CN117165721B 一种病毒核酸载体的单颗粒分析方法 （厦门福流生物科技有限公司）

本发明涉及一种病毒核酸载体一种或多种方法可选包括制作针对病毒核酸载体的粒径标准曲线和/或浓度标准溶液对其粒径和浓度进行中各参数的缀合光学标记试剂的特异性抗靶标所述方法可以实现对传统方案获得的“病毒滴2步骤(1)：制备针对病毒核酸载体指标中各参数的光中的至少一种，所述参数包括病毒外壳蛋白标志物表达信号和/或病毒囊膜标志物表达信其中，所述病毒核酸载体包括逆转录病毒载体、单纯疱疹所述指标包括病毒核酸载体的生物功能性滴度；所述病毒核酸载体的生所述病毒核酸载体的生物功能性滴度的计算公式为：病毒核酸载体的生其中，P为具有事件阳性信号和待检测生物功能性的阳性信号的颗粒群占所有具有事3所述指标包括单纯疱疹病毒载体的生物功能性滴度，所述单纯疱疹病所述g囊膜糖蛋白包括囊膜糖蛋白gB,囊膜糖蛋白gC,囊膜糖蛋白gD,囊膜糖蛋白gE,囊膜糖蛋白gG,囊膜糖蛋白gH,囊膜糖蛋白gI,囊膜糖蛋白gJ,囊膜糖蛋白gL,囊所述指标包括重组冠状病毒载体的生物功能性滴度，所述重组冠状病目标核酸的缺失p24蛋白的慢病毒载体的10.根据权利要求3所述的检测方法，所述指标包括逆转录病毒载体的生物功能性滴所述指标包括单纯疱疹病毒载体的生物功能性滴度，所述单纯疱疹病所述g囊膜糖蛋白包括囊膜糖蛋白gB,囊膜糖蛋白gC,囊膜糖蛋白gD,囊膜糖蛋白gE,囊膜糖蛋白gG,囊膜糖蛋白gH,囊膜糖蛋白gI,囊膜糖蛋白gJ,囊膜糖蛋白gL,囊所述指标包括重组冠状病毒载体的生物功能性滴度，所述重组冠状病413.根据权利要求1所述的方法，所述步骤(1)中将所述光学试剂与含病毒核酸载体的样品混合的操作中还包括加入表面活性剂与含病毒核酸载体的15.根据权利要求13所述的方法，所述表面活性剂包括吐温型表面活性剂、曲拉通X_20.根据权利要求17或18所述的方法，所述抗体包括能与逆转录病毒外壳表达蛋白特22.根据权利要求21所述的方法，所述能与慢病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体包23.根据权利要求20所述的方法，所述能与逆转录病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗所述脂膜染料试剂包含选自能够亲合细胞膜和其它脂溶性膜结构亲脂性的荧光染料；25.根据权利要求1所述的方法，所述荧光染料包所述核酸染料试剂包括AcridineOrange、ActinomycinD、7_AAD（7_氨基放线菌素5Homodimer_1(EthD_1)、EthidiumHomodimer_2(EthD_2)、EthidiumMonoazideBromide(EMA)、HexidiumIodide、HoHoechst33342,Trihydrochloride,Trihydrate、Trihydrate_FluoroPureGrade、Hoechst34580、LDS751、NeuroTraceBlueFluorescentNisslStain、NeuroTrace28.根据权利要求1所述的方法，所述抗靶标试剂为配体或受体，所述配体或受体为29.根据权利要求1所述的方法，所述抗靶标试剂为配毒衣壳蛋白的配体或受体或者囊膜表达蛋白的配体或受体中30.根据权利要求25所述的方法，所述荧光染料中的脂膜染料分别独立选自DiD染料、PKH67染料、CellMaskGreen染料、CellMaskOrange染料、CellMaskRed染料、CellVue所述荧光染料中的核酸染料分别独立包括AcridineOrange、ActinomycinD、7_AAD（氢乙啶）、EthidiumHomodimer_1(EthD_1)、EthidiumHomodimer_2(EthD_2)、 (bis_Benzimide)、Hoechst33342,Trihydrochloride,Trihydrate、Trihydrate_FluoroPureGrade、Hoechst34580、LDS751、NeuroTraceBlueFluorescentNisslStain、NeuroTraceGreenFluorescentNisslStain、NeuroTrace530/615RedFluorescentNisslStain、NeuroTraceDeep_RedFluorescentNisslStain、POPO_16Iodide、HCSNuclearMaskDeepRedStain、HCSNuclearMaskBlueStain、HCS用于表征病毒囊膜标志物表达信号，分析具有事件阳性信号的颗粒群的荧光通道检测结具有事件阳性信号、核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信具有事件阳性信号、病毒囊膜标志物表达阳性信号和核具有事件阳性信号、核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阴33.根据权利要求1所述的方法，所述荧光具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表具有事件阳性信号、病毒囊膜标志物表达阳性信号和目标核酸具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表7具有事件阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒具有事件阳性信号、VSV_G表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体慢病毒载具有事件阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阴性信号为含有核具有事件阳性信号、核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核酸具有事件阳性信号、env