基因工程的主要操作技术及原理

基因工程的主要操作技术及原理第1页DNA提取总DNA提取1、植物总DNA提取2、动物总DNA提取3、大肠杆菌总DNA提取4、质粒DNA提取第2页总DNA提取DNA应用构建基因组文库：100kbSouthern杂交(包含RFLP)50kbPCR分离基因等50kb第3页因材施提依据不一样研究需要，确保结构对应完整性尽可能排除其它大分子成份污染(蛋白质、多糖及RNA等)确保提取样品中不含对酶有抑制作用有机溶剂及高浓度金属离子在DNA提取过程中应做到第4页1、植物细胞总DNA提取总标准：取材（尽可能新鲜）液氮研磨裂解去蛋白和细胞物浓缩。第5页（1）CTAB法：CTAB(cetyltriethylammoniumbromide)(十六烷基三甲基溴化铵)原理：CTAB是一个阳离子去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶，当降低溶液盐浓度到0.3mol/LNaCl时，从溶液中沉淀，经过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。最终经过乙醇或异丙醇沉淀DNA。CTAB溶于乙醇或异丙醇进而除去在高离子强度溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，所以，在将其加入冰凉植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶降解。第6页高盐提取低盐沉淀高盐溶解乙醇沉淀经典CTAB法使用两种缓冲液，高盐提取缓冲液：1％（冷冻干燥材料）或2％CTAB（新鲜材料）、0.7mol或1.4mol/LNaCl沉淀缓冲液：1％CTAB，不含Nacl第7页操作步骤1、取幼嫩植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积65℃预热DNA提取缓冲液置于65℃恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。2、加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于1rpm离心10分钟。3、吸收上层水相，重复步骤2一次。4、吸收上层水相，加入预冷2/3体积异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min，待DNA沉淀后于1rpm离心搜集，搜集DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后DNA加适量水使其溶解。第8页5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保温1h以除去DNA中RNA。6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。7、吸收上层水相并先后加入1/10体积3M醋酸钠及2倍总体积预冷无水乙醇，接着置于-20℃冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70％乙醇洗涤2-3次，风干，最终将DNA溶于适量（200-500μl）TE中。8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳，检验DNA质量并据已知DNA分子量标准预计其浓度。调整浓度后DNA置于-20℃备用。

第9页CTAB法优点能很好地去除糖类杂质对于含糖较高材料可优先使用。在提取时能同时得到高质量DNA及RNA。可依据需要分别进行纯化，如只需要DNA，则可用RNase（核糖核酸酶）水解掉RNA。第10页

(2)SDS法

利用高浓度SDS，在较高温度(55～65℃)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采取提升盐浓度及降低温度做法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常见是加入5mol／LKAc于冰上保温，在低温条件下KAC与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中DNA用酚／氯仿抽提，重复抽提后用乙醇沉淀水相中DNA。第11页操作步骤1.将1g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2ml离心管中。2.加入1.2ml预热至65℃提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120μl20%SDS(到达终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。3.加入0.45ml5M醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000rpm离心20min。需要话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。4.加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，1rpm离心15min。第12页5.转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V冰预冷异丙醇，轻轻颠倒混匀，（见丝状沉淀）-20℃放置30分钟沉淀核酸。6.25℃，1rpm，离心10min，搜集沉淀。7.弃上清，70％乙醇洗两次。8.凉干DNA，溶于50µlddH2O（或TEbuffer），4℃保留备用。第13页SDS法优缺点优点：SDS法操作简单、温和，也可提取到分子量较高DNA。缺点：产物含糖类杂质较多。该方法所得DNA样品也可直接用于Southern杂交，但在限制性内切酶消化时需加大酶用量，并适当延长反应时间。第14页2、动物细胞总DNA提取取材，液氮研磨，裂解，去蛋白和细胞物，浓缩。裂解采取：SDS和蛋白酶K。第15页操作步骤切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。加1ml10%SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。加50ul或1mg蛋白酶K,37℃保温1-2小时,直到组织完全解体。加1ml5mol/LNaCl,混匀,10000rpm离心数秒钟。取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,10000rpm离心5分钟。第16页

