DB50-T20362026羊化脓隐秘杆菌病诊断技术规程（标准文本）

ICSCCSBDB50 DB50/T2036— 发DB50/T2036— 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定DB50/TDB50/T2036—DB50/TDB50/T2036—GB/T6682GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T27401实验室质量控制规范兽医学检测NY/T541NY/T1948羊化脓隐秘杆菌病trueperellapyogenesdiseaseinBSL‑2NY/T1948GB/T274011图16.36.4出现6.3.6所列非典型临床症状。NY/T541未破溃脓肿经剪毛、0.53mL～5mL；已破溃脓肿采集深部脓汁或脓肿3cm～5cm3～5弃去前三把奶，乳头消毒（0.1）5mL～10mL1mL～2mL3mL～5mL1cm³6h253h12h412h运输到实验室的样本，应在-20℃以下冷冻后冷藏运输。若需长期保存，应置-70℃超低温冰箱。5%～10TSA平板（或哥伦比亚绵羊血琼脂平板），37℃培养24h～48h。ATSA1mmβ溶血环。在普通琼脂平板（TSA）上生长不良或不照GB/T14926.43。PCRDNA上游引物（plo-F）5'-TTGATAACGGTCCACCACGG-3'；下游引物（plo-R）：5'-CACTGCCACGACCTA20μL体系含2×TaqPCRMasterMix10μL，plo‑F、plo‑R引物（10μmol/L）各0.5μL，DNA模板1μL，用灭菌水补足至20μL。942min；9430s，6030s，7215s30723minPCR1.2120V30min264bp264bp判为阳性，无条带判为阴性。PCR产物电泳图谱见附录B。PCR20μL2×ProbeqPCRMix10μL，上、下游引物（10μmol/L）0.4μL，探针（10μmol/L）0.8μL7.4μL，DNA1μL。设阴性对照（无菌水）和阳性对照（已知阳性DNA），500r/min离心30s。9530s；955s，6030s，4060试验有效条件：阴性对照无Ct值且无扩增曲线；阳性对照Ct30.0且出现典型扩增曲线。结果判定：待检样品Ct35.0且出现典型扩增曲线，判为阳性；否则判为阴性。扩增曲线见C酶联免疫吸附试验（ELISA）D待检血清应清亮、无溶血、无污染。5630min20rPLOErPLO2μg/mL100μL/孔包被酶标板，4PBST33min200μL372h1h3（7.5.4）HRPIgG100μL/孔，3740min～60minTMB100μL10min50μL450nm（OD₄₅₀）15min试验有效条件：阳性对照OD₄₅ ≥1.0，阴性对照OD₄₅ ＜0.7计算S/P值：S/P=(样品OD₄₅₀ -阴性对照OD₄₅₀)/(阳性对照OD₄₅₀ -阴性对照OD₄₅₀)。结果判定：S/P0.6S/P0.50.5S/P0.6重新检测；重测结果如果S/P值小于0.5，则样品应判定为阴性。ELISA采用本文件规定的阳性对照和阴性对照进行测试，其OD₄₅ 值及S/P值判定结果应符7.5.9PCRPCRELISA2附录A.1TSA注：β注：菌体为革兰氏阳性（紫色）V附录PCRploPCRB.1M2000bpDNA分子质量标准

B.1化脓隐秘杆菌ploPCR附录PCRPCRC.1 附录GB/T6682PBS（pH7.4）：8.0g0.2g0.2g1.44g，加超纯水定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，室温保存。PBST1000mLPBS0.5mLTween-201ELISA（碳酸盐缓冲液，pH9.6）：1.59g2.93g800mL超纯水，调节pH至9.4~9.6，定容至1000mL，现配现用，使用前经0.22μm滤膜过滤。封闭液（2BSA-PBST）2.0g（BSA）100mLPBST4保存，有效期7d。底物液（TMB）TMB终止液（2mol/L）：111mL889mL附录以化脓隐秘杆菌标准菌株（ATCC49698）DNAplo28～534将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）菌株，经IPTG诱导表达重组蛋白rPLO，培养条件为37℃、180r/min振荡培养4h～6h。E.2，经SDS电泳验证纯度（≥90%）后，-80℃保存备用。M