囊膜蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳逆转具有事件阳性信号、核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阴性信号为具有事件阳性信号、核酸阳性信号和g囊膜糖蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核酸具有事件阳性信号、g囊膜糖蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳单纯具有事件阳性信号、核酸阳性信号和g囊膜糖蛋白表达阴性信具有事件阳性信号、核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和8具有事件阳性信号、SPIKE蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳重组冠具有事件阳性信号、核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阴性信号为含具有事件阳性信号、核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表达具有事件阳性信号、病毒外壳蛋白标志物表达阳性信号和核酸具有事件阳性信号、核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表具有事件阳性信号、核酸阳性信号和慢病毒p24蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核具有事件阳性信号、慢病毒p24蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体具有事件阳性信号、核酸阳性信号和慢病毒p24蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有核具有事件阳性信号、核酸阳性信号和gag外壳蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核酸具有事件阳性信号、gag外壳蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体逆具有事件阳性信号、核酸阳性信号和gag外壳蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有核酸9具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒群为含有目标核具有事件阳性信号、VSV_G表达阳性信号和目标核酸阴性信号的颗粒群为空壳体慢病具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和VSV_G表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和慢病毒p24蛋白表达阳性信号的颗粒群为含具有事件阳性信号、慢病毒p24蛋白表达阳性信号和目标核酸阴性信号的颗粒群为空具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和p24蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有目标具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有具有事件阳性信号、env囊膜蛋白表达阳性信号和目标核酸阴性信号的颗粒群为空壳具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失env囊膜蛋白的逆转录病毒载体具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和g囊膜糖蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有具有事件阳性信号、g囊膜糖蛋白表达阳性信号和目标核酸阴性信号的颗粒群为空壳具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和g囊膜糖蛋白表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失g囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有目标核酸和SPIKE蛋白的重组冠状病毒载体具有事件阳性信号、SPIKE蛋白表达阳性信号和目标核酸阴性信号的颗粒群为空壳重具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失SPIKE蛋白的重组冠状病毒具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表具有事件阳性信号、病毒外壳蛋白标志物表达阳性信号和目标具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和gag外壳蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有具有事件阳性信号、gag外壳蛋白表达阳性信号和目标核酸阴性信号的颗粒群为空壳具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和gag外壳蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有具有事件阳性信号、核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志物具有事件阳性信号、核酸阴性信号的颗粒群为空壳体病毒核酸号