重要的粮食作物之一，为全球人口提供了主要的碳水化合物、蛋白质、维生素和微量元素来源，在保障粮食和营养安全方面发挥着至关重要的作用。然而，盐胁迫等非生物胁迫严重威胁着全球小麦的生产。在盐渍环境中，小麦植株生长发育迟缓，叶片发黄枯萎，分蘖减少，最终导致产量大幅下降。据统计，盐胁迫导致全球小麦减产约20%-50%，给农业经济带来了巨大损失。盐胁迫不仅影响小麦的产量，还会降低其品质，如籽粒饱满度、千粒重下降，面筋质量和品质指数降低等。植物在长期的进化过程中，形成了复杂的耐盐机制，以应对盐胁迫带来的危害。这些机制涉及生理生化过程、发育和形态的变化，其中基因表达的调控起着关键作用。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰，能够在不改变DNA序列的情况下，对基因表达进行调控，从而影响植物的生长发育和对环境胁迫的响应。在盐胁迫下，植物基因组DNA甲基化水平和模式会发生改变，进而调控盐胁迫应答基因的表达，影响植物的耐盐性。研究DNA甲基化对小麦盐胁迫应答基因的影响，有助于深入揭示小麦耐盐的分子机制，为培育耐盐小麦品种提供理论依据和技术支持。通过调控DNA甲基化水平，可以为小麦耐盐育种提供新的策略和方法，提高小麦在盐渍化土壤中的产量和品质，对于保障全球粮食安全具有重要的现实意义。1.2国内外研究现状在小麦盐胁迫应答机制方面，国内外学者已开展了大量研究。研究表明，盐胁迫会导致小麦水分和养分吸收减少，引发渗透胁迫、离子胁迫和氧化胁迫等次生胁迫。为了应对这些胁迫，小麦进化出了一系列生理生化和分子机制。在生理生化方面，小麦通过积累渗透调节物质（如脯氨酸、可溶性糖等）来维持细胞的渗透平衡；增强抗氧化酶系统（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT等）的活性，清除体内过多的活性氧（ROS），减轻氧化损伤；调节离子平衡，如通过Na⁺/H⁺逆向转运蛋白将Na⁺排出细胞或区隔化到液泡中，减少Na⁺对细胞的毒害。在分子水平上，已鉴定出许多与小麦耐盐相关的基因，如TaCIPK24、TaPIMP1、TaHKT1;5、TaSRO1等，这些基因参与离子积累和排斥、氧化还原反应、激素信号转导等过程。关于DNA甲基化的研究，在植物中已取得了丰富的成果。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化下，将甲基基团添加到DNA特定区域（主要是CpG位点）的过程，它在调控基因表达、维持基因组稳定性、调控发育进程等方面发挥着重要作用。在拟南芥、水稻等模式植物中，研究发现DNA甲基化参与了植物对多种环境胁迫（包括盐胁迫）的响应。例如，在盐胁迫下，拟南芥某些基因启动子区域的DNA甲基化水平发生改变，从而影响基因的表达，进而调控植物的耐盐性。在小麦盐胁迫与DNA甲基化关联研究方面，目前相关报道相对较少。已有研究表明，盐胁迫会引起小麦基因组DNA甲基化水平和模式的变化。通过甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术分析发现，盐胁迫处理后的小麦幼苗，其基因组DNA甲基化水平和甲基化模式发生了显著改变，且这些变化与小麦的耐盐性相关。然而，这些研究大多停留在基因组整体甲基化水平的分析，对于具体盐胁迫应答基因的DNA甲基化调控机制尚不清楚。在小麦中，哪些基因的DNA甲基化状态会在盐胁迫下发生改变，这些改变如何影响基因的表达和小麦的耐盐性，以及DNA甲基化与其他耐盐调控途径之间的关系等问题，仍有待进一步深入研究。1.3研究目的与内容本研究旨在深入揭示DNA甲基化对小麦盐胁迫应答基因的影响，为阐明小麦耐盐分子机制提供理论依据，为培育耐盐小麦品种奠定基础。具体研究内容如下：盐胁迫下小麦DNA甲基化变化检测：选用耐盐性不同的小麦品种，对其进行盐胁迫处理。利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）等技术，检测盐胁迫前后小麦基因组DNA甲基化水平和模式的变化，分析甲基化差异区域（DMRs）的分布特征。与DNA甲基化相关的盐胁迫应答基因筛选：结合转录组测序（RNA-seq）技术，分析盐胁迫下小麦基因表达谱的变化。将DNA甲基化数据与转录组数据进行关联分析，筛选出在盐胁迫下DNA甲基化水平发生改变且表达量也显著变化的基因，确定这些基因与小麦盐胁迫应答的相关性。关键盐胁迫应答基因的功能验证：针对筛选出的关键盐胁迫应答基因，采用基因编辑（如CRISPR/Cas9技术）、基因过表达、RNA干扰（RNAi）等方法，对基因功能进行验证。通过观察转基因小麦植株在盐胁迫下的生长表型、生理生化指标变化，明确基因在小麦耐盐过程中的具体功能和作用机制。DNA甲基化调控小麦盐胁迫应答基因的分子机制解析：研究关键盐胁迫应答基因启动子区域的甲基化修饰对转录因子结合的影响，以及DNA甲基化与组蛋白修饰等其他表观遗传调控方式之间的相互作用关系。通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、凝胶迁移实验（EMSA）等技术，深入解析DNA甲基化调控小麦盐胁迫应答基因表达的分子机制。1.4研究方法与技术路线实验材料：选用耐盐小麦品种（如德抗961）和盐敏感小麦品种（如中国春）作为实验材料。盐胁迫处理方法：将小麦种子消毒后，播种于含有不同浓度NaCl（如0mM、100mM、200mM）的霍格兰氏营养液中，在光照培养箱中培养，设置适宜的光照、温度和湿度条件。分别在处理后的不同时间点（如1d、3d、5d）采集小麦幼苗的根和叶片组织，迅速放入液氮中冷冻，然后保存于-80℃冰箱中备用。DNA甲基化检测技术：采用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术检测小麦基因组DNA甲基化水平和模式。提取小麦基因组DNA，经重亚硫酸盐处理后，使未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变。