CN118345184B 基于时珍法的中药鉴定方法及应用 （中国医学科学院药用植物研究所）

202310217601.72023.03.03号本申请公开了一种基于时珍法的大黄鉴定而能够基于所述标准特异性靶标序列实现对待意待检测中药样品与指定中药基原物种同一性的标准特异性靶标序列，消除了脱靶等失误风2(1)通过构建基因组图谱或浅层测序获得中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组(2)根据Taqmanprobe_basedreal_timePCR系统从所述小片段基因组文库中提取候候选序列及扩增候选序列所在区域的引物中的G+C含量为30％_80%;根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物退火温度分别为55℃_60℃以及68℃_70℃,且引物对间退火温度相差不超过2℃;候选序列及扩增候选序列所在区域的引物长度为15_30上下游扩增候选序列所在区域的引物间隔50_150bp且正向引物靠近根据候选序列设根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物不含发卡结构上下游扩增候选序列所在区域的引物3'端5bp内G/根据候选序列设计的荧光探针中的C碱基多于G碱基；和/或候选序列与混伪品及近缘IDNOs：18和16示出的引物对、以及以FAM_GCTTGAATGAAAGTCAGGCACTCCGCCA_BHQ示出的Taqman探针来检测所述DNA底物中是否存在所述标准特异性靶的引物对来扩增待检测中药的基因组DNA并回收扩增的标准特异性靶标序列作为DNA底物；或者利用特异性扩增包含标准特异性靶标序列的DNA序列的引物来扩增待检测基因组DNA并回收扩增得到的包含标准特异性靶标序列的DNA序列5.如权利要求1_4任一所述的方法，所述标准特异性靶标核苷酸用于对大黄或源自大34[0001]本申请涉及中药鉴定技术领域，具体涉及一种基于时珍法(Analysisofwhole_[0004]此前已有多种物种特异性DNA序列的识别方法，包括CRISPR/Cas系统、TaqManCas蛋白(如Cas12a和Cas13a)的反式切割活性：c统通过在PCR反应过程中添加特异性识别靶标序列的荧光探针，可通过检测荧光信号鉴定适用于不同应用场景。但是目前已经筛选得到的物种特异性靶标序列往往具有特异性较DNA序列识别方法在中药分子鉴定方面的根据应用场景选择不同检测方法并筛选相应的物种标准特异性靶标序列，充分挖掘了核、5对样品的全基因组进行测序即可判定任意待检测中药样品与指定中药基原物种的同一性，[0007](1)获得中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列，构建小片段基因组文[0008](2)从所述小片段基因组文库中提取候选靶标序列并进行分析，从所述候选靶标序列中筛选符合选自筛选条件(a)至(d)中的至少一种的候选序列作为标准特异性靶标序[0017]根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物退火温度分别为55℃_60℃以及68℃_70℃,且引物对间退火温度相差不超过2℃;[0019]上下游扩增候选序列所在区域的引物间隔50_150bp且正向引物靠近根据候选序[0020]根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物不含发卡[0025](c)根据候选序列设计的扩增引物GC含量为40％_60且四种核苷酸均匀分布，[0027]根据候选序列设计的扩增引物不含反向重复序列以及大于3bp的自互补序列，引[0028]根据候选序列设计的扩增引物退火温度为55_60℃,引物对之间的退火温度相差不超过2℃;[0029]根据候选序列设计的扩增引物3'端5个碱基中的G/C碱基多于6[0030]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2[0032]候选序列所在区域的GC含量在30％_80%;[0036]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2[0038]在一些实施方式中，通过构建基因组图谱或浅层测序获得所述中药基原物种的[0040]在一些实施方式中，针对上述方法指定的中药基原物种为掌叶大黄(Rheumpalmatum)、唐古特大黄(Rheumtanguticum)或药用大黄(Rheumofficinale)，但不限于PAM的候选靶标序列构建候选靶标序列库)；针对TaqManprobe_basedreal_timePCR系7通过调节候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列的差异核苷酸示出的靶标核苷酸序列。