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的空壳体病毒核酸载体的颗粒群；c）具有事件阳性信物表达阴性信号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的空壳体病毒核酸具有事件阳性信号、核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志物具有事件阳性信号、核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志物志物表达阴性信号的颗粒群为含有核酸含有外壳的缺失囊膜的病具有事件阳性信号、核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志物具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志具有事件阳性信号、目标核酸阴性信号的颗粒群为空壳体病具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含有目标核酸和囊膜的缺失病毒外壳的病毒核酸载体具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志物囊膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含有目标核酸和病毒外壳的缺失囊膜的病毒核酸载具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号、病毒外壳蛋白标志膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含有目标核酸的缺失病毒外壳和囊膜的病毒核酸载体A1为采用散射光通道检测圈门所得含病毒核酸载体的样品溶液中与A2相同单位时间A2为采用散射光通道检测圈门所得浓度标准溶液中与A1相同单位时间内具有事件阳或A1为采用散射光通道检测圈门所得含病毒核酸载体的样品溶液中换算后在单位时间48.根据权利要求1所述的方法，含有核酸和囊膜蛋白的病毒信号和囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗含有核酸和囊膜的病毒核酸载体的滴度的计算方法为：P1a与病毒核酸载体中颗粒计信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗49.根据权利要求2所述的方法，空壳体慢病毒载体的滴度的计算空壳体慢病毒载体的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总数的百毒囊膜标志物表达阴性信号的空壳体病毒核酸载体的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳壳蛋白标志物表达阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的空壳体病毒核酸载体的颗信号的空壳体病毒核酸载体的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒50.根据权利要求1所述的方法，含核酸号和囊膜表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总数的百分51.根据权利要求1所述的方法，含核酸号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒52.根据权利要求1所述的方法，含核酸的性信号和病毒外壳蛋白标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒53.根据权利要求1所述的方法，含核酸的性信号和病毒外壳蛋白表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗54.根据权利要求2所述的方法，含有核酸和囊56.根据权利要求1所述的方法，含有核酸的标核酸阳性信号和囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的58.根据权利要求3所述的方法，含有目标核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号59.根据权利要求3所述的方法，含目标核目标核酸阳性信号和囊膜蛋白表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒60.根据权利要求3所述的方法，含目标核酸的缺核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗61.根据权利要求3所述的方法，含目标核酸的标核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信62.根据权利要求3所述的方法，含目标核酸的缺失63.根据权利要求3所述的方法，含有目标核酸和颗粒群占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总64.根据权利要求3所述的方法，含有目标核酸和颗粒群占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总65.根据权利要求3所述的方法，含有目标核群占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总66.根据权利要求1_18、22_65任一项所述方法68.根据权利要求67所述的方法，所述颗粒检测器为光电传感器和具有限带过滤高频69.根据权利要求19所述方法，所述流式颗粒检测设备为可实现样本流定向流动的颗71.根据权利要求70所述的方法，所述颗粒检测器为光电传感器和具有限带过滤高频72.根据权利要求20所述方法，所述流式颗粒检测设备为可实现样本流定向流动的颗74.