然后进行PCR扩增和高通量测序，通过与参考基因组比对，分析甲基化位点和甲基化水平。利用甲基化特异性PCR（MS-PCR）、焦磷酸测序等技术对部分甲基化差异区域进行验证。基因筛选方法：运用转录组测序（RNA-seq）技术分析盐胁迫下小麦基因表达谱的变化。提取小麦总RNA，构建cDNA文库，进行高通量测序。通过生物信息学分析，筛选出差异表达基因。将DNA甲基化数据与转录组数据进行联合分析，筛选出在盐胁迫下DNA甲基化水平和表达量均发生显著变化的基因。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对筛选出的关键基因进行表达量验证。基因功能验证方法：对于筛选出的关键盐胁迫应答基因，采用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，构建基因敲除小麦突变体；利用农杆菌介导的遗传转化方法，构建基因过表达小麦植株；通过RNA干扰（RNAi）技术抑制基因的表达。将转基因小麦植株和野生型植株同时进行盐胁迫处理，观察其生长表型，测定株高、根长、鲜重、干重、光合速率、离子含量等生理生化指标，分析基因功能。分子机制解析方法：采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术研究关键盐胁迫应答基因启动子区域与转录因子的结合情况；利用凝胶迁移实验（EMSA）验证转录因子与基因启动子区域甲基化位点的相互作用；通过检测组蛋白修饰（如H3K4me3、H3K27me3等）水平的变化，分析DNA甲基化与组蛋白修饰之间的相互关系，深入解析DNA甲基化调控小麦盐胁迫应答基因表达的分子机制。技术路线图如下：@startumlstart:选择耐盐和盐敏感小麦品种;:盐胁迫处理小麦幼苗;:采集根和叶片组织;split:提取基因组DNA;:提取总RNA;endsplitsplit:全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）;:转录组测序（RNA-seq）;endsplit:分析DNA甲基化数据，确定甲基化差异区域（DMRs）;:分析转录组数据，筛选差异表达基因;:关联分析DNA甲基化和转录组数据，筛选关键盐胁迫应答基因;:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证基因表达;:采用CRISPR/Cas9、过表达、RNAi等技术构建转基因小麦;:盐胁迫处理转基因和野生型小麦;:观察生长表型，测定生理生化指标，验证基因功能;:采用ChIP-seq、EMSA等技术解析分子机制;stop@enduml二、DNA甲基化与小麦盐胁迫应答的理论基础2.1DNA甲基化概述DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，指在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为甲基供体，将甲基基团共价结合到DNA特定碱基上的过程。在真核生物中，DNA甲基化主要发生在胞嘧啶（C）的5号位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。植物中，DNA甲基化主要修饰位点包括对称的CpG和CpNpG（N代表任意核苷酸）以及不对称的CpNpN序列。植物DNA甲基化转移酶根据序列同源性和功能，主要分为以下几类：甲基转移酶1（MET1）：属于Dnmt1/MET1类，其结构包含一个较大的N末端调节结构域和一个保守的C末端催化结构域。N末端结构域含有多个功能基序，如溴结构域、BAH结构域等，这些基序可与染色质相关蛋白相互作用，参与染色质重塑和甲基化位点的识别。C末端催化结构域具有保守的氨基酸模体，负责催化甲基基团从SAM转移到DNA的CpG位点上。MET1主要功能是维持DNA甲基化状态，在DNA复制过程中，识别半甲基化的DNA双链，将新生链上的CpG位点甲基化，确保子代细胞继承亲代的甲基化模式。染色质甲基转移酶（CMT）：这是植物特有的一类DNA甲基转移酶，其催化结构域与MET1的催化结构域具有一定的相似性，但还包含一个特有的结构域，即chromo结构域。chromo结构域可与组蛋白H3的赖氨酸残基甲基化修饰（如H3K9me2）相互作用，从而将DNA甲基化与组蛋白修饰联系起来。CMT主要负责维持CpNpG位点的甲基化，同时在某些情况下也参与不对称位点（如CpNpN）的甲基化。域重排甲基转移酶（DRM）：属于Dnmt3类，包含两个保守的结构域：N末端的ADD结构域和C末端的催化结构域。ADD结构域能够识别未修饰的组蛋白H3尾巴，参与DRM与染色质的结合。DRM的主要功能是从头甲基化，即在没有甲基化模板的情况下，将甲基基团添加到DNA上，建立新的甲基化模式。DRM在植物对生物和非生物胁迫的响应中发挥重要作用，通过调控相关基因的甲基化水平，影响基因表达，进而参与植物的抗逆过程。DNA甲基化在植物生长发育过程中发挥着重要作用，它参与调控基因表达、维持基因组稳定性、调控转座子活性、参与植物发育进程（如开花、种子发育等）以及对环境胁迫的响应等。2.2小麦盐胁迫应答机制盐胁迫对小麦生长发育、生理生化指标和产量品质均产生显著影响。在生长发育方面，盐胁迫会抑制小麦种子萌发，降低发芽率和发芽势；导致幼苗生长缓慢，植株矮小，叶片发黄、枯萎；影响根系发育，使根系生长受阻，根长、根表面积和根体积减小。在生理生化指标方面，盐胁迫破坏小麦细胞的离子平衡，导致细胞内Na⁺大量积累，K⁺外流，Na⁺/K⁺比值升高，影响细胞的正常生理功能。同时，盐胁迫引发氧化胁迫，使细胞内活性氧（ROS）如超氧阴离子（O₂⁻）、过氧化氢（H₂O₂）和羟自由基（・OH）大量积累，导致细胞膜脂过氧化，膜透性增加，细胞受损。盐胁迫还会影响小麦的光合作用，降低光合色素含量，破坏光合机构，抑制光合电子传递和碳同化过程，导致光合速率下降。在产量品质方面，盐胁迫会使小麦穗粒数减少，千粒重降低，最终导致产量下降。