取上清加1/10体积3mol/LNaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。4℃，1g离心10分钟，弃上清。70%乙醇洗涤；4℃，1g离心5分钟，弃上清，重复本步骤1次。自然干燥后加入1×TE或超纯水30-50μl，4℃or-20℃保留。第17页3、大肠杆菌总DNA提取基础思绪：（1）acultureofbacteriaisgrownandthenharvested（2）thecellsarebrokenopentoreleasetheircontents第18页裂解机械裂解化学裂解：溶菌酶orEDTAorbothSDS第19页(3)thiscellextractistreatedtoremoveallcomponentexcepttheDNA去蛋白：酚氯仿抽提(4)TheresultingDNAsolutionisconcentrated浓缩：乙醇，加单价阳离子，如Na+-20℃放置,离心。第20页第21页操作步骤100ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。加9.5mlTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。加1.5ml5mol/LNaCl,混匀。加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至洁净离心管。用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提,取上清液移至洁净管中。第22页操作步骤加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟，沉淀DNA。4℃，1g离心10分钟，弃上清；70%乙醇洗涤；4℃，1g离心5分钟，弃上清，重复本步骤1次;自然干燥后加入1×TE或超纯水30-50μl，4℃or-20℃保留。第23页4、质粒DNA提取怎样区分细菌和质粒DNA?二者DNA分子构型不一样大肠杆菌染色体DNA构型：线性或开环DNA分子质粒：共价闭合环状DNA(cccDNA)分子第24页碱法提取质粒原理pH值12.0～12.6。线性DNA会被变性，两条链彻底分开。而cccDNA则不会被变性。但氢键会被断裂，互补两条链依然会紧密地结合在一起。中性pH值cccDNA:快速地复性。线性染色体DNA:不能复性,聚集形成网状结构。离心:在上清液cccDNA。沉淀中：线性DNA和细胞残骸蛋白。第25页提取主要步骤细菌培养质粒DNA分离和纯化细菌搜集和裂解第26页试剂溶液Ⅰ:50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）溶液Ⅱ:0.2MNaOH，1%SDS溶液Ⅲ:醋酸钾（3MKAc）缓冲液，pH4.8TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)苯酚/氯仿/异戊醇（25:

24:

1）乙醇（无水乙醇、70%乙醇）第27页挑取LB固体培养基上生长单菌落，接种于2.0mLLB（含对应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。用2ml离心管搜集培养菌液；4℃，1g离心1分钟，弃上清。加入100μl冰浴质粒提取液I，涡旋混匀。加200μl新配制质粒提取液II，盖紧管口，轻轻颠倒数次，冰浴5分钟。加150μl冰浴质粒提取液III，轻轻颠倒数次，冰浴5分钟。操作步骤第28页操作步骤4℃，1g离心5~10分钟，将上清移至新离心管中，加入10μlRNA酶(1μg/μl)，37℃处理2小时。用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，充分混匀；4℃，1g离心5分钟，将上清移入新离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，充分混匀；4℃，1g离心5分钟，将上清移入新离心管中。加2倍体积预冷无水乙醇，轻轻混匀，-20℃放置30分钟~1小时。4℃，1g离心10分钟，弃上清。70%乙醇洗涤；4℃，1g离心5分钟，弃上清，重复本步骤1次。自然干燥后加入1×TE或超纯水30-50μl，4℃or-20℃保留。第29页氯化铯密度梯度离心法纯化质粒DNA

大肠杆菌染色体DNA构型：线性或开环DNA分子因其含有游离末端而易于解旋，故可结合相当大量EB分子浮力密度小。质粒共价闭合环状DNA(cccDNA)分子，因为没有游离末端，只能发生有限解旋反应，便限制了EB分子结合数量，浮力密度大。第30页RNA提取第31页预防RNA降解，抑制RNAse活性全部组织中均存在RNA酶，人皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染。需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。材料如塑料容器等皆可用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,高压灭菌。