根据权利要求73所述的方法，所述颗粒检测器为光电传感器和具有限带过滤高频75.根据权利要求21所述方法，所述流式颗粒检测设备为可实现样本流定向流动的颗77.根据权利要求76所述的方法，所述颗粒检测器为光电传感器和具有限带过滤高频[0002]病毒核酸载体为一类通过遗传操作对自身的元件进行改造后能够携带外源基因准第一款溶瘤HSV_1(orienX010)病毒开展临床试验;于2018年批准了溶瘤HSV_2(rHSV2hGM_CSF)病毒进入临床试验。而近期密集开展的非复制型重组冠状病毒疫苗的临靶标试剂中的至少一种，所述参数包括病毒外壳蛋白标志物表达信号和/或病毒囊膜标志的缺失p24蛋白的慢病毒载体的滴度、含有目标核酸的缺失p24蛋白的慢病毒载体的滴度、env囊膜蛋白的逆转录病毒的滴度、含有目标核酸和env囊膜蛋白的逆转录病毒载体的滴纯疱疹病毒载体的生物功能性滴度包括：含有核酸和g囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体的[0016]在一些实施例中，所述g囊膜糖蛋白可以为囊膜糖糖蛋白gD,囊膜糖蛋白gE,囊膜糖蛋白gG,囊膜糖蛋白gH,囊膜糖蛋白gI,囊膜糖蛋白gJ,囊膜糖蛋白gL,囊膜糖蛋白gM,囊膜糖蛋白gN中任一种或其组合。组冠状病毒载体的生物功能性滴度包括：含有核酸和SPIKE蛋白的重组冠状病毒载体的滴度、含有目标核酸和SPIKE蛋白的重组冠状病毒载体的滴度、空壳重组冠状病毒载体的滴标准溶液，记录浓度标准溶液的散射光通道和或荧光通道检测数据和/或流式颗粒检测设[0021]在一些实施例中，所述步骤(1)中所述将所述光学试剂与含病毒核酸载体的样品混合的操作中还可以包括加入表面活性剂与含病毒核酸[0022]在一些实施例中，所述步骤(1)中所述将所述光学试剂与含病毒核酸载体的样品慢病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗体、能与逆转录病毒外壳表达蛋白特异性结合的抗染料、PKH67染料、CellMaskGreen染料、CellMaskOrange染料、CellMaskRed染料、 (9_Amino_6_Chloro_2_Methoxyacridine)、BOBO (570/602),1mMsolutioninDMSO、DAPI(4',6_Diamidino_2_Phenylindole,（氢乙啶）、EthidiumHomodimer_1(EthD_1)、EthidiumHomodimer_2(EthD_2)、 (bis_Benzimide)、Hoechst332Pentahydrate(bis_Benzimide)FluoroPureGrade、Hoechst33342,Trihydrochloride,Trihydrate、Hoechst33342,Trihydrochloride,Trihydrate、Hoechst33342,Trihydrochloride,Trihydrate_FluoroPureGrade、Hoechst34580、LDS751、NeuroTrace435/455BlueFluorescentNisslStain、NeuroTrace500/525GreenFluorescentNisslStain、NeuroTrace530/615RedFluorescentNisslStain、dsDNAAssayKit、Quant_iTPicoGreendsDNAReagent、Quant_iTPicoGreendsDNAReagent、Quant_iTRiboGreenRNA检测试剂盒、Quant_iTRiboGreenRNA试剂、SYTO40BlueFluorescentNucleicAcidStain、SYTO41BlueFluorescentNucleicAcidStain、SYTOBlueFluorescentNucleicAcidStainSamplerKit(SYTOdyes40,41,42,45)、SYTO9GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTO11GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTO12GreenFlSYTO13GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTO14GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTO16GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTO21GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTO24GreenFluorescentNucleicAcidStain、SYTOBCGreen荧光核酸染料、SYTOGreenFluorescentNucleicAcidStainSamplerKit#1_SYTOdyes11_16、SYTO82OrangeFluorescentNucleicAcidStain、SYTO83OrangeFluorescentNucleicAcidStain、SYTO84OrangeSYTOOrangeFluorescentNucleicAcidStainSamplerKit_SYTOdyes、SYTO17RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTO59RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTO60RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTO61RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTO62RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTO63RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTO64RedFluorescentNucleicAcidStain、SYTORNASelectGreenFluorescentcellStain、SYTOXBlue死细胞染色剂、SYTOXBlueNucleicAcidStain、SYTOXGreen死细胞染料、SYTOXGreenNucleicAcid(612/631)、HCSNuclearMaskDeepRedStain、HCSNuclearMaskBlueStain、HCS料与所述抗靶标试剂直接缀合；或所述荧光染料借助识别基团与所述抗靶标试剂间接缀所述识别基团能够特异地识别所述抗靶标试合包括将所述光学试剂和表面活性剂与含病毒核酸载光通道用于表征核酸或目标核酸信号，另一种荧光通道用于表征病毒囊膜标志物表达信囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含目标核酸和囊膜的病毒标志物表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失囊膜的病毒核酸载体射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流式颗[0047]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和信号的颗粒群为含有目标核酸和VSV_G的慢病毒[0048]具有事件阳性信号、VSV_G表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体慢病颗粒群为含目标核酸的缺失VSV_G的慢病毒载有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流用于表征病毒囊膜标志物表达信号，分析具有事件阳性信号的颗粒群的荧光通道检测结[0051]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有和env囊膜蛋白表达信号的颗粒群为含有目标核酸和env囊膜蛋白的逆转录病毒载体的颗[0052]具有事件阳性信号、env囊膜蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳[0053]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阴性信号为含有核酸的缺失env囊膜蛋白的逆转录病毒载体的颗粒，或者具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和env囊膜蛋白表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失env囊膜蛋白的逆转录病毒载体带有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的[0055]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和g囊膜糖蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有号和g囊膜糖蛋白表达信号的颗粒群为含有目标核酸和g囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载体[0056]具有事件阳性信号、g囊膜糖蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳[0057]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和g囊膜糖蛋白表达阴性信号为含有核酸的缺g囊膜糖蛋白表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失g囊膜糖蛋白的单纯疱疹病毒载带有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的[0059]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有核SPIKE蛋白表达信号的颗粒群为含有目标核酸和SPIKE蛋白的重组冠状病毒载体[0060]具有事件阳性信号、SPIKE蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳重[0061]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阴性信号为含有核酸的缺失SPIKE蛋白的重组冠状病毒载体的颗粒，或者具有事件阳性信号、目标核酸阳性信号和SPIKE蛋白表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失SPIKE蛋白的重组冠状病毒载体的性信号和病毒外壳蛋白标志物表达阳性信号的颗粒群为含有目标核酸和病毒外壳的病毒阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表达阴性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失病毒外壳的射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流式颗[0067]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和慢病毒p24蛋白表达阳性信号的颗粒群为含[0068]具有事件阳性信号、慢病毒p24蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