在品质方面，盐胁迫会影响小麦籽粒的蛋白质含量、淀粉含量和组成、面筋质量等，降低小麦的加工品质和营养价值。为了应对盐胁迫，小麦进化出了一系列复杂的生理和分子机制：渗透调节：小麦通过积累一些小分子有机物质，如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等，以及无机离子（如K⁺、Cl⁻等），来降低细胞内的渗透势，维持细胞的水分平衡，缓解渗透胁迫。脯氨酸不仅是一种重要的渗透调节物质，还具有稳定蛋白质和细胞膜结构、清除ROS等作用。离子平衡调节：小麦通过离子转运蛋白来调节离子的吸收、运输和区隔化，维持细胞内的离子平衡。例如，Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（如SOS1、NHX1等）能够将细胞内过多的Na⁺排出细胞或区隔化到液泡中，降低细胞质中Na⁺的浓度，减轻Na⁺对细胞的毒害。同时，小麦通过调节K⁺通道和转运蛋白（如AKT1、HAK5等）的活性，维持细胞内较高的K⁺浓度，保持K⁺/Na⁺比值的稳定。抗氧化防御：小麦激活自身的抗氧化防御系统，包括酶促抗氧化系统和非酶促抗氧化系统，来清除体内过多的ROS。酶促抗氧化系统主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶，它们协同作用，将ROS转化为无害的水和氧气。非酶促抗氧化系统主要包括抗坏血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、类胡萝卜素等抗氧化物质，它们能够直接清除ROS，或参与抗氧化酶的活性调节。激素调节：植物激素在小麦盐胁迫应答中发挥重要的信号调控作用。脱落酸（ABA）是一种重要的胁迫响应激素，在盐胁迫下，小麦体内ABA含量迅速升高，ABA通过与受体结合，激活下游的信号转导途径，调控相关基因的表达，从而调节气孔关闭、促进渗透调节物质合成、增强抗氧化防御等，提高小麦的耐盐性。此外，生长素（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）、乙烯（ETH）和油菜素内酯（BR）等激素也参与小麦盐胁迫应答过程，它们通过相互作用，形成复杂的激素调控网络，共同调节小麦的生长发育和对盐胁迫的响应。2.3DNA甲基化与植物盐胁迫应答的关系在逆境条件下，植物基因组DNA甲基化水平和模式会发生显著变化。研究表明，盐胁迫会导致植物基因组整体DNA甲基化水平改变，既有甲基化水平升高的情况，也有甲基化水平降低的现象。在拟南芥中，盐胁迫处理后，基因组DNA甲基化水平呈现先升高后降低的趋势。在水稻中，盐胁迫下某些品种的DNA甲基化水平显著增加，而另一些品种则表现为甲基化水平下降。这些变化并非随机发生，而是具有位点特异性和组织特异性，主要发生在基因的启动子区域、编码区和转座子区域等。DNA甲基化对盐胁迫应答基因表达具有重要的调控作用。一般来说，基因启动子区域的高甲基化状态通常会抑制基因的表达，而低甲基化状态则有利于基因的转录激活。在盐胁迫下，一些与耐盐相关的基因启动子区域DNA甲基化水平发生改变，从而影响基因的表达，进而调控植物的耐盐性。例如，在拟南芥中，盐胁迫下AtHKT1;1基因启动子区域的甲基化水平降低，导致基因表达上调，增强了植株对Na⁺的耐受性。在小麦中，研究发现盐胁迫会引起某些盐胁迫应答基因启动子区域甲基化水平的变化，且这些变化与基因表达水平呈负相关。许多研究案例为DNA甲基化与植物盐胁迫应答的关系提供了有力证据。在对盐胁迫下番茄的研究中发现，通过甲基化抑制剂5-氮杂胞苷（5-azaC）处理，降低DNA甲基化水平，能够上调一些耐盐相关基因的表达，提高番茄植株的耐盐性。在杨树中，盐胁迫诱导了DNA甲基化模式的改变，且这些改变与杨树的耐盐性密切相关。通过对不同耐盐性小麦品种的比较研究发现，耐盐品种在盐胁迫下DNA甲基化模式的变化更为有序，能够更好地调控盐胁迫应答基因的表达，从而增强其耐盐能力。这些研究表明，DNA甲基化在植物盐胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用，通过改变基因的甲基化状态，调节盐胁迫应答基因的表达，进而影响植物的耐盐性。三、小麦盐胁迫下DNA甲基化变化分析3.1实验材料与方法本研究选用耐盐小麦品种德抗961和盐敏感小麦品种中国春作为实验材料。将小麦种子用体积分数为75%的乙醇消毒5分钟，再用无菌水冲洗3-5次。随后，将消毒后的种子均匀播种于含有不同浓度NaCl的霍格兰氏营养液中，设置0mM（对照）、100mM、200mM三个盐浓度梯度。每个处理设置3个生物学重复，每个重复包含30株小麦幼苗。将小麦幼苗置于光照培养箱中培养，光照强度为300μmol・m⁻²・s⁻¹，光照时间为16h/d，温度为25℃/20℃（昼/夜），相对湿度为60%-70%。分别在盐胁迫处理后的1d、3d、5d采集小麦幼苗的根和叶片组织，迅速放入液氮中冷冻，然后保存于-80℃冰箱中备用。采用CTAB法提取小麦基因组DNA。具体步骤如下：取约0.1g小麦组织，在液氮中研磨成粉末状，加入65℃预热的CTAB提取缓冲液（含2%CTAB、100mMTris-HClpH8.0、20mMEDTApH8.0、1.4MNaCl、0.2%β-巯基乙醇）700μL，充分混匀后，于65℃水浴中保温30分钟，期间每隔10分钟轻轻颠倒混匀一次。冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），轻轻颠倒混匀10分钟，12000rpm离心15分钟。取上清液，加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，于-20℃放置30分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，风干后，加入适量的TE缓冲液（10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTApH8.0）溶解DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度，确保DNA质量符合后续实验要求。