食品微生物检测作业指导书

食品微生物检测作业指导书1适用范围本指导书适用于预包装食品、食用农产品、餐饮食品、食品添加剂等品类的微生物指标检测，涵盖菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌5项常规及风险监测指标的采样、检测、结果判定与全流程质量控制，可作为食品生产企业自检、第三方检测机构、市场监管部门抽检的作业依据。涉及特殊食品（如婴幼儿配方食品、保健食品）的特殊微生物指标检测，需结合对应产品标准补充操作要求。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1-2022食品安全国家标准食品微生物学检验总则

GB4789.2-2022食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定

GB4789.3-2022食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数

GB4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验

GB4789.10-2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验

GB4789.40-2016食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验

GB2726-2016食品安全国家标准熟肉制品

GB2762-2022食品安全国家标准食品中污染物限量

GB14881-2013食品安全国家标准食品生产通用卫生规范

GB/T27405-2008实验室质量控制规范食品微生物检测

—3术语和定义3.1菌落总数：指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（或每mL、每cm²）检样中形成的微生物菌落总数。3.2大肠菌群：指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，是食品粪便污染的指示菌。3.3定量限：指检测方法能够对样品中待测物准确定量的最低浓度或含量，本指导书中菌落总数定量限为10CFU/g（mL），大肠菌群MPN法定量限为3.0MPN/100g（mL）。3.4无菌操作：指在微生物检测过程中，防止待检样品被外部微生物污染、同时防止待检样品中的病原微生物污染环境和操作人员的操作规范。4实验室环境与设备要求4.1环境要求4.1.1微生物检测区域需独立设置，与化学分析、样品前处理等物理隔离，整体采用负压设计，换气次数不低于15次/小时，空气洁净度需满足：无菌室/生物安全柜静态下100级（尘埃粒子≥0.5μm的浓度≤3520个/m³），缓冲间、样品制备区万级（尘埃粒子≥0.5μm的浓度≤352000个/m³）。4.1.2各区域实行明确的标识管理，按“试剂储存区→样品制备区→微生物培养区→菌种鉴定区→高压灭菌区→废弃物处理区”的单向流程排布，避免交叉污染。各区域专用工作服颜色不同，不得跨区域穿戴。4.1.3区域温湿度控制：试剂储存区温度2-8℃（培养基储存）、-20℃（标准菌株储存）；样品制备区温度18-26℃，相对湿度45%-65%；培养箱温度波动范围≤±0.5℃，恒温水浴箱温度波动≤±0.2℃。

4.1.4环境消毒要求：每次实验前后，采用0.2%（w/v）含氯消毒剂擦拭台面、地面，采用紫外灯照射30min进行空气消毒，紫外灯强度每季度校准一次，照射强度不得低于70μW/cm²（距离1m处检测），累计使用时长不超过1000小时。每月对无菌室、生物安全柜进行沉降菌检测，沉降菌浓度≤1CFU/皿（φ90mm平皿，暴露30min，36℃培养48h）。

#4.2设备与耗材要求

4.2.1计量类设备：电子天平精度等级0.01g、0.001g各1台，每年由法定计量机构校准1次，每次使用前进行水平校准；移液器量程覆盖10μL-10mL，每半年校准1次，误差允许范围：≤10μL不超过±2.0%，100μL-1mL不超过±1.0%，≥5mL不超过±0.5%；高压灭菌锅自带温度/压力校准装置，每季度验证灭菌效果，采用生物指示剂（嗜热脂肪芽胞杆菌ATCC7953）验证，灭菌后指示剂培养无菌生长为合格。