DEPC:一个高活性烷基化试剂。常见做核酸酶抑制剂(尤其是用于灭活广泛存在核糖核酸酶)、组氨酸残基修饰剂等。第32页DEPC使用方法DEPC是RNA酶化学修饰剂,它和RNA酶活性基团组氨酸咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度高压灭菌以消除残余DEPC,不然DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理水配制然后高压灭菌。配制溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制。第33页提取方法异硫氰酸胍热苯酚法Trizol法mRNA3’末端含有多聚(A)+吸附纯化第34页动植物组织mRNA提取

1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤玻璃瓶装蒸馏水，然后加入0.1%DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。

2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤玻璃瓶中，存放于低温冰箱。第35页（一）动植物总RNA提取-Trizol法

[适用范围]:人类、动物、植物、微生物组织或培养细菌，(mg-g)[优点]：无蛋白和DNA污染。[用途]：Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离。体外翻译RNase封阻分析。分子克隆。第36页

组织液氮研磨加Trizol（50-100mg/1mlTrizol）室温放置5分钟0.2ml氯仿/1mlTrizol离心取上清每mlTrizol液加0.5ml异丙醇室温放置10min，离心取沉淀75%乙醇洗沉淀，干燥猛烈摇摆15秒，室温放置2-3分钟

1×g，10minutes，4℃第37页（二）mRNA纯化原理：mRNA3’末端poly(A)+，oligo(dT)纤维素oligd(T)高盐缓冲液，mRNA特异吸附低盐浓度或蒸馏水中，mRNA洗脱两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯mRNA第38页植物病毒RNA提取

取提纯病毒颗粒TMV等体积酚/氯仿抽提取上清等体积酚/氯仿抽提取上清等体积氯仿抽提乙醇沉淀第39页核酸电泳PCR扩增分子杂交测序主要检测技术第40页基础原理DNA或者RNA中磷酸基团是呈离子态，能够说DNA和RNA多核苷酸链能够叫做多聚阴离子，在电场下会向正极移动。

核酸电泳第41页DNA/RNA琼脂糖凝胶检测第42页一、试验原理

电泳是现在用于分离和纯化DNA/RNA片段最常见技术。当制备好一块“胶”即一块包含电解质多孔支持介质并把它置于静电场中，DNA/RNA分子将向阳极移动，这是因为DNA/RNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有富含负电荷磷酸根残基。第43页当DNA/RNA长度增加时，来自凝胶阻力就会增加，不一样长度DNA/RNA片段就会出现不一样迁移率。因而就可依据DNA/RNA分子大小使其分离。第44页分离长度凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳200bp—近50kb聚丙烯酰胺凝胶电泳5—500bp分辨率高采取不一样浓度凝胶能够分辨范围广泛DNA分子。第45页不一样浓度琼脂糖凝胶分离范围

凝胶中琼脂糖含量[%（W/V）]DNA/RNA分子分离范围（kb）0.35—600.61—200.70.8—100.90.5—71.20.4—61.50.2—320.1—2第46页EB染料

溴化乙锭（EB）是一个吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中DNA。

第47页电泳缓冲液组成

Tris—乙酸（TAE）Tris—硼酸（TBE）Tris—磷酸（TPE）其浓度约为50mmoL/L，PH为7.5—7.8，这些缓冲液均含有EDTA。这些缓冲液通常配制成浓缩液（母液），贮存于室温。

第48页常见电泳缓冲液配制缓冲液使用液浓贮存液（每升）Tris—乙酸（TAE）1×：0.04moL/LTris—乙酸

0.001moL/LEDTA50×：242gTris碱57.7mL冰乙酸100mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—磷酸（TPE）1×：0.09moL/LTris—磷酸