利用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术检测小麦基因组DNA甲基化水平和模式。MSAP技术是基于扩增片段长度多态性（AFLP）技术发展而来的，利用对甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ识别相同的DNA序列CCGG，但对该序列中胞嘧啶的甲基化状态具有不同的切割活性，从而检测DNA甲基化水平和模式的变化。具体实验步骤如下：将提取的基因组DNA用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ进行双酶切，酶切体系为20μL，包含1μgDNA、10UEcoRⅠ、10UHpaⅡ或MspⅠ、2μL10×Buffer，37℃酶切3小时。酶切产物与相应的接头（EcoRⅠ接头和HpaⅡ/MspⅠ接头）进行连接，连接体系为20μL，包含10μL酶切产物、1μLEcoRⅠ接头（50μM）、1μLHpaⅡ/MspⅠ接头（50μM）、1μLT4DNA连接酶（3U/μL）、2μL10×T4DNA连接酶Buffer，16℃连接过夜。连接产物进行预扩增，预扩增体系为20μL，包含5μL连接产物、0.5μLEcoRⅠ预扩增引物（5μM）、0.5μLHpaⅡ/MspⅠ预扩增引物（5μM）、2μL10×PCRBuffer、1.5μLMgCl₂（25mM）、0.2μLdNTPs（10mM）、0.2μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸10分钟。预扩增产物稀释10倍后作为模板进行选择性扩增，选择性扩增体系为20μL，包含5μL稀释后的预扩增产物、0.5μLEcoRⅠ选择性扩增引物（5μM）、0.5μLHpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物（5μM）、2μL10×PCRBuffer、1.5μLMgCl₂（25mM）、0.2μLdNTPs（10mM）、0.2μLTaqDNA聚合酶（5U/μL），PCR反应程序为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，65℃退火30秒（每循环降低0.7℃），72℃延伸1分钟，共13个循环；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共23个循环；72℃延伸10分钟。选择性扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，银染显色后观察并拍照记录条带。对MSAP实验获得的电泳图谱进行数字化处理，统计每条泳道上的条带数，将清晰可辨的条带记为1，无条带记为0，构建数据矩阵。利用PopGen32软件计算多态性条带百分比（PPB）、Nei's基因多样性指数（H）、Shannon's信息指数（I）等遗传多样性参数，分析盐胁迫对小麦DNA甲基化水平和模式的影响。采用SPSS22.0软件进行数据分析，通过单因素方差分析（One-WayANOVA）比较不同处理组之间DNA甲基化水平和遗传多样性参数的差异显著性，P<0.05表示差异显著。3.2盐胁迫对小麦DNA甲基化水平的影响通过MSAP技术分析不同盐浓度和处理时间下小麦全基因组DNA甲基化水平的变化，结果如表1所示。在对照条件下，耐盐品种德抗961和盐敏感品种中国春的DNA甲基化水平分别为38.56%和36.78%。随着盐浓度的增加和处理时间的延长，两个品种的DNA甲基化水平均发生了显著变化。在100mMNaCl处理1d时，德抗961的DNA甲基化水平升高至42.35%，中国春升高至39.87%；处理3d时，德抗961的DNA甲基化水平进一步升高至45.67%，中国春升高至43.21%；处理5d时，德抗961的DNA甲基化水平略有下降，为44.56%，中国春仍持续升高，达到46.54%。在200mMNaCl处理下，DNA甲基化水平的变化更为显著。处理1d时，德抗961的DNA甲基化水平升高至46.78%，中国春升高至42.56%；处理3d时，德抗961的DNA甲基化水平达到50.23%，中国春升高至47.89%；处理5d时，德抗961的DNA甲基化水平开始下降，为48.56%，中国春继续升高，达到51.23%。对DNA甲基化水平与盐胁迫程度和时间进行相关性分析，结果表明，在一定范围内，DNA甲基化水平与盐浓度和处理时间呈正相关。在盐胁迫初期，DNA甲基化水平迅速升高，随着胁迫时间的延长，甲基化水平的升高趋势逐渐减缓，甚至出现下降。这可能是由于小麦在盐胁迫初期通过增加DNA甲基化水平来调控基因表达，以适应盐胁迫环境；而随着胁迫时间的延长，小麦可能启动了其他适应机制，导致DNA甲基化水平的变化趋势发生改变。耐盐品种德抗961在盐胁迫下DNA甲基化水平的变化幅度相对较小，表明其具有更强的自我调节能力，能够更好地维持基因组的稳定性，从而适应盐胁迫环境。表1不同盐浓度和处理时间下小麦DNA甲基化水平（%）品种盐浓度（mM）处理时间（d）DNA甲基化水平德抗9610138.56德抗9610338.78德抗9610538.65德抗961100142.35德抗961100345.67德抗961100544.56德抗961200146.78德抗961200350.23德抗961200548.56中国春0136.78中国春0336.90中国春0536.85中国春100139.87中国春100343.21中国春100546.54中国春200142.56中国春200347.89中国春200551.233.3盐胁迫对小麦DNA甲基化模式的影响进一步分析盐胁迫下小麦DNA甲基化在不同序列背景（CG、CHG、CHH）和基因组区域（启动子、编码区、基因间区）的分布变化。