4.2.2培养类设备：生化培养箱、二氧化碳培养箱（用于特殊菌株培养）需每天记录温度，偏差超过±0.5℃时需及时校准；厌氧培养装置每次使用前采用厌氧指示剂验证厌氧环境，亚甲蓝指示剂不变色为合格。4.2.3耗材要求：一次性塑料平皿、移液枪头、均质袋需经环氧乙烷或γ射线灭菌，包装完好且在保质期内使用；玻璃器皿（锥形瓶、试管、移液管）使用前经121℃高压灭菌20min，干燥后备用，灭菌后存放时间不超过7天。5试剂与培养基制备5.1试剂要求检测所用试剂均为分析纯及以上级别，生化鉴定试剂、显色培养基需有第三方质量验证报告，标准菌株采用中国医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）或美国典型培养物保藏中心（ATCC）提供的标准菌株，实验用水为符合GB/T6682规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃）。5.2培养基制备与质量控制5.2.1制备流程：严格按照培养基说明书称取干粉，加入定量无菌水，搅拌均匀后加热溶解，避免过度煮沸导致成分破坏。调整pH值至说明书要求范围±0.2，分装至对应容器后灭菌：含糖培养基115℃高压灭菌15min，不含糖通用培养基121℃高压灭菌20min，不耐热成分（如抗生素、维生素）采用0.22μm滤膜过滤除菌后，待培养基冷却至45-50℃时无菌加入。

5.2.2质量验证：每批次制备的培养基需做无菌验证和生长率验证：①无菌验证：取3个平皿倾注待检培养基，36℃培养72h无菌落生长为合格；②生长率验证：接种对应的标准菌株，菌落生长率≥70%（与商品化质控培养基对比），典型菌落特征符合要求为合格。

5.2.3储存要求：制备好的培养基2-8℃避光保存，平板培养基保存不超过7天，液体培养基保存不超过14天，使用前观察是否有沉淀、变色、污染，异常培养基不得使用。

5.2.4常用培养基清单及用途：培养基名称用途培养条件平板计数琼脂（PCA）菌落总数测定36℃±1℃，48h±2h月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）大肠菌群初发酵36℃±1℃，24h±2h煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）大肠菌群复发酵36℃±1℃，48h±2h亚硫酸铋琼脂（BS）、XLD琼脂沙门氏菌分离36℃±1℃，24-48h贝尔德-帕克（Baird-Parker）琼脂金黄色葡萄球菌分离36℃±1℃，24-48h显色阪崎肠杆菌琼脂阪崎肠杆菌分离36℃±1℃，24h±2h6样品采集与流转6.1采样要求6.1.1采样人员需穿戴无菌工作服、口罩、手套，所有采样工具（采样勺、剪刀、镊子、样品容器）经高压灭菌处理，每采集一份样品更换一套采样工具，避免交叉污染。6.1.2采样量：同一批次样品采样量不少于3份独立包装，总量不少于500g（mL），对于预包装食品需采集完整未开封的产品，保留原始包装标识；食用农产品从不同部位取样，充分混匀后分装为3份，每份不少于150g；餐饮食品即食类样品直接采集待售成品，每份不少于100g。6.1.3采样记录：需详细记录样品名称、规格、批号/生产日期、生产单位、采样地点、采样时间、采样人、储存条件、样品状态（是否破损、胀袋、变质）等信息，信息不全的样品不得进入检测流程。6.2样品流转与储存6.2.1样品采用无菌密封容器盛装，标注唯一识别编号，冷链运输样品需配备冰袋或保温箱，温度控制在0-4℃，运输时间不超过4小时；冷冻样品运输温度控制在-18℃以下，避免融化。

6.2.2样品接收后，需在24h内启动检测，无法及时检测的样品按标识要求储存：冷藏样品0-4℃储存不超过72h，冷冻样品-18℃储存不超过1个月，且避免反复冻融。检测后剩余样品保留至报告出具后15天，以备复检，特殊样品可根据要求延长保留时间。

—7核心检测项目操作流程7.1菌落总数测定7.1.1样品稀释：无菌称取25g（或25mL）样品，放入装有225mL无菌生理盐水的均质袋中，拍击式均质器均质1-2min，制成1:10的样品匀液，均质过程中温度不超过25℃。用1mL无菌移液器吸取1:10匀液1mL，沿管壁缓慢注入装有9mL无菌生理盐水的试管中，振荡混匀制成1:100的样品匀液，按此方法依次制备10倍递增稀释液，每递增稀释一次更换一次无菌移液器枪头。根据样品预估污染水平，选择2-3个适宜的稀释度，每个稀释度接种2个平行平皿。