空[0069]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和慢病毒p24蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有散射光通道和至少两种荧光通道的流式颗粒检测设备或者带有至少两种荧光通道的流[0071]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和gag外壳蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有号和gag外壳蛋白表达阳性信号的颗粒群为含有目标核酸和gag外壳蛋白的逆转录病毒载[0072]具有事件阳性信号、gag外壳蛋白表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳[0073]具有事件阳性信号、核酸阳性信号和gag外壳蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有性信号和gag外壳蛋白表达阴性信号的颗粒群为含有目标核酸的缺失gag外壳蛋白的逆转两种荧光通道的流式颗粒检测设备或带有至少一种或至少两种荧光通道的流式颗粒检测道用于表征至少一种病毒外壳蛋白标志物表达信号或至少一种病毒囊膜标志物表达信号，膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含有核酸、病毒外壳和囊膜的病毒核酸载体的颗粒群；志物表达阴性信号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的空壳体病毒核酸载体的颗膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和囊膜的缺失病毒外壳的病毒核酸载体的颗毒囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群为含有目标核酸和囊膜的缺失病毒外壳的病毒核酸膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含有核酸含有外壳的缺失囊膜的病毒核酸载体的颗粒毒囊膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含有目标核酸和病毒外壳的缺失囊膜的病毒核酸膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含有核酸的缺失病毒外壳和囊膜的病毒核酸载体的颗毒囊膜标志物表达阴性信号的颗粒群为含有目标核酸的缺失病毒外壳和囊膜的病毒核酸[0085]A1为采用散射光通道检测圈门所得含病毒核酸载体的样品溶液中与A2相同单位[0086]A2为采用散射光通道检测圈门所得浓度标准溶液中与A1相同单位时间内具有事[0092]A1为采用散射光通道检测圈门所得含病毒核酸载体的样品溶液中换算成在单位大小和粒度分布的计算方法为根据含不同粒径的粒径标准品的粒径标准溶液的散射光通核酸载体的样品溶液的散射光通道检测圈门检测结果通过单颗粒平均散射光强度与颗粒粒径之间的关系曲线计算得到含病毒核酸载体的样品溶液中病毒粒径大小和粒度信号和囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗[0095]在一些实施例中，所述含有核酸和囊膜的病毒核酸载体的滴度的计算方法可以信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒空壳体慢病毒载体的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总数的百毒囊膜标志物表达阴性信号的空壳体病毒核酸载体的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳壳蛋白标志物表达阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的空壳体病毒核酸载体的颗信号的空壳体病毒核酸载体的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒号和囊膜表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总数的百分号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒性信号和病毒外壳蛋白标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒性信号和病毒外壳蛋白表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗标核酸阳性信号和囊膜蛋白表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号的酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有事件阳性信号目标核酸阳性信号和囊膜蛋白表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒核酸阳性信号和病毒囊膜标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗目标核酸阳性信号和病毒外壳蛋白标志物表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性目标核酸阳性信号和病毒外壳蛋白表达阴性信号的点的总数占所有具有事件阳性信号的颗粒群占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总颗粒群占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