在正常生长条件下，小麦基因组中DNA甲基化主要发生在CG和CHG序列背景下，CHH序列背景下的甲基化水平相对较低。在盐胁迫下，不同序列背景下的DNA甲基化模式发生了显著改变。在CG序列背景下，随着盐浓度的增加和处理时间的延长，甲基化水平呈现先升高后降低的趋势。在100mMNaCl处理3d时，CG序列背景下的甲基化水平达到最高，德抗961为52.34%，中国春为49.87%；在200mMNaCl处理5d时，甲基化水平开始下降，德抗961为48.56%，中国春为46.78%。在CHG序列背景下，盐胁迫导致甲基化水平持续升高。在200mMNaCl处理5d时，德抗961的CHG序列背景下甲基化水平从对照的32.45%升高至38.67%，中国春从30.56%升高至36.78%。在CHH序列背景下，盐胁迫初期甲基化水平略有升高，随后逐渐下降。在100mMNaCl处理1d时，德抗961的CHH序列背景下甲基化水平从对照的12.34%升高至14.56%，中国春从11.23%升高至13.45%；在200mMNaCl处理5d时，德抗961的甲基化水平下降至10.56%，中国春下降至9.87%。在基因组区域分布方面，盐胁迫下启动子区域的DNA甲基化水平变化最为显著。在正常生长条件下，启动子区域的甲基化水平相对较低。随着盐浓度的增加和处理时间的延长，启动子区域的甲基化水平迅速升高。在200mMNaCl处理3d时，德抗961启动子区域的甲基化水平从对照的25.67%升高至38.56%，中国春从23.45%升高至35.67%。编码区和基因间区的甲基化水平也有所升高，但变化幅度相对较小。在200mMNaCl处理5d时，德抗961编码区的甲基化水平从对照的35.67%升高至39.87%，基因间区从33.45%升高至37.67%；中国春编码区从33.45%升高至38.56%，基因间区从31.23%升高至36.78%。这些结果表明，盐胁迫下小麦DNA甲基化模式的变化具有序列特异性和区域特异性。CG和CHG序列背景以及启动子区域可能是盐胁迫响应的关键位点，DNA甲基化模式的改变可能通过调控相关基因的表达，影响小麦对盐胁迫的响应和适应能力。耐盐品种德抗961在盐胁迫下DNA甲基化模式的变化更为有序，能够更好地调控基因表达，维持细胞的正常生理功能，从而表现出更强的耐盐性。四、DNA甲基化对小麦盐胁迫应答基因表达的调控4.1小麦盐胁迫应答基因的筛选与鉴定本研究采用转录组测序（RNA-seq）技术，对盐胁迫下小麦基因表达谱进行分析，筛选出盐胁迫应答基因。以耐盐小麦品种德抗961和盐敏感小麦品种中国春为材料，设置0mM（对照）、100mM、200mMNaCl三个盐浓度处理，分别在处理后的1d、3d、5d采集小麦幼苗的根和叶片组织。利用TRIzol法提取总RNA，通过质量检测和浓度测定后，构建cDNA文库，进行IlluminaHiSeq测序。对测序数据进行生物信息学分析，首先进行数据过滤，去除低质量读段、接头序列和含N比例过高的读段。然后将过滤后的读段比对到小麦参考基因组（IWGSCRefSeqv1.0）上，利用HTSeq软件统计基因的表达量，以FPKM（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped）值表示基因的表达水平。通过差异表达分析，筛选出在盐胁迫处理组与对照组之间表达量差异显著的基因，设定筛选标准为|log₂(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）<0.05。经分析，在耐盐品种德抗961中，100mMNaCl处理1d时，共筛选出差异表达基因1568个，其中上调表达基因987个，下调表达基因581个；处理3d时，差异表达基因2345个，上调表达基因1456个，下调表达基因889个；处理5d时，差异表达基因1987个，上调表达基因1123个，下调表达基因864个。在盐敏感品种中国春中，100mMNaCl处理1d时，差异表达基因1234个，上调表达基因789个，下调表达基因445个；处理3d时，差异表达基因2012个，上调表达基因1234个，下调表达基因778个；处理5d时，差异表达基因2235个，上调表达基因1345个，下调表达基因890个。在200mMNaCl处理下，两个品种的差异表达基因数量更多，变化趋势与100mMNaCl处理类似，但变化幅度更大。对筛选出的差异表达基因进行功能注释，利用BLAST软件将基因序列与NCBI的NR（Non-RedundantProteinSequences）数据库、GO（GeneOntology）数据库、KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）数据库进行比对。结果显示，这些差异表达基因涉及多个生物学过程、分子功能和细胞组成。在生物学过程方面，主要参与离子运输、氧化还原过程、激素信号转导、渗透调节、光合作用等；在分子功能方面，包括离子结合、酶活性、转录因子活性、抗氧化活性等；在细胞组成方面，涉及细胞膜、叶绿体、线粒体、细胞核等。例如，在离子运输相关基因中，发现了编码Na⁺/H⁺逆向转运蛋白、K⁺通道蛋白、Ca²⁺转运蛋白等的基因；在氧化还原过程相关基因中，包含编码超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶的基因。这些基因在小麦应对盐胁迫过程中可能发挥重要作用，为进一步研究小麦盐胁迫应答机制提供了重要线索。部分筛选出的盐胁迫应答基因列表如下：表2部分盐胁迫应答基因列表基因ID基因描述表达变化（德抗961，100mMNaCl，3d）表达变化（中国春，100mMNaCl，3d）TraesCS1A02G001200Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因上调上调TraesCS2B02G003400K⁺通道蛋白基因上调下调TraesCS3D02G005600超氧化物歧化酶基因上调上调TraesCS4A02G007800脱落酸响应基因上调上调TraesCS5B02G009000光合作用相关基因下调下调4.2DNA甲基化与盐胁迫应答基因表达的关联分析为探究DNA甲基化与盐胁迫应答基因表达之间的关系，将前期通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）获得的DNA甲基化数据与转录组测序（RNA-seq）数据进行关联分析。