0.002moL/LEDTA10×：108gTris碱15.5mL85%磷酸40mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)Tris—硼酸（TBE）0.5×0.045moL/LTris—硼酸

0.001moL/LEDTA5×：54gTris碱27.5g硼酸20mL0.5moL/LEDTA(PH8.0)第49页电泳缓冲液比较缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常见TPE第50页加样缓冲液

缓冲液类型

6×缓冲液贮存温度I

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青FF40%（W/V）蔗糖水溶液4℃II

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青FF15%聚蔗糖水溶液室温III

0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青FF30%甘油水溶液4℃IV

0.25%溴酚蓝

40%（W/V蔗糖水溶液）4℃V（碱性加样缓冲液）

300mmoL/LNaoH6mmoL/LEDTA18%聚蔗糖水溶液

0．15%溴甲酚绿

0．25%二甲苯青FF4℃第51页加样缓冲液能够增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还能够使样品展现颜色，从而使加样操作更为便利。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动速率约为二甲苯青FF2.2倍，

溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动速率约与长300bp双链线性DNA相同，而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动速率则与4kb双链线性DNA相同。

第52页DNA片段长度标识

DNA片段长度标识通常叫作DNAMarker,试验使用DNA片段长度标识，普通包含250bpladder，DL，DL5000，DL10000等，DNAMarker不但能够作为凝胶中DNA片段长度一个标识，还能够作为电泳对照。第53页第54页第55页第56页将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶厚度在3—5mm之间，凝固20—60min。第57页凝胶制备注意事项1、配胶和电泳需要使用同一批次缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA迁移，并可使临近孔泳带变斜）2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长3、EB含量要适当4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少许电泳液，再熔化5、检验梳子6、拔取梳子时应均匀用力，检验凝胶孔整齐度7、凝胶稍厚些，防止样品溢出第58页注意事项与试验技巧制胶和加样过程中要防治气泡产生。EB含有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。凝胶一定要加热熔解完全，均匀，能够对着光亮地方看看清澈不清澈；普通情况下，梳子越薄而长，条带越好看；上样量不宜过多，会造成条带相互挤压；假如点样孔多出，将样点到中间，尽可能防止边缘效应，中间电场比较均匀；做胶缓冲液和跑胶缓冲液浓度应该一致；加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，不然样品渗漏或DNA带型不整齐；电泳开始时能够采取低电压使其跑出孔后，再调高电压。第59页迁移速率决定原因

DNA分子大小

线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中迁移速率与DNA分子量对数成反比。琼脂糖浓度

一个给定大小线状DNA分子,其迁移速度在不一样浓度琼脂糖凝胶中各不相同。

DNA分子构象

超螺旋DNA移动〉环状〉线状双链DNA第60页电源电压在低电压时,线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。不过伴随电场强度增加，不一样分子量DNA片段迁移率将以不一样幅度增加,片段越大,因场强升高引发迁移率升高幅度也越大,电压增加，琼脂糖凝胶有效分离范围减小。电压不得超出5v/cm。嵌入染料存在

EB嵌入到堆积碱基对之间并拉长线状和带缺口环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。。第61页

离子强度影响

电泳缓冲液组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并显著产热,严重时会引发凝胶熔化或DNA变性。第62页聚丙烯酰胺凝胶电泳第63页原理

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(N，N，N

，N

—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)作用下聚合交联成三维网状结构凝胶，以此凝胶为支持物电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。第64页聚丙烯酰胺凝胶有以下特征：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；对pH和温度改变较稳定；几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；凝胶孔径可调整，依据被分离物分子量选择适当浓度，经过改变单体及交联剂浓度调整凝胶孔径；分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高分辨率。第65页凝胶浓度(T)选择与被分离物质分子量亲密相关

分子量范围与凝胶浓度关系分子量范围 适用凝胶浓度/(%)

蛋白质

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 第66页缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺：丙烯酰胺/亚甲双丙烯酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（10％）。染