（正式版）DB34∕T 1535-2011 《乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定 液相色谱-串联质谱法》

乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定液相色谱-串联质谱法2011-12-15实施2011-12-15实施I本标准起草单位：国家农副加工食品质量监督检验中心、安徽国家农业标准化与监测中心。本标准主要起草人：顾亮、徐彦辉、丁磊、陶运来、罗亮、王苏红、刘坤、彭涛。乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定液相色谱-串联质谱法本标准规定了乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量测定的液相色谱串联质谱检测方法。本标准适用于乳制品中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星残留量的测定。本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。本标准中恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星的检测限均为0.50μg/kg。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3原理用0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲液(pH=4.0)提取乳制品中的喹诺酮类抗生素，经离心后，上清液经HLB固相萃取柱净化；高效液相色谱-串联质谱测定，阴性样品基质加标工作曲线外标法定量。4.1甲醇：色谱纯。4.2乙腈：色谱纯。4.3甲酸：色谱纯。4.5磷酸氢二钠。4.7氢氧化钠。4.9磷酸氢二钠溶液(0.2mol/L):称取71.63g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。4.11Mcllvaine缓冲液：将1000mL0.1mol/L柠檬酸溶液(4.10)与625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(4.9)混合，用盐酸或氢氧化钠调节pH至4.0±0.05。4.12EDTA-Mcllvaine缓冲液(0.1mol/L):称取60.5g乙二胺四乙酸二钠(4.8)放入1625mLMcllvaine缓冲液(4.11)中，振摇使其溶解。4.13甲醇水溶液：5%(体积分数)。工2DB34/T1535—20114.14甲酸水溶液：0.1%(体积分数)。4.15标准品：恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星(纯度≥98%)。4.16标准储备液(1.0mg/mL):称取0.01g恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星标准品，用甲醇溶解并分别定容至10.0mL棕色容量瓶中。-18℃避光冷冻保存，保存期为三个月。4.17混合标准储备液(10μg/mL):吸取适量恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星标准储备溶液(4.16),用甲醇配成混合标准溶液。各组分浓度为10μg/mL4.18HLB固相萃取柱(200mg,6mL)或其它等效柱。5仪器和设备5.4高速冷冻离心机(转速10000r/min)。5.6酸度计。6测定步骤称取约5.0g(精确至0.01g)试样于50mL聚丙烯离心管中，加入40.0mL0.1mol/LEDTA-Mcllvaine缓冲液(4.12),漩涡混匀，超声提取10min,10000r/min离心5min(温度低于5℃),取上清液(上清液若除脂不完全，可加5mL正己烷除脂，离心分层取下层清液过柱)。6.2净化HLB固相萃取柱(200mg,6mL),使用前依次用6mL甲醇、6mL水活化。将6.1提取的溶液以2～3mL/min的速度过柱，弃去滤液，用2mL5%甲醇水溶液(4.13)淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用6mL甲醇洗脱并收集洗脱液。洗脱液用氮气吹干后，用1mL初始流动相溶液溶解定容，将混合标准工作液(4.17)用初始流动相逐级稀释成2.5μg/L～200.0μg/L的标准系列溶液。称取与试样基质相应的阴性样品5.0g,按照6.1、6.2与试样同时进行提取和净化，用系列标准溶液定容至1.0mL。6.4.1色谱条件a)色谱柱：ZorbaxSBC18柱(2.1mm×100mm,1.8μm)或相当者；d)流速：0.3mL/min;3DB34/T1535—2011e)流动相：流动相A(0.1%甲酸)+流动相B(乙腈),参考梯度条件见表1。时间(min)流速(μL/min)流动相A(0.1%甲酸)流动相B(乙腈)0556556.4.2质谱条件a)离子源：电喷雾离子源(ESI);e)喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；名称母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞电压(V)碰撞能量(V)恩诺沙星316.1麻保沙星363.25二氟沙星400.2382.1356.16.4.3液相色谱-串联质谱测定6.4.3.1定性测定各检测目标化合物以保留时间和两对离子的(特征离子对/定量离子对)所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致(偏差±0.5%),同时要求被测试样中目标化合物的两对离子丰度比与标准溶液中目标化合物的丰度比一致，相对丰度>50%、20～50%、10～20%、<10%时，允许偏差分别为±20%、±25%、±6.4.3.2定量分析本标准采用外标校准曲线法定量测定。以恩诺沙星、麻保沙星、二氟沙星的标准溶液浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标，作校准曲线线性回归方程，以试样的峰面积与标准曲线比较定量。4测定结果按式(1)计算：麻保沙星、二氟沙星的回收率范围为70%～115%,相对标准偏差小于10%。9.2精密度55-总离子流图z104+MF(400.20001->356.10156)std.d5-二氟沙星提取离子流图z104+NEM(400.20001->382.10156)std.d二氟沙星提取离子流图0z104+MEM(363.20001->320.00000)std.d麻保沙星提取离子流图5-0z104麻保沙星提取离子流图+MF〔360.00000->245.00