酸序列。标核苷酸序列。crRNA来检测所述DNA底物中是否存在所18和16示出的引物对、以及以FAM_GCTTGAATGAAAGTCAGGCACTCCGCCA_BHQ示出的Taqman探针来检测所述DNA底物中是否存在所述标准特异性靶标序述DNA底物中是否存在所述标准特异性靶标序列。8物对来检测所述DNA底物中是否存在所述标准特异性靶标的引物对来扩增待检测中药的基因组DNA并回收扩增的标准特异性靶标序列作为DNA底物；或利用特异性扩增包含标准特异性靶标序列的DNA序列的引物来扩增待检测基因组DNA并回收扩增得到的包含标准特异性靶标序列的DN[0053]例如，在选择CRISPR/Cas12a系统作为靶标序列检测系统时，可利用以SEQID待检测中药的基因组DNA并回收扩增的标准特异性靶标序列作为DNA[0054]在一些优选的实施方式中，所述CRISPR/Cas12a系统包括：基因编辑缓冲液、[0055]作为示例，就所述CRISPR/Cas12a系统而言，可选择N准特异性靶标序列(1ng/μL)和4μLPoly_C_FQ(400nM)后在37℃孵育并在ex483nm/λem535nm(根据所选荧光信号分子确定)分别检测荧[0060]在一些优选的实施方式中，所述Taqmanprobe_basedreal_9[0070](2)反应条件为95℃30sec；30个循环：[0076](2)反应条件为95℃30sec；30个循环：[0078](4)分析测序结果，如测序结果中含有标准特异性靶标序列可判定待检测物种与酸(TTTCTTGTGGCGGAGTGCCTGACTT)；(5)以SEQIDNO：17示出的靶标核苷酸(GCTTGAATGAAAGTCAGGCACTCCGCCA)；(6)以SEQIDNO：19示出的靶标核苷酸(AAGCTGGCTGTCATTCAGCT)；或(7)以SEQIDNO：20示出的靶标核苷酸[0080]另一方面本发明提供了上述的标准特异性靶标核苷酸在对大黄或源自大黄的材[0081]本发明首次发现了在大黄中存在上文示出的物种特异性的标准特异性靶标核苷[0082]在一个方面，本发明提供了用于对大黄或源自大黄的材料进行物种鉴定的引物[0083](1)Ro_cp_1F：CCAAATTGCCCGAAGCCTATG(SEQIDNO：9)，和Ro_cp_1R：[0084](2)Rp_cp__1F：GTTTAGGCGGTACGTACATAGA(SEQIDNO：11)，和Rp_cp__1R：[0085](3)Rt_cp__1F：CGCTTTCGCCAGTATCATTAT(SEQIDNO：13)；和Rt_cp__1R：[0086](4)Ro_wg__1F：ATGGCGAGAGAGGTGTTCCTAAA(SEQIDNO：15)；和Ro_wg__1R：[0087](5)Ro_wg_2F：GCTGTCATTCAGCTGTTCTCTGT(SEQIDNO：18)；和Ro_wg_2R：[0088](6)Ro_wg_3F：AAGCTGGCTGTCATTCAGCT(SEQIDNO：19)；和Ro_wg_3R：[0089](7)Ro_wg_4F：AAGCTGGCTGTCATTCAGCT(SEQIDNO：19)；和Ro_wg_4R：[0091]在另一方面，本发明涉及一种用于大黄或源自大黄的材2以及无菌超纯水。[0094]在一些优选的实施方式中，所述Taqman探针系统的反应试剂包括：DNA聚合酶、2中，所述Taqman探针的荧光基团包括FAM，淬灭基团包括BHQ。