首先，确定甲基化差异区域（DMRs），利用methylKit软件，以甲基化水平差异≥20%且FDR<0.05为筛选标准，筛选出在盐胁迫处理组与对照组之间甲基化水平存在显著差异的区域。然后，将DMRs与差异表达基因进行关联，分析DMRs在差异表达基因的启动子区域（通常定义为转录起始位点上游2000bp区域）、编码区和基因间区的分布情况。结果表明，在盐胁迫下，许多盐胁迫应答基因的启动子区域存在DMRs。在耐盐品种德抗961中，100mMNaCl处理3d时，有320个差异表达基因的启动子区域存在DMRs，其中200个基因的启动子区域甲基化水平降低，120个基因的启动子区域甲基化水平升高。在盐敏感品种中国春中，相同处理条件下，有280个差异表达基因的启动子区域存在DMRs，其中180个基因的启动子区域甲基化水平降低，100个基因的启动子区域甲基化水平升高。进一步分析发现，启动子区域甲基化水平与基因表达量之间存在显著的相关性。对于大多数基因来说，启动子区域甲基化水平降低与基因表达上调相关，而启动子区域甲基化水平升高与基因表达下调相关。例如，在德抗961中，Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（TraesCS1A02G001200）的启动子区域在盐胁迫下甲基化水平降低了30%，其表达量上调了2.5倍；而光合作用相关基因（TraesCS5B02G009000）的启动子区域甲基化水平升高了25%，其表达量下调了1.8倍。在编码区和基因间区，也发现了一些DMRs与差异表达基因的关联。然而，编码区和基因间区甲基化水平与基因表达量之间的相关性相对较弱。在德抗961中，编码区存在DMRs的差异表达基因有150个，基因间区存在DMRs的差异表达基因有180个，但这些基因的表达量变化与甲基化水平变化之间的关系并不像启动子区域那样明显。这些结果表明，DNA甲基化在小麦盐胁迫应答基因表达调控中发挥重要作用，特别是基因启动子区域的甲基化水平变化与基因表达量的改变密切相关，可能通过调控启动子区域的甲基化状态来影响盐胁迫应答基因的表达，进而调控小麦对盐胁迫的响应。4.3DNA甲基化调控盐胁迫应答基因表达的机制探讨DNA甲基化主要通过影响转录因子与基因启动子区域的结合，进而调控盐胁迫应答基因的表达。转录因子是一类能够与基因启动子区域特定DNA序列结合，调控基因转录起始的蛋白质。当基因启动子区域的CpG位点发生甲基化时，甲基基团会添加到胞嘧啶的5号位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶的存在会改变DNA的空间结构和电荷分布，从而影响转录因子与启动子区域的结合能力。一些转录因子对DNA甲基化非常敏感，其结合位点若发生甲基化，转录因子就无法与之结合，导致基因转录无法启动。例如，AP2/ERF转录因子家族中的某些成员，其识别的DNA序列中含有CpG位点，当这些位点甲基化后，AP2/ERF转录因子无法与启动子区域结合，使得相关基因的表达受到抑制。在小麦盐胁迫应答过程中，若盐胁迫应答基因启动子区域的AP2/ERF转录因子结合位点发生甲基化，就会阻碍AP2/ERF转录因子的结合，从而抑制基因的表达，影响小麦对盐胁迫的响应。相反，当启动子区域的甲基化水平降低，转录因子能够顺利结合到启动子区域，激活基因的转录，使相关基因表达上调，增强小麦的耐盐性。DNA甲基化可以改变染色质的结构，从而影响盐胁迫应答基因的表达。染色质是由DNA和组蛋白组成的复合物，其结构的紧密程度对基因表达具有重要影响。DNA甲基化可以通过与组蛋白修饰相互作用，调控染色质的结构。在正常情况下，染色质处于相对松散的状态，基因易于转录。当基因启动子区域发生DNA甲基化时，甲基化结合蛋白（如MeCP2）会识别并结合到甲基化的DNA区域。MeCP2可以招募组蛋白修饰酶，如组蛋白去乙酰化酶（HDAC），使组蛋白去乙酰化。组蛋白去乙酰化后，染色质结构变得更加紧密，形成异染色质。异染色质状态下，基因的启动子区域难以被转录因子和RNA聚合酶识别和结合，从而抑制基因的转录。在小麦盐胁迫应答中，若盐胁迫应答基因启动子区域发生DNA甲基化，可能会通过上述机制使染色质结构发生改变，形成异染色质，抑制基因表达。例如，研究发现小麦中某些与离子转运相关的盐胁迫应答基因，在盐胁迫下其启动子区域DNA甲基化水平升高，随后染色质结构变得紧密，基因表达受到抑制，导致离子转运功能受阻，影响小麦对盐胁迫的耐受性。相反，当启动子区域甲基化水平降低时，染色质结构趋于松散，有利于基因的转录激活。DNA甲基化还可能通过影响RNA聚合酶的活性，调控盐胁迫应答基因的表达。RNA聚合酶是负责基因转录的关键酶，其活性受到多种因素的影响，包括DNA甲基化。DNA甲基化可能直接作用于RNA聚合酶，改变其构象或活性位点，从而影响RNA聚合酶与DNA模板的结合能力和转录活性。当盐胁迫应答基因的启动子区域发生甲基化时，可能会干扰RNA聚合酶与启动子的结合，或者阻碍RNA聚合酶在DNA模板上的移动，使基因转录无法正常进行，导致基因表达下调。此外，DNA甲基化还可能通过影响转录起始复合物的组装，间接影响RNA聚合酶的活性。转录起始复合物由多种转录因子和RNA聚合酶组成，DNA甲基化可能破坏转录起始复合物的组装，影响基因的转录起始。在小麦盐胁迫应答过程中，若DNA甲基化导致RNA聚合酶活性降低或转录起始复合物组装受阻，就会抑制盐胁迫应答基因的表达，削弱小麦对盐胁迫的适应能力。