7.1.2倾注培养：及时将1mL稀释液加入无菌平皿中，倾注15-20mL冷却至46℃的PCA培养基，转动平皿使样品与培养基充分混匀，同时做空白对照：吸取1mL无菌生理盐水加入平皿，同步倾注培养基。待培养基凝固后翻转平皿，36℃±1℃培养48h±2h；水产品的菌落总数培养温度为30℃±1℃，培养72h±3h。

7.1.3菌落计数：选取菌落数在30-300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，高于300CFU的记录为“多不可计”。若有较大片状菌落生长的平板不宜采用，若片状菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布均匀，可计数半个平板后乘以2代表全皿菌落数。

7.1.4结果计算：①若只有一个稀释度的平板菌落数在30-300CFU之间，计算两个平板菌落数的平均值，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中的菌落总数。

②若有两个连续稀释度的平板菌落数均在30-300CFU之间，按公式计算：

N=∑C(n1+0.1n2)d

其中N为样品中菌落数，∑C为两个适宜稀释度的平板菌落数之和，7.1.5结果表述：菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则保留整数；菌落数大于等于100CFU时，采用两位有效数字，后面的位数采用“四舍五入”原则，也可用10的指数表示。7.2大肠菌群计数（MPN法和平板计数法）7.2.1MPN法（适用于大肠菌群含量较低的样品，如饮用水、消毒后的食品）7.2.1.1稀释步骤同7.1.1，根据样品污染情况选择3个连续稀释度，每个稀释度接种3管LST肉汤，每管接种1mL样品匀液，同时接种3管空白对照（无菌生理盐水）。7.2.1.2初发酵：36℃±1℃培养24h±2h，观察是否有气泡产生，24h未产气的继续培养至48h±2h，产气的LST管判定为初发酵阳性。7.2.1.3复发酵：用接种环从所有初发酵阳性的LST管中取一环培养物，接种到BGLB肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，有气泡产生的判定为大肠菌群阳性。7.2.1.4结果计算：根据阳性管数，查GB4789.3-2022附录中的MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值，结果保留两位有效数字。

##7.2.2平板计数法（适用于大肠菌群含量较高的样品，如生鲜肉、未消毒的半成品）

7.2.2.1样品稀释同7.1.1，选择2-3个适宜稀释度，每个稀释度接种1mL匀液到无菌平皿中，倾注15-20mL冷却至46℃的科玛嘉大肠菌群显色培养基，混匀后待凝固，翻转平皿36℃±1℃培养18-24h。

7.2.2.2计数典型菌落：紫红色/红色、周围有沉淀环的菌落为大肠菌群典型菌落，选取菌落数在10-150CFU之间的平板计数，每个稀释度取两个平板的平均值，乘以稀释倍数即为每g（mL）样品中的大肠菌群数。

7.2.2.3验证：每个平板至少挑取10%的典型菌落接种BGLB肉汤复发酵，阳性率≥90%时无需校正，阳性率<90%时结果乘以阳性率校正。

#7.3沙门氏菌检验

7.3.1前增菌：无菌称取25g（25mL）样品，加入225mL缓冲蛋白胨水（BPW）中，均质后36℃±1℃预增菌18h±2h。7.3.2选择性增菌：轻轻摇动增菌液，分别移取1mLBPW培养物接种到10mL亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液和10mL四硫磺酸盐煌绿（TTB）增菌液中，SC增菌液36℃±1℃培养18-24h，TTB增菌液42℃±1℃培养18-24h。

7.3.3分离培养：分别从SC和TTB增菌液中取一环培养物，划线接种到BS琼脂、XLD琼脂和科玛嘉沙门氏菌显色平板上，BS平板36℃±1℃培养40-48h，XLD和显色平板36℃±1℃培养18-24h。典型菌落特征：BS平板上菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；XLD平板上菌落呈红色，中心有黑色沉淀或无黑色沉淀；显色平板上菌落呈紫色或紫红色。