在具体实施方式中，所述Taqman探针以FAM_GCTTGAATGAAAGTCAGGCACTCCGC式中，所述Cas12a为LbaCas12a(Cpf1)；所述荧光信号分子包括Poly_C_FQ(5’_FAM_[0100]在本文中，本发明的示例性的实施方案可通过如下的编号段落中的内容进行说[0102](1)获得中药基原物种的核、叶绿体和线粒体基因组序列，构建小片段基因组文[0103](2)从所述小片段基因组文库中提取候选靶标序列并进行分析，从所述候选靶标序列中筛选符合选自筛选条件(a)至(d)中的至少一种的候选序列作为标准特异性靶标序[0107]候选序列5'端6个核苷酸中G+C含量为30％_80%;[0111](b)候选序列及扩增候选序列所在区域的引物中的G+C含量为30％_80%;[0112]根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物退火温度分别为55℃_60℃以及68℃_70℃,且引物对间退火温度相差不超过2℃;[0114]上下游扩增候选序列所在区域的引物间隔50_150bp且正向引物靠近根据候选序[0115]根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物不含发卡[0120](c)根据候选序列设计的扩增引物GC含量为40％_60且四种核苷酸均匀分布，[0122]根据候选序列设计的扩增引物不含反向重复序列以及大于3bp的自互补序列，引[0123]根据候选序列设计的扩增引物退火温度为55_60℃,引物对之间的退火温度相差不超过2℃;[0124]根据候选序列设计的扩增引物3'端5个碱基中的G/C碱基多于[0125]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2[0127]候选序列所在区域的GC含量在30％_80%;[0131]候选序列与混伪品及近缘物种的核、叶绿体和线粒体基因组进行比对至少含有2和4示出的靶标核苷酸序列；[0137]所述中药基原物种为药用大黄，并且所述靶标序列检测系统为TaqManprobe_标核苷酸序列；[0139]所述中药基原物种为药用大黄，并且所述靶标序列检测系统为示出的靶标核苷酸序列。靶标序列检测系统为CRISPR/Cas12a系统，并且所述标准特异性靶标序列包括以SEQID[0143]9.如段落1_5中任一段所述的方法，其中，采用TaqManpGCTTGAATGAAAGTCAGGCACTCCGCCA_BHQ示出的Taqman探针来检测所述DNA底物中是否存在所述标准特异性靶标序列。异性靶标序列的引物对来扩增待检测中药的基因组DNA并回收扩增的标准特异性靶标序列测基因组DNA并回收扩增得到的包含标准特异性靶标序列的DNA序列作[0148]14.如段落1_5和9中任一项所述的方法，其中，所述Taq[0151]17.大黄的标准特异性靶标[0152]18.段落17所述的标准特异性靶标核苷酸在对大黄或源自大黄的材料进行物种鉴2以及无菌超纯水。2GCTTGAATGAAAGTCAGGCACTCCGCCA[0171]30.段落20或21所述的引物对或段落22_29中任一段所述的试剂盒在如下方面的[0175]以下将结合附图对本发明的示例性方案作进一步说明，以充分说明本发明的目[0177]图2为本公开的示例性的基于CRISPR/Cas12a系统的时珍法应用于药用大黄鉴定[0178]图3为本公开的示例性的基于CRISPR/Cas12a系统的时珍法应用于掌叶大黄鉴定[0179]图4为本公开的示例性的基于CRISPR/Cas12a系统的时珍法应用于唐古特大黄鉴[0180]图5为本公开的示例性的基于CRISPR/Cas12a系统的时珍法应用于药用大黄鉴定[0181]图6为本公开的示例性的基于TaqManprobe_basedreal_timePCR系统的时珍法[0186]图11示出了将时珍法应用于含大黄中成药的检测时，Ro_cp_medicine、Rp_cp_medicine和Rt_cp_medicine组的结[0187]图1示出本申请的时珍法的示意性流程图，下面结合大黄中药的鉴定过程作为具对三种大黄进行区分十分有必要。然而常用的分子鉴定方法如DNA条形码等并不能区分大将其用Jellyfish(v1.1.12)分成(L_25+1)个长度为25bp的序列或(L_28+1)个长度为28bp[0193](3)从大黄的小片段基因组文库中提取带有PAM的序列(本实施例中采用CRISPR/依据以下筛选原则使用Bowtie(v1.1.0)选择用于鉴定大黄植物的标准特异性靶标序比对至少含有3个差异核苷酸；候选序列所在区域_50bp到+300bp或_300bp到+50bp内不存名为Ro_wg_target1。