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DB34DB34/T3208—2018羊传染性脓疮病毒分离鉴定技术规程TechnicalRegulationforIsolationandIdentificationofGoatContagiousEcthymaVirus2018-10-20发布2018-11-20实施安徽省质量技术监督局发布I心1NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技增殖表皮癌细胞（HeLa）、羊睾丸原代细胞（Lambtestiscells，LT）、DMEM培养基、M199液温融解，反复三次。经5000r/min离心10min，取上清，并加入青霉素和链霉素，终浓度为20002养液，用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5%CO₂培养箱，37℃下吸附2h,期间每隔30min轻轻摇晃一次。弃去样品液，用灭菌PBS清洗三次，加入5mL细胞维持液(血清含量为2%),培养箱内继续培养5d。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况，如出现CPE(特征病变为：细胞间隙增大、细胞核固缩、细胞圆化脱落),收集细胞培养上清及细胞裂解液。同时设立空白对照(见图1)。5.2.1原代细胞制作选择2～3月龄健康雄性绵羊，无菌摘取睾丸，并浸泡于含双抗的M199培养基中保存，将睾丸组织放入平皿中，剥弃髓鞘及白膜，除去脂肪层，用含双抗的灭菌PBS清洗2～3次，放入烧杯中将睾按组织量的4倍加入胰酶消化液，37℃消化30min,至睾丸组织呈蓬松状，加入M199培养液清洗，将胰酶消化液彻底冲洗干净，加入适量生长液(含10%血清的M199培养基),用玻璃珠振荡法分散细胞，6层纱布进行过滤，取滤液进行细胞计数，用生长液将细胞密度调整为100～150万个/mL的细胞悬液，7mL/瓶(T25细胞培养瓶),置37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。用灭菌PBS清洗三次，接种1mL处理好的样品，于5%CO₂培养箱，37℃下吸附1h,期间每隔15min轻轻摇晃一次。吸附完成后，弃去样品液，用灭菌PBS清洗三次，加入5mL细胞维持液(血清含量为2%),培养箱内继续培养4d。在培养过程中每日观察CPE产生情况，如出现CPE,收集细胞培同时设立空白对照(见图2)。3A:病变的羊睾丸原代细胞；B:对照细胞性条带(见图3)

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