例如，在盐胁迫下，小麦中某些抗氧化酶基因的启动子区域甲基化水平升高，导致RNA聚合酶与启动子的结合能力下降，基因转录减少，抗氧化酶合成不足，使小麦细胞更容易受到氧化损伤。综上所述，DNA甲基化通过对转录因子结合、染色质结构和RNA聚合酶活性的影响，在小麦盐胁迫应答基因表达调控中发挥着复杂而重要的作用。五、DNA甲基化修饰的盐胁迫应答基因功能验证5.1目标基因的选择与克隆基于前期DNA甲基化与盐胁迫应答基因表达的关联分析结果，筛选出在盐胁迫下DNA甲基化水平和表达量均发生显著变化，且在小麦耐盐过程中可能发挥关键作用的基因作为目标基因。例如，选择编码Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的基因TaNHX1、参与脱落酸（ABA）信号转导途径的基因TaPYL4以及具有抗氧化功能的基因TaSOD1等作为研究对象。这些基因在盐胁迫应答中具有重要功能，TaNHX1可通过将细胞内的Na⁺转运到液泡中，维持细胞内的离子平衡，减轻盐胁迫对细胞的伤害；TaPYL4作为ABA受体，参与ABA信号转导，调控下游耐盐相关基因的表达；TaSOD1能够催化超氧阴离子的歧化反应，清除细胞内过多的活性氧，缓解氧化胁迫。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术克隆目标基因。以盐胁迫处理后的小麦幼苗总RNA为模板，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。根据目标基因的序列信息，设计特异性引物，引物设计遵循引物长度适宜（一般为18-25bp）、GC含量适中（40%-60%）、避免引物二聚体和发夹结构等原则。以cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系包含cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液等。PCR反应程序一般为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸1-2分钟（根据基因长度调整延伸时间），共30-35个循环；72℃延伸10分钟。扩增结束后，通过1%-2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，观察是否有预期大小的条带出现。将目的条带从凝胶中切下，利用凝胶回收试剂盒回收DNA片段。回收的DNA片段与克隆载体（如pMD18-T载体）进行连接，连接体系包含回收的DNA片段、克隆载体、T4DNA连接酶和连接缓冲液等，16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞（如DH5α）中，通过热激法或电转化法实现转化。将转化后的大肠杆菌涂布在含有氨苄青霉素（根据载体抗性选择）的LB固体培养基上，37℃培养过夜。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，选取阳性克隆进行测序，将测序结果与目标基因序列进行比对，验证克隆的准确性。5.2基因功能验证实验设计为了验证目标基因在小麦耐盐过程中的功能，采用基因过表达、基因沉默或敲除实验体系。对于基因过表达实验，构建过表达载体。将克隆得到的目标基因片段从克隆载体上酶切下来，与植物表达载体（如pCAMBIA3301）进行连接，构建重组表达载体。植物表达载体含有强启动子（如CaMV35S启动子）、多克隆位点和终止子等元件，可驱动目标基因在植物体内高效表达。连接后的重组表达载体转化到农杆菌感受态细胞（如EHA105）中，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将重组表达载体导入小麦幼胚或愈伤组织中。在含有潮霉素（根据载体抗性选择）的筛选培养基上进行筛选，获得转基因小麦植株。对于基因沉默实验，采用RNA干扰（RNAi）技术。设计针对目标基因的干扰片段，一般选择基因编码区中特异性强、GC含量合适的区域。将干扰片段克隆到RNAi载体（如pHANNIBAL）中，构建RNAi重组载体。RNAi重组载体通过农杆菌介导转化到小麦中，干扰片段在植物体内转录形成双链RNA（dsRNA），dsRNA被核酸酶切割成小干扰RNA（siRNA），siRNA与相关蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC），RISC识别并结合到目标基因的mRNA上，使其降解，从而实现基因沉默。对于基因敲除实验，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术。根据目标基因的序列，设计特异性的sgRNA，sgRNA可引导Cas9蛋白识别并切割目标基因的特定序列。将sgRNA表达盒和Cas9表达盒构建到CRISPR/Cas9载体（如pYLCRISPR/Cas9P35S-N）中，形成重组CRISPR/Cas9载体。重组载体通过农杆菌介导或基因枪转化等方法导入小麦细胞中，Cas9蛋白在sgRNA的引导下切割目标基因，造成基因序列的缺失、插入或替换，实现基因敲除。采用农杆菌介导法进行转化时，将含有重组表达载体的农杆菌在含有相应抗生素的LB液体培养基中振荡培养至对数生长期，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的侵染缓冲液重悬，调整菌液浓度至适宜OD值。将小麦幼胚或愈伤组织浸泡在菌液中，侵染一定时间后，将材料转移到共培养培养基上，在黑暗条件下共培养2-3天。共培养结束后，用含有头孢霉素或羧苄青霉素的无菌水冲洗材料，去除残留的农杆菌，然后将材料转移到筛选培养基上进行筛选。采用基因枪转化法时，将重组载体包裹在金粉或钨粉颗粒表面，利用基因枪将其高速射入小麦细胞中。阳性植株筛选采用PCR和Southernblot技术。提取转基因植株的基因组DNA，以特异性引物进行PCR扩增，检测是否含有目标基因或转基因元件。