总群占所有具有事件阳性信号的颗粒群的颗粒总纯疱疹病毒载体g囊膜糖蛋白阳性信号或重组冠状病毒SPIKE蛋白阳性信号表示在对应指号或重组冠状病毒SPIKE蛋白阴性信号表示在对应指标所得结果散点图设置的圈门中，位荧光信号替代散射光信号后，以事件的形式作为输出信号来代表不低于粒径30nm且不高[0123]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+[0124]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+样品溶液中含有核酸和VSV_G的慢病毒载体的颗粒或含有核酸和VSV_G的逆转录病毒的颗载体的颗粒或含有核酸的缺失VSV_G的逆转录病毒的颗粒、和/或含目标核酸的缺失VSV_G[0125]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+[0126]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+壳含有VSV_G的慢病毒载体的颗粒或缺失衣壳含有VSV_G的逆转录病毒的颗粒、和/或含有衣壳的缺失VSV_G的慢病毒载体的颗粒或含有衣壳的缺失VSV_G的逆转录[0127]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+溶液中含有囊膜的慢病毒载体的颗粒或含有囊膜的逆转录病毒的颗粒、和/或缺失囊膜的[0128]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+中含有核酸和囊膜的单纯疱疹病毒载体颗粒、空壳单纯疱疹病毒载体的颗粒和/或含有核[0129]在一些实施例中，所述步骤(2)中所述检测的检测参数为：激光检测器488nm+样品溶液中含有核酸和囊膜的单纯疱疹病毒载体的颗粒、空壳单纯疱疹病毒载体的颗粒和/或含有核酸的缺失囊膜的单纯疱疹病毒载[0135]图2为实施例1中散射光通道的检测结果以及具有散射光阳性信号的荧光信号颗[0136]图3为对比例1中HIV_1p24浓度与吸光度的标准曲线和慢病毒载体产品的检测结[0140]图7为对比例4中散射光通道的检测结果以及具有散射光阳性信号的荧光信号颗[0141]图8为实施例4中关于不同浓度的膜通透剂处理后囊膜染料标记后阳性比率的对[0143]图10为对比例5中关于不同厂家抗体试剂标记后散射光通道的检测结果以及具有[0144]图11为实施例6中散射光通道的检测结果以及具有散射光阳性信号的荧光信号颗[0145]图12为实施例7中散射光通道的检测结果以及具有散射光阳性信号的荧光信号颗囊膜糖蛋白gC,囊膜糖蛋白gD,囊膜糖蛋白gE,囊膜糖蛋白gG,囊膜糖蛋白gH,囊膜糖蛋白gI,囊膜糖蛋白gJ,囊膜糖蛋白gL,囊膜糖蛋白gM或囊膜糖蛋白gN中的至少一种。术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结[0163]本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制将荧光染料按照EZ_Link™马来酰亚胺[0170]SYTOGreen（SYTOBCGreen_FluorescentNucleicAcidStains）、SYTO16、[0171]p24ELISA(QuickTiterHIVLentivirusQuantitationKit)购自CellCy5_VSVG抗体（PE_Cy5anti_humanVSVG，货号：NHAVSVG_PECy5_50T）、AF647_Anti_[0177]AF488_Anti_Spikeprotein[4A8],HumanIgG1,Kappa抗体购自Absolute[0181]SARS_CoV_2(2019_nCoV)SpikePseudovirus载体产品的浓度约为1×1010[0186]OptimaMax_XPTabletop[0187]X81Universa[0189]实施例1：采用核酸染料和缀合荧光染料的VSVG抗体标记后用纳米流式检测仪检测KH2PO4[0196]FlowNanoAnalyzer检测参数：激光检测器488nm+638nm；单激光通道检测[0197]双重标记后慢病毒载体的检测：采用FlowNanoAnalyzer检测双重标记后慢病毒体中融合性外壳G糖蛋白。分析具有散射光阳性信号的颗粒群的FITC荧光通道检测结果和[0198]具有散射光阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒群为含有核酸阳性信号的颗粒群为含目标核酸和VSV_G[0199]具有散射光阳性信号、VSV_G表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体慢[0200]具有散射光阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阴性信号为含有核酸的缺失性信号的颗粒群为含目标核酸的缺失VSV_G的慢病毒[0201]散射光通道的检测结果以及具有散射光阳性信号的荧光信号颗粒群结果如图2所[0203]具有散射光阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒群为含有核酸散射光阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有散射[0204]具有散射光阳性信号、VSV_G表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群为空壳体慢VSV_G表达阳性信号和核酸阴性信号的颗粒群的颗粒数占所有具有散射光阳性信号的颗粒[0205]具有散射光阳性信号、核酸阳性信号和和VSV_G表达阴性信号的颗粒群为含有核为具有散射光阳性信号、核酸阳性信号和VSV_G表达阴性信号的点的总数占所有具有散射[0206]5）慢病毒载体产品的粒径分布检测：设定检测参数为：激光检测器488nm+638品显示峰的Median值和Events值并生成拟合曲线。