序列如下(5[0198]根据选定的CRISPR/Cas系统以及crRNA设计原则，设计与标准特异性靶标序列匹书提取基因组DNA。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度。根据标准特异性靶标序列所在的区域设计引物来扩30sec；72℃2min；72℃10min；10℃保存。PCR产物使用TIANGEN公司的UniversalDNAPurificationKit按照使用说明书回收纯化，用2％琼脂糖凝胶电泳检测标准特异性靶标[0213](5)时珍法鉴定大黄植物样品。分别使用Ro_cp_crRNA1、Rp_cp_crRNA1、Rt_cp_ex483nm/(P＞0.01)。该结果说明基于CRISPR/Cas12a系统的时珍法能准确快速地鉴定三种大黄植[0218](3)从大黄的小片段基因组文库中提取不含超过3个连续重复碱基以及3个连续G特异性靶标序列：[0219]候选序列及扩增候选序列所在区域的引物中的G+C含量为30％_80根据候选序列设计的荧光探针与上下游扩增候选序列所在区域的引物退火温度分别为55℃_60℃以及68℃_70℃,且引物对间退火温度相差不超过2℃；候选序列及扩增候选序列所在区域的引[0220]本实施例从药用大黄的核基因组中筛选出一条标准特异性靶标序列，命名为Ro_[0224]根据标准特异性靶标序列上下游片段设计扩增引物，分别命名为Ro_wg_2F和Ro_用TaKaRa公司的ProbeqPCRMix进行实验，qPCR反应总体积为20μL：10μL2×Taq℃保存。明基于TaqManprobe_basedreal_timePCR的时珍法能准确快速地[0233](3)构建大黄候选靶标序列库，从大黄的小片段基因组文库中提取不富含GC区的[0234]根据候选序列设计的扩增引物GC含量为40_60且四种核苷酸均匀分布(没有聚之间的退火温度相差不超过2℃；根据候选序列设计的扩增引物3'端5个碱基中的G/C碱基[0235]本实施例从药用大黄的核基因组中筛选出一条标准特异性靶标序列，命名为Ro_[0237]根据选定的PCR系统以及引物设计原则，设计与标准特异性靶标序列匹配的检测[0246](3)由于Sanger测序系统对序列要求较低，直接基于大黄的小片段基因组文库依[0248]本实施例从药用大黄的核基因组中筛选出一条标准特异性靶标序列，命名为Ro_[0250]根据选定的PCR系统以及引物设计原则，设计与标准特异性靶标序列匹配的测序组DNA作为DNA底物(即，总DNA样品)，设置Ro_wg_sequencing组。使用艾德莱公司的Taq掌叶大黄和唐古特大黄均无与标准特异性靶标序列完全一致的序列。该结果说明基于施例1中已经获得，本实施例直接使用Ro_cp_crRNA1、Rp_cp_crRNA1和Rt_cp_crRNA1作为盖，编号为T12。将所述待检测的药材样品用球磨仪粉碎，然后按照TIANGEN公司提供的PlantGenomicDNAKit使用说明书提取基因组DNA。用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测基因组℃保存。[0259]PCR产物使用TIANGEN公司提供的UniversalDNAPurificationKit按照说明书回收纯化，用2％琼脂糖凝胶电泳检测标准特异性靶标序列的完整性，然后用Nanodrop2000C分光光度计检测其纯度和浓度，回收的标准特异性靶标序列所在区域片段用作后续标准特异性靶标序列所在区域片段作为DNA底物分别对应设置Ro_cp_herb、Rp_cp_herb和L),4μLPoly_C_FQ(400nM)和71μL无核酸酶水。反应体系中先加入NEBuffer2.1、Lba[0261]Ro_cp_herb、Rp_cp_herb和Rt_cp_herb组结果见图9，Ro_cp组中，使用Ro_cp_果说明基于CRISPR/Cas12a系统的时珍法能准确快速地鉴例1中已经获得，本实施例直接使用Ro_cp_crRNA1、Rp_cp_crRNA1和Rt_cp_crRNA1作为PlantGenomicDNAKit使用说明书提取基因组DNA。用0.8％琼脂糖凝胶电泳