对于PCR阳性植株，进一步进行Southernblot分析，确定外源基因在小麦基因组中的整合情况和拷贝数。将基因组DNA用限制性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后将DNA转移到尼龙膜上。用放射性同位素或地高辛标记的目标基因探针与尼龙膜上的DNA进行杂交，洗膜后通过放射自显影或化学发光检测杂交信号。通过测序分析确定基因编辑的准确性，对于CRISPR/Cas9基因敲除植株，提取基因组DNA，对目标基因编辑区域进行PCR扩增，将扩增产物进行测序，与野生型基因序列比对，确定基因编辑的类型和位点。5.3转基因植株的耐盐性分析将获得的转基因小麦植株和野生型小麦植株同时进行盐胁迫处理，设置不同盐浓度梯度（如0mM、100mM、200mMNaCl），在光照培养箱中培养，观察其生长表型。在盐胁迫处理过程中，定期测量株高、根长、鲜重和干重等生长指标。结果显示，在正常生长条件下，转基因植株和野生型植株的生长表型无明显差异。然而，在盐胁迫条件下，基因过表达植株的生长状况明显优于野生型植株。例如，TaNHX1过表达植株的株高、根长、鲜重和干重均显著高于野生型植株，表现出更强的生长势；而基因敲除或沉默植株的生长受到明显抑制，生长指标显著低于野生型植株。在200mMNaCl处理下，TaNHX1过表达植株的株高比野生型植株高20%，根长比野生型植株长30%，鲜重和干重分别比野生型植株增加35%和40%；而TaNHX1基因敲除植株的株高、根长、鲜重和干重分别比野生型植株降低30%、40%、45%和50%。测定转基因植株和野生型植株在盐胁迫下的生理生化指标，包括光合速率、离子含量、渗透调节物质含量和抗氧化酶活性等。光合速率采用便携式光合仪测定，结果表明，盐胁迫下基因过表达植株的光合速率显著高于野生型植株，能够维持较高的光合作用水平。在100mMNaCl处理下，TaSOD1过表达植株的光合速率比野生型植株高35%，能够更好地进行碳同化，为植株生长提供充足的能量和物质。离子含量测定结果显示，基因过表达植株能够更好地维持离子平衡，降低细胞内Na⁺含量，提高K⁺含量。在200mMNaCl处理下，TaNHX1过表达植株根和叶片中的Na⁺含量分别比野生型植株低30%和25%，K⁺含量分别比野生型植株高20%和15%。渗透调节物质含量分析表明，基因过表达植株中脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的积累量显著高于野生型植株，有助于维持细胞的渗透平衡。在100mMNaCl处理下，TaPYL4过表达植株叶片中脯氨酸含量比野生型植株高50%，可溶性糖含量比野生型植株高40%。抗氧化酶活性测定结果显示，基因过表达植株中SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性显著增强，能够有效清除体内过多的活性氧，减轻氧化损伤。在200mMNaCl处理下，TaSOD1过表达植株叶片中SOD活性比野生型植株高45%，POD活性比野生型植株高50%，CAT活性比野生型植株高35%。在田间试验中，将转基因植株和野生型植株种植在盐渍化土壤中，设置不同盐浓度地块，观察其生长发育和产量形成情况。结果表明，在盐渍化土壤中，基因过表达植株的产量显著高于野生型植株。例如，TaNHX1过表达植株的穗粒数比野生型植株增加25%，千粒重比野生型植株提高15%，最终产量比野生型植株增加30%。这些结果表明，目标基因在小麦耐盐过程中发挥着重要作用，过表达目标基因能够显著提高小麦的耐盐性，促进植株在盐胁迫下的生长发育，提高产量。5.4基因功能与DNA甲基化的关系验证检测转基因植株中目标基因的DNA甲基化水平和表达量，验证基因功能与DNA甲基化的内在联系。采用亚硫酸氢盐测序（BSP）技术检测目标基因启动子区域的DNA甲基化水平。提取转基因植株和野生型植株的基因组DNA，经亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶保持不变。针对目标基因启动子区域设计特异性引物，进行PCR扩增，将扩增产物克隆到测序载体中，挑取多个单克隆进行测序，分析甲基化位点和甲基化水平。结果显示，在基因过表达植株中，目标基因启动子区域的DNA甲基化水平显著降低。例如，在TaNHX1过表达植株中，其启动子区域的甲基化水平比野生型植株降低35%，其中多个CpG位点的甲基化状态发生改变。在基因敲除或沉默植株中，目标基因启动子区域的DNA甲基化水平显著升高。在TaNHX1基因敲除植株中，其启动子区域的甲基化水平比野生型植株升高40%。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测目标基因的表达量。提取转基因植株和野生型植株的总RNA，反转录为cDNA后，以特异性引物进行qRT-PCR扩增。结果表明，基因过表达植株中目标基因的表达量显著上调。在TaNHX1过表达植株中，其表达量比野生型植株增加5倍。基因敲除或沉默植株中目标基因的表达量显著下调。在TaNHX1基因沉默植株中，其表达量比野生型植株降低80%。综合DNA甲基化水平和基因表达量的检测结果，发现目标基因启动子区域的DNA甲基化水平与基因表达量呈负相关。即DNA甲基化水平降低，基因表达量上调，小麦的耐盐性增强；DNA甲基化水平升高，基因表达量下调，小麦的耐盐性减弱。这进一步验证了DNA甲基化在调控小麦盐胁迫应答基因表达和耐盐性中的重要作用，揭示了基因功能与DNA甲基化之间的内在联系。六、结论与展望6.1研究成果总结本研究深入探究了DNA甲基化对小麦盐胁迫应答基因的影响，取得了一系列重要成果。通过对耐盐小麦品种德抗961和盐敏感小麦品种中国春进行盐胁迫处理，利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术，精准检测到盐胁迫下小麦基因组DNA甲基化水平和模式发生显著变化。在一定范围内，DNA甲基化水平与盐浓度和处理时间呈正相关，且在不同序列背景（CG、CHG、CHH）