对相同检测参数下测试的慢病毒载体[0215]1）取慢病毒载体产品从103倍稀释起，总共稀释8个梯度（每个梯度之间相差106倍稀释之后的稀释度所在排孔全部未见绿色荧光。在104倍的稀释度可见3个阳性由于游离的p24的干扰以及具有p24蛋白表达的病毒颗粒并不代表该病毒颗粒具体侵染和例1和对比例2中，p24ELISA法测得的慢病毒载体产品的浓缩液病毒滴度为2.4×108TU/对于实际病毒滴度的高估。TCID50_GFP荧光蛋白与具有核酸和VSV_G的慢病毒载体的滴度为1.34×108TU/mL和p24ELISA法测得的慢病毒载体产品的浓缩液病毒滴度为2.4×108TU/mL低了约2个数量级，说明其对估。说明以具有核酸和VSV_G的慢病毒载体的滴度作为慢病毒载体组合物真实病毒滴度的液重悬沉淀即得到双重标记后慢病毒载体。[0228]FlowNanoAnalyzer检测参数：激光检测器488nm+638nm；单激光通道检测[0229]双重标记后慢病毒载体的检测：采用FlowNanoAnalyzer检测双重标记后慢病毒[0230]具有P24表达阳性信号和VSV_G表达阳性信号的颗粒群为含有衣壳和VSV_G的慢病[0231]具有VSV_G表达阳性信号和P24表达信号的颗粒群为缺失衣壳含有VSV_G的慢病毒[0232]具有P24表达阳性信号和VSV_G表达阴性信号为含有衣壳的缺失VSV_G的慢病毒载[0236]不同浓度的膜通透剂处理后获得含有衣壳和VSV_G的慢病毒载体的颗粒占比比较上孵育30min。加入5μL的FITC_P24抗体（厂家：NanoFCM充分混匀，冰上避光孵育60[0242]FlowNanoAnalyzer检测参数：激光检测器488nm+638nm；单激光通道检测荧光为P24荧光抗体激发信号用于表征慢病毒载体中的衣壳蛋白，分析具有的FITC荧光通[0244]具有散射光阳性信号和P24表达阳性信号的颗粒群为含有衣壳的慢病毒载体的颗[0245]具有散射光阳性信号和P24表达阴性信号的颗粒群为缺失衣壳的慢病毒载体的颗方式获得含有衣壳和VSV_G的慢病毒载体的颗粒占总病慢病毒载体颗粒数占比仅为14%，说明膜通透剂对于荧光染料穿透至慢病毒囊膜内对衣壳蛋白进行标记检测具有关键作用。[0248]实施例4：采用不同浓度的膜通透剂处理后采用囊膜染料标记后用纳米流式检测到不同浓度膜通透剂处理后的标记后的慢病毒载体（分别为0×膜通透剂处理后的标记后[0254]具有散射光阳性信号和DID膜染料阳性信号的颗粒群为含有囊膜的慢病毒载体的[0255]具有散射光阳性信号和DID膜染料阴性信号的颗粒群为缺失囊膜的慢病毒载体[0256]不同浓度的膜通透剂处理后具有散射光阳性信号的荧光信号颗粒群对比结果如的膜通透剂是获得准确含有衣壳和VSV_G的慢病毒载体颗粒测定结果的关[0264]具有核酸阳性信号和gB表达阳性信号的颗粒群为含有核酸和囊膜的单纯疱疹病[0266]具有核酸阳性信号和gB表达阴性信号的颗粒群为含有核酸的缺失囊膜的单纯疱疹病毒载体产品中含有核酸和囊膜的单纯疱疹病毒载体颗粒占比为35[0271]用PBS缓冲液将单纯疱疹病毒载体产品HSV_1或HSV_2的浓缩液稀释10倍，得溶液1，取50μL溶液1分别与20μL不同来源的缀合荧光染料的抗体AF647_Anti_HSV1+HSV2gB荧光染料的HerpesSimplexVirus体（缀合AF647荧光染料的Anti_HSV1+HSV2gD抗体，Anti_HSV1+HSV2gD抗体厂家：[0272]上述缀合AF647荧光染料的Anti_HSV1+HSV2gB抗体的制备方法包括将AF647荧光染料按照EZ_Link™马来酰亚胺蛋白标记试剂盒说明书的方法缀合至Anti_HSV1+[0273]上述缀合AF647荧光染料的HerpesSimplexVirusType1/2gB抗体的制备方法包括将AF647荧光染料按照EZ_Link™马来酰亚胺蛋白标记试剂盒说明书的方法缀合至HerpesSimplexVirusType1/2gB抗体，获得缀合AF647荧光染料的HerpesSimplex[0275]上述缀合AF647荧光染料的Anti_HSV1+HSV2gD抗体的制备方法包括将AF647荧光染料按照EZ_Link™马来酰亚胺蛋白标记试剂盒说明书的方法缀合至Anti_HSV1+[0277]取对比例5步骤1）所得双重标记后单纯疱疹病毒载体按[0278]具有散射光阳性信号和荧光抗体表达阳性信号的颗粒群为含有囊膜特定标志物[0279]具有散射光阳性信号和荧光抗体表达阴性信号的颗粒群为缺失囊膜特定标志物[0280]获得含有囊膜特定标志物表达阳性的单纯疱疹病毒载体颗粒的颗粒占比比较结[0281]结论：在本实施例5和对比例5中，比较AF647_Anti_HSV1+HSV2gB抗体[10B7]（缀合AF647荧光染料的Anti_HSV1+HSV2gB抗体[10B7]，Anti_HSV1+HSV2gB抗体Anti_HSV1+HSV2gD抗体（缀合AF647荧光染料的Anti_HSV1+HSV获得对纯疱疹病毒载体核酸和囊膜同时标记的最优结果。50μL溶液1与20μLPKH67脂膜染料（厂家：sigma）于37℃孵育30min，4℃1μMSYTO62Red核酸染料的PBS缓冲液重悬沉淀即得[0290]双重标记后单纯疱疹病毒载体的检测：采用FlowNanoAnalyzer检测双重标记后PC5荧光表征核酸染料激发信号用于表征单纯疱疹病毒载体的核酸。分析具有散射光阳性[0291]具有散射光阳性信号、SYTO62阳性信号和PKH67阳性信号的颗粒群为含有核酸和[0292]具有散射光阳性信号、SYTO62阴性信号和PKH67阳性信号的颗粒群为空壳单纯疱[0293]具有散射光阳性信号、SYTO62阳性信号和PKH67阴性信号为含有核酸的缺失囊膜体的颗粒占所有具有散射光阳性信号的颗粒群的颗粒总数的百分比测于37℃孵育30min，4℃100000g离心80min，弃上清，用PBS缓冲液重悬