7.3.4生化鉴定：每个平板至少挑取2-3个典型菌落，分别接种三糖铁琼脂（TSI）斜面，36℃±1℃培养18-24h。TSI初步筛选标准：斜面红色/底层黄色，有或无硫化氢（黑色）、有或无产气，判定为可疑沙门氏菌。对可疑菌株进一步做生化试验：尿素酶试验阴性、动力试验阳性、赖氨酸脱羧酶试验阳性、靛基质试验阴性、氰化钾试验阴性，符合特征的判定为沙门氏菌生化阳性。

7.3.5血清学鉴定：将生化阳性菌株制备成浓菌悬液，与沙门氏菌多价O血清、多价H血清进行玻片凝集试验，1min内出现肉眼可见的凝集颗粒、阴性对照无凝集的，判定为沙门氏菌阳性。7.3.6结果25g（25mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。7.4金黄色葡萄球菌检验7.4.1定性检验：①增菌：称取25g（25mL）样品加入225mL7.5%氯化钠肉汤中，均质后36℃±1℃培养18-24h。

②分离：取增菌液划线接种Baird-Parker平板，36℃±1℃培养24-48h，典型菌落为圆形、光滑凸起、呈灰色到黑色、边缘色淡、周围有一浑浊带和透明圈。

③鉴定：挑取典型菌落做革兰氏染色（革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列）、血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆加入试管，加入1mL可疑菌株的24h脑心浸液肉汤培养物，36℃±1℃培养6h，每30min观察一次，血浆凝固的判定为阳性。④结果25g（25mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。7.4.2平板计数法：①样品稀释同7.1.1，选择2-3个稀释度，每个稀释度取0.1mL涂布到Baird-Parker平板上，每个稀释度做两个平行，36℃±1℃培养24-48h。

②计数典型菌落，选取菌落数在10-100CFU之间的平板，每个平板至少挑取1个典型菌落做血浆凝固酶试验，计算阳性菌落占比。

③结果计算：两个平板的平均菌落数×阳性率×稀释倍数×10，即为每g（mL）样品中的金黄色葡萄球菌数，结果保留两位有效数字。7.5阪崎肠杆菌检验（适用于婴幼儿配方食品、粉状婴幼儿辅食）7.5.1前增菌：无菌称取100g（100mL）样品，加入900mL预热至45℃的缓冲蛋白胨水中，均质后36℃±1℃预增菌18h±2h。7.5.2选择性增菌：移取1mL预增菌液接种到10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（mLST-Vm）中，44℃±0.5℃培养24h±2h。7.5.3分离培养：取增菌液划线接种阪崎肠杆菌显色平板，36℃±1℃培养24h±2h，典型菌落为蓝绿色或蓝灰色。7.5.4生化鉴定：挑取典型菌落接种TSI斜面、氧化酶试验、α-葡萄糖苷酶试验，TSI斜面黄色/底层黄色、氧化酶阴性、α-葡萄糖苷酶试验阳性的判定为可疑菌株，进一步做生化确认：鸟氨酸脱羧酶阳性、精氨酸双水解酶阳性、山梨醇发酵阴性、柠檬酸盐利用阳性。7.5.5结果100g（100mL）样品中检出或未检出阪崎肠杆菌。8质量控制要求8.1人员要求检测人员需经过食品微生物检测专业培训，考核合格后持证上岗，每年至少参加1次实验室间比对或能力验证，结果满意方可继续从事检测工作。新员工上岗前需经过不少于3个月的操作实训，通过标准菌株检测、盲样考核合格后方可独立操作。8.2过程质量控制8.2.1每批次检测必须设置空白对照：包括试剂空白、培养基空白、环境空白，空白对照不得有阳性结果，否则批次结果无效，需重新检测。8.2.2每20份样品或每批次样品（不足20份时）设置1份阳性对照和1份阴性对照：阳性对照采用对应指标的低浓度标准菌株（如沙门氏菌CMCC(B)50094、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003），检测结果应为阳性；阴性对照采用无菌样品，检测结果应为阴性。对照结果不符合要求