CN116515838B 一种改善杨树性状的方法 （浙江农林大学）

D047-20.developmentinpoplarYi.HorticultPlantJournal.2024,1449-1462.Phytologist.2022,2189–2201.21.一种用于通过CRISPR/Cas9系统敲除杨树基因的gRNA，所述gRNA的靶序列选自SEQ9.如权利要求7所述的基因敲除方法，其特征在于，所述杨树GLR3所述共培养的培养基以WPM为基础培养基，含有15_25g/L蔗糖、6_10g/L琼脂、0.4_所述生根培养的培养基以WPM为基础培养基，含有8_12g/L蔗糖、6_10g/L琼脂、0.4_11.一种改善杨树性状的方法，所述改善杨树性状的方法为通过权利要求7_10中任一34止水土流失。现有技术中缺少良好的增加根系发达程度且降低植株高度的杨树育种方法，这样的育种将具有推广应用价值。杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，的木材质量和产量，因此有关木质部形成和发育的研究也一直是林木育种的研究的重点，其优越的力学性能和环保特性可在建筑、船舶及航天材料制作中更好地使用。G_layer[0006]本发明第一方面提供了一种用于通过CRISPR/Cas9系统敲除杨树基因的gRNA，所5[0011]在一些实施方式中，所述杨树GLR3.3a基因的编码序列如SEQIDNO:1和/或SEQ[0013]所述第二gRNA的靶序列选自SEQIDNO:15所示的序列、SEQIDNO:16所示的序[0014]所述第三gRNA的靶序列包括第一组第三gRNA的靶序列和/或第二组第三gRNA的靶[0016]所述第二组第三gRNA的靶序列为所述第一gRNA的靶序列与所述第二gRNA的靶序[0017]在一些实施方式中，所述第一NO:10所示的序列；[0019]所述第一组第三gRNA的靶序列为SEQIDNO:20所示的序列和SEQIDNO:21所示[0024]本发明第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本发明第一方面所述的[0031]在一些实施方式中，所述杨树GLR3.3a基因的编码序列如SEQIDNO:1和/或SEQ6[0041]在一些实施方式中，所述共培养的培养基以WPM为基础培养基，含有15_25g/L蔗过本发明第五方面所述基因敲除方法制备基因[0062]在一些实施方式中，所述改善杨树性状的方法为通过增加所73+的浓度为0.02_0.06mM。[0067]本发明以挖掘诱导杨树韧皮纤维的发育的P8没有说明的操作细节为本领域常规操作。除特别说明外，本发明所示核酸序列均是按照5’等位基因来源于父本，另一个同源的等位基因来源于母本。根据前述基因组数据，得到PagGLR3.3a(对应毛果杨基因组基因IDPotri.002G007400)的一个等位基因代号Pop_PagGLR3.3b(对应毛果杨基因组基因IDPotri.005G253800)的一个等位基因代号Pop_[0089]ATGGATTCTACTAGGTTTGGTTGTTGGGTATTTCTCATCTGTTTACTGCTTTCAACAACCGGATATAGTAGGAATCTGACCTCAAGGCCTGCTGTTGTGAATATTGGAGCTCTTTTTACATTCGAATCTTCGATTGGAAGAGTTGCCAAGATTGCTATTCAGGAAGCTGTCAAAGATGTAAATGCGAATTCTAGCATTCTGCGGGGCACCAAACTCAATGTTGATATGAGAAACTCTAATTGCAGTGGGTTTCTAGGAATGGTTGAAGCTTTGCGTTTTATGGAGACCGATATTGTTGCCATTATCGGCCCACAATCTTCTGTCGTTGCTCGTATCGTATCCCATGTTGCGAATCAGCTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTTCAGCAACAGACCCCAGTCTCAACTCTCTGCAGTTTCCCTTTTTTGTTCAGACCACCCAGAGCGATTTGCACCAAATGGCAGCAATATCAGACGTTGTTGATTATTATGGTTGGAAGCAGGTAACTGCCATTTACATTGATGATGATTATGGACGAAATGGCATGTCAGCTCTGGGTGATAAACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGGTTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGACTGACATCTTAGATATGCTTATTAAGGTTGCATCAATGGAATCTCGAGTTATAGTTCTCCATGTAAATCCTGATGTGGGTTTCGAGGTCTTTTCTGTGGCAAACCGTCTTCAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCTACAGATTGGCTCTCGTCTGTTTTGGATTCTGCTTCTCCTCTCCAATCAGAGACCATGGACTCAATTCAAGGAGTTCTCTTTTTTCGTCAACATACACCAGATTCAGATCGAAAGAGAGCGTTTTACTCTAGGTGGCGCAAATTGACTGGTGGTTCTTCGGGGCTGAATTCTTATGGCCTTTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCACATGCTATTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATTATCTCATTTTCTAATGATTCCAGGTTACGTTCAGTGAAAGATAGTGGTCTCCACCTTGAGGCAATGGGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATCTTGTTGGTTTGACAGGCCGTATTAAGTTTGACACAGACAGATCTCTTATTCTTCCTGCATATGATGTTAATAACGTGTTCGGAACTGGGTTCAAACGGATTGGTTACTGGTCCAATTACTCTGGTTTGACTGTCGTACCTCCTGAGATACTTTATACAAAGCCACCAAATCGTTCAAGTGCAAACCAGGAACTGTACAAAGTCATTTGGCCTGGAGATACATTGTCCACGCCACGTGGAT9GGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCACTTCGGGTCAGCTTCCGGGAGTTTGTATCACAAGCACAAGGGACAGATACATTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACATCTGCAATAACTTTGTTACCATATCCTGTTCAATATCAGTTTATCCCCTTTGGAGATGGTAAAAACAATCCGAGCTACTCAGAGCTGGTGTATAAAATTACGACGGGTTTCTTTGATGCTGTTGTTGGTGACGTTGCCATTGTCACCAACAGGACAAAAATCCTAGATTTTACACAGCCATATGTCGCATCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCTTTTAGGAAGTCAAACTCAGGAGCCTGGACTTTCCTGGGGCCATTTAGTGCCCGTTTGTGGATTGTCACCGGTTGTTTCTTCTTTGTTGTTGGCGTAGTTGTGTGGATTCTTGAGCATAGGATAAATGATGAGTTCAGGGGCCCGCCTAAAAGGCAAATCATAACCGTTATATGGTTCAGTCTCTCGACTCTATTTTCCACTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCGCGATTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTTTTAATAATCAACTCAAACTACACTGCAAGCTTGACGTCAATTCTCACAGTGCATCAACTATCTTCTCATATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGTGGTGAGCCAGTAGGGTACCAGGTGGGTTCTTTTGCTGAATATTACTTGAGTGAGGAAGTTGGAATATCAAAATCTAGGCTTGTTGCCCTGGGATCACCAGAAGAATATGCTAAAGCACTCCAACTCGGTCCTGGAAAAGGGGGTGTTGCTGCCATTGTTGATGAACGTCCCTATGTGGAACTTTTCCTTGCAGGGCAGTGCACGTTCAGGATTGTGGGTCGAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTCGCATTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTGTGGACATGTCGACTGCAATTCTAGCACTATCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTGATGCAAAGCACATGCAGTTCGGATACTTCTGAGCTTGAAGCAGATAAACTTTACCTGAGGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCCTTTGTGGTCTAGCTTGTTTCATTTCACTCGTCATACACGTCTTGCAGATTATACGACTGTTTTATGCTGCCCCTGCAGAATCTGCTTCTCCTGGTCAATGTCCCTCACGTCCTGGGTGTATCCGTAGACTATTGACATTAATGGATCAGAAGGAAGAGCCCACAAAGAATGCGAGTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGGGAAAGATCAGGACGGTGAGTCACTGAGGAATCCCAAGAGGAAAGAAACAGAAAGGACGATTGGAGCGACATCAACA[0091]ATGGATTCTATTAGGTTTGGTTGTTGGGTATTTCTCATCTGTTTACTGCTTTCAACAACTGGATATAGTAGGAATCTGACCTCAAGGCCTGCTGTTGTGAATATTGGAGCTCTTTTTACATTCGAATCTTCGATTGGAAGAGTTGCCAAGATTGCTATTCAGGAAGCTGTCAAAGATGTAAATGCGAATTCTAGCATTCTGCGGGGCACCAAACTCAATGTTGATATGAGAAACTCTAATTGCAGTGGGTTTCTAGGCATGGTTGAAGCTTTGCGTTTTATGGAGACCGATATTGTTGCCATTATCGGCCCACAATCTTCTGTCGTTGCTCGTATCATTTCCCATGTTGCGAATCAGCTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTGCAGCAACAGACCCCAGTCTCAACTCTCTGCAGTTTCCCTTTTTTGTTCAGACCACCCAGAGCGATTTGCACCAAATGGCAGCAATATCAGACGCTGTTGATTATTATGGTTGGAAGCAGGTAACTGCCATTTACATTGATGATGATTATGGACGAAATGGCATGTCAGCTCTGGGTGATAAACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGGTTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGACTGACATCTTAGATATGCTTATTAAGGTTGCATCAATGGAATCTCGAGTTATAGTTCTCCATGTAAATCCTGATGTGGGTTTCGAGGTCTTTTCTGTGGCAAACCGTCTTCAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCTACAGATTGGCTCTCGTCTGTTTTGGATTCTGCTTCTCCTCTCCAATCAGACACCATGGACTCAATTCAAGGAGTTGTCTTTTTTCGTCAACATACACCAGATTCAGATCGAAAGAGAGCGTTTTACTCTAGGTGGCGCAAATTGACTGGTGGTTCTTCGGGGCTGAATTCTTATGGCCTTTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCACATGCTATTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATTATCTCATTTTCTAATGATTCCAGGTTACGTTCAGTGAAAGATAGTGCTCTCCACCTTGAGGCAATGGGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATCTTGTTGGTTTGACAGGCCGTATTAAGTTTGACACGGACAGATCTCTTATTCTTCCTGCATATGACGTTAATAACGTGTTCGGAACTGGGTTCAAACGGATTGGTTACTGGTCCAATTACTCTGGTTTGACTATCGTACCTCCTGAGATACTTTATACAAAGCCACCAAATCGTTCAAGTGCAAACCAGGAACTGTACAAAGTCATTTGGCCTGGAGATACATTGTCCACGCCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCACTTCGGGTCAGCTTCCGGGAGTTTGTATCACAAGCACGAGGGACAGATACATTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACATCTGCAATAACTTTATTACCATATCCTGTTCAATATCAGTTTATCCCCTTCGGAGATGGTAAAAACAATCCGAGCTACTCAGAGCTGGTGCATAAAATTACGACGGGTTTCTTTGATGCTGTTGTTGGTGACGTTGCCATTGTCACCAACAGGACAAAAATCCTAGATTTTACACAGCCATATGTCGCATCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCTTTTAGGAAGTCAAACTCAGGAGCCTGGACTTTCCTGGGGCCATTTAGTGCCCGTTTGTGGATTGTCACCGGTTGTTTCTTCTTTGTTGTTGGCGTAGTTGTGTGGATTCTTGAGCATAGGATAAATGATGAGTTCAGGGGCCCGCCTAAAAGGCAAATCATAACTGTTATATGGTTCAGTCTCTCGACTCTATTTTCCACTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCGCGATTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTTTTAATAATCAACTCAAACTACACTGCAAGCTTGACGTCAATTCTCACAGTGCATCAACTATCTTCTCATATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGTGATGAGCCAGTAGGATACCAGGTGGGTTCTTTTGCTGAATATTACTTGAGTGAGGAAGTTGGAATATCAAAATCTAGGCTTGTTGCCCTGGGATCACCAGAAGAATATGCTAAAGCACTCAAACTCGGTCCTGGAAAAGGGGGTGTTGCTGCCATTGTTGATGAACGTCCCTACGTGGAACTTTTCCTTGCAGGGCAGTGCACGTTCAGGATTGTGGGTCGAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTCGCATTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTGTGGACATGTCGACTGCAATTCTAGCACTATCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTGATGCAAAGCACATGCAGTTCGGATACTTCTGAGCTTGAAGCAGATAAACTTTACCTTAGGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCCTTTGTGGTCTAGCTTGTTTCATTTCACTCGTCATATACGTCTTGCAGATTATACGACAGTTTTATGCTGCCCCTGCAGAATCTGCTTCTCCTGGTCAATGTCCCTCACGTCCTGGGTGTATCCGTAGATTATTGACATTAATGGATCAGAAGGAAGAGCCCACAAAGAATTCGAGTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGGGAAAGATCAGGACGGTGAGTCACTGAGGAATCCCAAGAGGAAAGAAACAGAAAGGACGATTGGAGCGACATCAACA[0093]ATGAACGCGGTTAGGTTTGCTTTGTGTCTTTTTCTCTTCTGTGTGCTGTTTTCATCAAGTGGATATAGTAGGAATGTGAGCTCAAGGCCTGCCGCTGTGAATATTGGAGCTATTTTTACCTTCGAATCTACGATTGGAAGAGCTGCCAAGATTGCTATCCAGGAAGCTGTCAAAGATGTGAATGCAAATTCTAGCATTCTGCATGGCACCGAACTCAAAATTCACATGAGAAACTCTAACTGCAGTGGGTTTCTAGGCTTGGCTGAAGGTTTGAAGTTCACGGAGAATGATGTCATTGCCATTATTGGCCCGCAATCTTCTGTTGTTGCCCATATTATATCCCATGTCGCTAATGAACTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTGCAGCAACAGACCCCACTCTGAACTCGCTGCAGTTCCCCTTTTTTGTTAGGACCACGCAGAGTGATTTCTACCAAATGGCGGCAATATCAGAGGTAGTTGATCATTATGGTTGGAAGCAGGTGACTGCCATTTTCATTGATAATGATTATGGACGAAATGGCGTGTCAGCTCTAGGTGATAGACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGATTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGGGTGACATCACGGATATTCTTGTTAAGGTCGCGTTAATGGAATCTCGGGTTGTAATTGTCCATGTGTATCCTGACATGGGTTTCAAGATCTTTTCCATGGCAAACCATCTTGAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCCACGGATTGGCTTTCGTCTGTTTTGGATTCTGCTTCACCTCTCCCATCAGAGACCATGGACTCAGTGCAAGGGGTTCTTGTTTTGCGTCAACACACACCAGATTCAGATAGAAAGAGAGCCTTTTCCTCTAGGTGGCACAAATTGACTGGTGGTTCTTTGGGGCTGCATTCTTATGGACTCTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCGCATGCTCTTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATAATCTCATTTTCTAACGATTCCAGGTTACCTTCTGGGGAAGGTAGTAGTCTCCACCTTGAGGCAATAAGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATTTTGTTGGTTTGACGGGCCGTATTAAGTTTGGAATAGACAGATCTCTTATTCTGCCCGCATATGATGTCATTAATGTTATTGGAACTGGGTATAGACGGATTGGTTACTGGTCCAATTATTCTGGTTTGTCTATCACGCCTCCTGAGACACTTTATACAAAGCCACCAAATCGTTCAAGCTCAAACCAGAATTTGTACAATGCCATTTGGCCTGGGGATACATTGCTTACGCCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCAATTCGGGTGAGTTTCCGAGAATTTGTATCGCAAGTACAAGGGACAGATACATTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACAGCTGCTGTAAGTCTATTACCATACCCTGTTCAATATCAGTTCATCCCCTTTGGAGATGGTAAAGAAAATCCAAGCTACACAGAGCTGGTGAATAAGATCACGACGGGTTTCTTTGATGCTGCTGTTGGTGATATTGCCATTGTAACCAAAAGAACGAAAGTCCTTGATTTTACGCAGCCATATGTTGCGTCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCATTTAGGAAGTTGAACTCTGGAGCCTGGGCTTTCCTGAGGCCATTCAGTGCCCGTATGTGGATTGTCACTGCTTGTTTCTTCCTTGTTGTTGGCTTGGTTGTGTGGATTCTGGAGCATAGGATAAATGACGACTTCAGGGGCCCTCCTAAAAGACAAATAATAACTGTTTTATGGTTCAGCCTCTCAACTCTATTTTTCGCTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCGCGGTTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTCTTAATAATCAACTCAAGCTACACTGCAAGTTTGACTTCAATTTTCACAGTGCAGCAACTATCTTCTCCTATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGCAATGAGCCTATAGGATACCAGGTGGGTTCGTTTGCTGAATATTATTTGAGAGAGGAAGTTGGAATATCCAAATCTAGGCTTGTTGCCTTGGGATCACCAGAAGCATATGCTAATGCACTCCAACTTGGTCCTGAAAAAGGGGGTGTTGCTGCCATTGTTGATGAACTTCCTTATGTGGAACTTTTCCTCTCAAGGCAGTGCACATTCAGGATTGTTGGTCAAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTTGCGTTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTTTGGATATGTCAACTGCAATTCTAGCACTCTCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTTACGCAAAGCACATGCAGTTCAGAGACATCTGAGCTTGAATCAGATAGACTTCACCTCAAGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCATTTGTGGTCTAGCTTGCTTCATTTCCCTCCTCATACACTTTTACCTGATTGCACGCAAGTTATATCACGCCACCCCTGAAGAATCTCCATCTGCTGGTCAAGGTTCCTCGCGTTCTAGGCGTCTTCATAGACTATTATCATTAATGGATGAGAAGGCTGGCCAAGAAAAGAGTGCAGTTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGAGAATGATCGGGACTGTGAGTTGGGGAGGAATCCCATGAGGAAAGAAACAGAAAGGATGACCGGAACAACATCAACT[0095]ATGAACGCGGTTAGGTTTGTTTCGTGTCTTTTTCTCTTTTGTGTACTGTTTTCATCAAGTGGATATAGTAGGAATGTGAGCTCAAGGCCTGCCGTTGTGAATATTGGAGCTATTTTTACCTTCGAATCTACGATTGGAAGAGCTGCCAAGATTGCTATCCAGGAAGCTGTCAAAGATGTGAATGCAAATTCTAGCATTCTGCATGGCACCGAACTCAAAATTCATATGAGAAACTCTAACTGCAGTGGGTTTCTAGGCTTGGCTGAAGGTTTGAAGTTCACGGAGAATGATGTCATTGCTGTTATTGGCCCGCAATCTTCTGTTGTTGCCCATATTATATCCCATGTCGCTAATGAACTTCAAGTTCCCCTATTGTCATTTGCAGCAACAGACCCCACTCTTAGCTCGCTGCAGTTCCCCTTTTTTGTTAGGACCACGCAGAGTGATTTCTACCAAATGGCGGCAATATCAGAGGTAGTTGATCATTATGGTTGGAAGCAGGTGACTGCCATTTTCATTGATAATGATTATGGACGAAATGGCGTGTCAGCTCTAGGTGATAGACTTGCAGAGAGACGTTGTAGAATATCTTACAAGGTGGGGATTCCCCCGGATTCTGGAGTTAATAGGGGTGACATCACGGATATTCTTGTTAAGGTCGCGTTAATGGAATCTCGGGTTGTAATTGTCCATGTGTATCCTGACATGGGTTTCAAGATCTTTTCCATGGCAAACCATCTTGAAATGATGGGTAATGGGTGGGTATGGATTGCCACGGATTGGCTTTCATCTGTTTTGGATTCTGCTTCACCTCTCCCATCAGAGACCATGGACTCAGTGCAAGGGGTTCTTGTTTTGCGTCAACACACACCAGATTCAGATAGAAAGAGAGCCTTTTCCTCTAGGTGGCTCAAATTGACTGGTGGTTCTTTGGGGCTGCATTCTTATGGACTTTATGCTTATGATTCTGTCTGGCTAATTGCGCATGCTCTTGATGCATTTTTTAACCAGGGTGGTATGATCTCATTTTCTAACGATTCCAGGTTACCTTCTGGGGAAGGTAGTAGTCTCCACCTTGAGGCAATAAGCATCTTTGATGATGGAAAACTTCTGCTGAATAACATATTGCAGAGTGATTTTGTTGGTTTGACGGGCCGTATTAAGTTTGGAATGGACAGATCTCTTATTCTACCTGCATATGATGTCATTAATGTTATTGGAACTGGGTATAGACGGATTGGTTACTGGTCCAATTATTCTGGTTTGTCTATCATGCCTCCTGAGACACTTTATACAAAGCCACCAAATCGCTCAAGCTCAAACCAGAATTTGTACAATGCCATTTGGCCTGGGGATACATTGCTTACACCACGTGGATGGGCTTTTGCTAACAATGGGAAGCAACTGAGAATTGGTGTGCCAATTCGGGTGAGTTTCCGAGAATTTGTATCGCAAGTACAAGGGACAGATACGTTCAAGGGTTTCTGCATAGATGTTTTTACAGCTGCTGTAAGTCTATTACCATACCCTGTTCAATATCAGTTCGTCCCCTTTGGAGATGGTAAAGAAAATCCAAGCTACACAGAGCTGGTGAATAAGATCACGACGGGTTTCTTTGATGCTGCTGTTGGTGATATTGCCATTGTAACCAAAAGAACGAAAGTCCTTGATTTTACGCAGCCATATGTTGCGTCTGGATTGGTTGTTGTGGCCCCATTTAGGAAGTTGAACTCTGGAGCCTGGGCTTTCCTGAGGCCATTCAGTGCCCGTATGTGGATTGTCACTGCTTGTTTCTTCCTTGTTGTTGGCTTGGTTGTGTGGATTCTGGAGCATAGGATAAATGACGACTTCAGGGGCCCTCCTAAAAGACAAATAATAACTGTTTTATGGTTCAGCCTCTCAACTCTATTTTTCGCTCATAGAGAAAACACTATGAGCACCCTTGCTCGGTTTGTGCTACTTATATGGCTCTTTGTGGTCTTAATAATCAACTCAAGCTACACTGCAAGTTTGACTTCAATTTTCACAGTGCAGCAACTATCTTCTCCTATTAAAGGAATTGAAAGCTTGAAGGAAAGCAATGAGCCTATAGGATACCAGGTGGGTTCGTTTGCTGAATATTATTTGAGAGAGGAAGTTGGAATATCTAAATCTAGGCTTGTTGCCTTGGGATCACCAGAAGCATATGCTAATGCACTCAAACTTGGTCCTGAAAAAGGGGGTGTTGCTGCAATTGTTGATGAACTTCCTTATGTGGAACTTTTCCTCTCAAGGCAGTGCACATTCAGGATTGTTGGTCAAGAATTTACAAAAAGTGGCTGGGGTTTTGCGTTTCCAAGAGACTCTCCCTTAGCTTTGGATATGTCAACTGCAATTCTAGCACTCTCAGAGAATGGTGATCTCCAACGGATCCATGACAAGTGGCTTACGCAAAGCACATGCAGTTCAGAGACATCTGAGCTTGAATCAGATAGACTTCACCTCAAGAGCTTTTGGGGCCTCTTTCTCATTTGTGGTCTAGCTTGCTTCATTTCCCTCCTCATACACTTTTTCCTGATTACACGCAAGTTATATCACACCAACCCTGAAGAATCTCCATCTGGTGGTCAAGGTTCCTCGCGTTCTGGGCGTCTTCATAGACTATTATCATTAATGGATGAGAAGGCTGGCCAAGACAATAGTGCAGTTAAAAGAAGGAAGTTGGAAAGATCATTATCCGACAATGATCGGGACTGTGAGTTGGGGAGGAATCCCATGAGGAAAGAAACAGAAAGGATGACCGGAACAATGTCAACT[0097]在不含琼脂、蔗糖和钙盐的MS培养基(购买自青岛高科技工业园海博生物技术有[0098]选用同一批次生根一个月后的野生型84K杨(Populusalba×P.glandulosa)杨树在杨树根系生长中具有重要的调节作用。异性表达模式。使用RpackageWGCNAv.1.71针对数据进行加权基因共表达网络分析了进一步研究PagGLR成员的组织特异性，以及在钙离子介导过程中的潜在功能与相应机[0103]前述七个基因在毛果杨中同源基因名称及相关基因在前述毛果杨基因组中的基PopGLR3.4/3.5a(Potri.002G230000)、PopGLR3.3b(Potri.005G253800)、PopGLR3.3a(Potri.002G007400)、PopGLR3.1/3.2(Potri.009G168300)、PopGLR3.6aPCR分析显示PagGLR3.3a和PagGLR3.3b在根和茎[0106]为了进一步获得详细的基因表达组织特异性信息，以84K杨基因组为模板，以GLR3.3aPro_F和GLR3.3aPro_R为引物，克隆了PagGLR3.3a的启动子ProPagGLR3.3a，以GLR3.3bPro_F和GLR3.3bPro_R为引物克隆了PagGLR3.3b的启动子ProPagGLR3IDNO:7)：TTGTTTTAATTCAATGTCGAGCTGLR3.3bPro_R(SEQIDNO:8)：TTCAATTCAATAGCACAATTA[0109]将ProPagGLR3.3a和ProPagGLR3.3b分[0112]本发明使用的CRISPR/Cas9系统(版本的使用方法参见文献YiAn,YangyanZhou,XiaoHan,ChaoShen,ShuWang,ChaoLiu,WeilunYin,XinliXia.TheGATAtranscriptionfactorGNCplaysanimportantroleinphotW.,Xie,K.,Chen,L.L.,2017.CRISPR_P2.0:AnImprovedCRISPR_Cas9ToolforGenomeEditinginPlants.MolPlant10,530_532.)和ZiFiTTargetedVersion4.2查找潜在的Cas9靶位点(方法参见SanderJD,MaederML,ReyonD,VoytasDF,JoungJK,DobbsD.ZiFiT(ZincFingerTargeter):anupdatedzincfingerengineeringtool[J]源和母本来源的靶点相同)设计5个靶点，选择位于第二外显子上的靶点T1和T2(称作靶点基因，根据基因序列特征设计特异性靶点系列2，根据前述Pop_A05G057109.T1和Pop_位于第二外显子上的靶点T1和位于第三外显子上的靶点T2(称作靶点组合2)进行后续基因因进行突变编辑操作，根据前述Pop_A02G026914.T1、Pop_G02G065355.T1、Pop_A05G057109.T1和Pop_G05G008778.T1的相同序列部分(针对PagG来源和母本来源的靶点相同)设计4个靶点，选择位于第二外显子上的靶点T1和T2(称作靶[0135]针对靶点组合1靶点T1合成寡核苷酸gRNAa1_GLR_F2和gRNAa1_GLR_R2，将二者退[0136]针对靶点组合1靶点T2合成寡核苷酸gRNAa2_GLR_F3和gRNAa2_GLR_R3，将二者退[0137]针对靶点组合2靶点T1合成寡核苷酸gRNAb1_GLR_F和gRNAb1_GLR_R，将二者退火[0138]针对靶点组合2靶点T2合成寡核苷酸gRNAb2_GLR_F和gRNAb2_GLR_R，将二者退火[0139]针对靶点组合3靶点T1合成寡核苷酸gRNAab1_GLR_F和gRNAab1_GLR_R，将二者退[0140]针对靶点组合3靶点T2合成寡核苷酸gRNAab2_GLR_F和gRNAab2_GLR_R，将二者退后进行Sanger法测序验证重组序列的正确性，分别得到重组入门载体EVC1T1、EVC2T1、转化感受态DH5α细胞中进行筛选培养，提取质粒，经电泳确定重组阳性克隆成功后进行[0158]将重组入门载体EVC1T1与重组目的载体DVC1T2混合，在LRclonaseIIenzyme[0160](1)外植体处理：取生长4_6周的84K杨树组织培养苗的嫩叶叶片作为外植体转化[0164](5)筛选培养：将叶片撕开并转移到筛选培养基上继续暗培养约两周，愈伤长出硬，生芽。本阶段大约两个月左右。分化培养基以WPM为基础培养基，还含有20g/L蔗糖、_1[0168]使用前述相同的方法，使用重组农杆菌菌液2针对靶点组合2的前述基因敲除操个阳性株，以GLRa_Mut_